多囊卵巢綜合征相關microRNAs的研究進展

張珊，陳歡歡，張磊，崔趁趁，張翠蓮*

(1.新鄉醫學院河南省人民醫院，鄭州 450003；2.河南省人民醫院生殖中心，鄭州 450003；3.河南省生殖醫學工程國際聯合實驗室，鄭州 450003)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女中較常見的生殖內分泌疾病。據統計，全球范圍內PCOS的患病率約為5%～10%[1]。PCOS常見特征是雄激素過多、月經紊亂、排卵功能障礙、卵巢多囊樣改變，它是一種具有復雜病理特征的異質性綜合征疾病，不僅與不孕癥有關，還與代謝紊亂密不可分，可伴有胰島素抵抗(IR)、糖尿病、肥胖和心血管疾病等[2]，同時也是子宮內膜癌致病的高危因素[3]。目前已知遺傳、環境、生活方式和心理(慢性焦慮和抑郁)等因素參與PCOS的發生發展，但其內在的分子機制尚不清楚[4]。

microRNAs(miRNAs)是一種小的單鏈非編碼RNA，大小在19～25個核苷酸之間，在轉錄后調節基因表達，可以調節靶基因的轉錄沉默；一個miRNA可以靶向數百個mRNAs，可同時影響某些特定途徑上關聯基因的表達[5]。研究表明，miRNAs序列具有高度保守性，有助于調節不同生物體的多種生物學功能，如細胞凋亡、增殖、分化、發育、細胞周期、干細胞維持、代謝和造血等[6]。多項研究發現，其異常表達與多種疾病有關，如癌癥[7]、自身免疫性疾病[8]、不孕癥[9-10]等。miRNAs在幾乎所有細胞中都發揮著關鍵性作用。研究發現，在人前脂肪細胞和分化的脂肪細胞中都存在不同的miRNA，特定的miRNA參與脂肪細胞的分化、脂肪代謝和胰島素敏感性[11]。miRNAs在生物合成過程中，可以釋放到細胞間隙，所以在血液、尿液、精液、卵泡液[12-15]等多種體液中可被檢測。miRNAs不僅在各種體液中表現出顯著的穩定性，還可以反映卵母細胞和卵泡壁的分泌及代謝活動[16]。大量研究表明，miRNAs與PCOS的發生發展有著密切的聯系。本文將對PCOS相關差異表達miRNAs的研究進展作一綜述。

一、miRNAs在PCOS患者血清中的異常表達

miRNAs在各種組織中的異常表達參與多種疾病的發生發展，其中血清中miRNAs的表達水平在同一物種中是相對穩定的[17]。Long等[6]通過對血清樣本進行測序，篩選出不同組分間差異表達的miRNAs，經逆轉錄-定量PCR(qRT-PCR)方法檢測出PCOS患者血清中miR-222、miR-146a和miR-30c的表達量顯著增多；通過相關性分析顯示miR-222與血清胰島素水平呈正相關，miR-146a與血清睪酮值呈負相關；使用DIANA-mirPath計算工具識別出上述miRNAs靶基因參與轉移、細胞周期、凋亡和內分泌通路，如Wnt信號通路、MAPK信號通路、Jak-STAT信號通路等。Nanda等[18]采用qRT-PCR方法檢測了血清中miR-24、miR-29a和miR-502-3p的表達情況，與對照組相比，PCOS受試者血清中miR-24水平顯著下調，miR-24與體質量指數(BMI)、血糖、黃體生成素(LH)、胰島素、空腹胰島素抵抗指數(FIRI)、穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR)、睪酮、甘油三酯(TG)水平及黃體生成素/卵泡刺激素(LH/FSH)比值呈顯著負相關，而高密度脂蛋白(HDL)水平與miR-24呈顯著正相關，miR-24在PCOS的診斷方面具有重要意義。Lin等[19]研究發現，miR-23a在PCOS患者血清中異常低表達，于cov434細胞內轉染miR-23a模擬物及抑制物后，通過流式細胞術檢測發現miR-23a過表達可誘導cov434細胞G0/G1期細胞周期阻滯并促進細胞凋亡，這一過程是miR-23a靶向調節FGD4參與完成的；研究還表明，miR-23a誘導cov434細胞CDC42/PAK-1信號通路的激活，此通路參與調節細胞增殖、凋亡和細胞周期，可能在PCOS患者的生理病理過程中具有重要意義。有研究報道了miR-320在PCOS患者血清中低表達，這一表現在PCOS合并IR的患者中更明顯，Logistic回歸分析顯示miRNA -320表達水平與PCOS獨立相關[20]。

二、miRNAs在PCOS患者血漿中的異常表達

血漿因其成分的特殊性，作為體外樣本時常需要添加抗凝劑，因此限制了其在實驗中的應用，但與血清相比，血漿更能代表患者的體內狀態[21]。Pourteymour Fard Tabrizi等[22]通過生物信息學分析得出miR-27a、miR-130b和miR-301a與PCOS存在相關性，經qRT-PCR方法驗證了PCOS組及對照組患者血漿樣本中3種miRNAs的差異表達，并檢驗其對PCOS發病的敏感性及特異性，指出miR-27a對PCOS的診斷更有價值。近期一項基于全基因組測序結果的研究，分析了PCOS和對照組患者的RAB5B基因的8個位點后，發現rs1045435、rs11550558、rs705700和rs11171718位點的單核苷酸多態性與PCOS風險相關；經qRT-PCR方法檢測了兩組人群血漿中miR-24及miR-320的表達，其中miR-24在PCOS患者血漿中高表達，而miR-320呈現為低表達，并指出rs1045435可能是miR-24的結合位點，rs11550558、rs705700、rs11171718可能為miR-320的結合位點[23]。

三、miRNA在PCOS患者卵泡液中的異常表達

卵泡液為卵母細胞成長發育提供必需的營養物質及微環境，在生殖功能中發揮著重要作用[24-25]。在一項病例對照研究中經高通量測序分析了PCOS組與對照組卵泡液中miRNAs的表達譜，其中miR-29a-3p、miR-151-3p及miR-518f-3p在PCOS組中低表達，miR-29a-3p通過抑制磷酸酯酶和張力蛋白同源物(PTEN)參與調節細胞生長發育，與PCOS患者卵泡生長和卵泡發育受阻相一致；miR-151-3p與總雄激素和游離雄激素水平顯著負相關，并參與多種癌癥的發??；研究中有miRNAs表達不一致的情況，推測由PCOS的異質性、使用不同PCOS診斷標準或種族差異等因素引起[26]。近期Butler等[27]在一項前瞻性隊列研究中，從卵泡液中檢測到176個miRNAs，其中29個miRNAs在PCOS患者和正常對照組中存在顯著差異；PCOS患者卵泡液中miR-382-5p與年齡和游離雄激素水平相關，miR-199b-5p與抗苗勒管激素(AMH)水平相關，miR-93-3p與C反應蛋白相關。

四、miRNA在 PCOS患者壁層顆粒細胞中的異常表達

卵母細胞和其周圍的顆粒細胞(GCs)是相互依存的，PCOS患者GCs存在增殖減少、凋亡增加、激素分泌紊亂等病理現象，與卵泡發育異常密切相關[28-29]。Fu等[30]研究發現，PCOS患者卵巢皮質和血清中miR-16表達下調，miR-16過表達后通過靶向程序性細胞死亡蛋白4(PDCD4)以促進GCs細胞生長和抑制細胞凋亡；睪酮使miR-16表達下調和PDCD4表達上調，可抑制GCs生長和促進凋亡。Sun等[31]研究發現，PCOS患者GCs中miR-204表達下調，通過miR-204模擬物或抑制物轉染KGN細胞來實現miR-204的過表達和表達的敲降，經流式細胞術分析KGN細胞的細胞周期情況，證實了miR-204對KGN細胞G2/M期阻滯和誘導凋亡的重要作用；并且miR-204與翻譯控制的腫瘤蛋白(TPT1)直接作用，通過直接靶向和降解KGN細胞中的TPT1來抑制細胞增殖。He等[32]通過qRT-PCR方法檢測出PCOS患者GCs中miR-200b表達上調；向KGN細胞內轉染miR-200b和miR-200c模擬物以實現過表達，CCK-8結果顯示兩者表達上調均可抑制KGN細胞增殖；qRT-PCR和蛋白免疫印記檢測證實PTEN是KGN細胞中miR-200b和miR-200c的直接靶點；si-PTEN在轉染48 h后顯著降低了KGN細胞中PTEN mRNA及蛋白的水平，CCK-8結果顯示PTEN下調顯著抑制KGN細胞的增殖，這為PCOS患者GCs異常增殖提供相關分子證據。

五、miRNA在 PCOS患者卵丘顆粒細胞中的異常表達

Shi等[33]取PCOS及對照組患者成熟卵母細胞后機械剝離收集卵丘顆粒細胞(CCs)樣本，通過miRNA微陣列測序技術檢測miRNAs的差異表達，篩選出有顯著差異的miR-483-5p和miR-486-5p，qRT-PCR方法驗證了其在PCOS患者CCs中的低表達，與miRNA芯片檢測結果一致；使用生物信息學分析預測靶基因，并行qRT-PCR方法檢測，結果顯示與對照組相比，SOCS3、SRF、PTEN、FOXO1在PCOS患者CCs中表達上調；miR-483-5p作為編碼在IGF2的第二個內含子中的保守序列，故IGF2在PCOS患者CCs中同樣表達下調；利用DAVID工具對相關靶基因進行KEGG通路富集分析，最終miR-483被認定在改善IR中起重要作用，miR-486-5p可能通過激活PI3K/Akt信號通路促進CCs的增殖。張慧敏等[34]利用生物信息學方法預測了miR-1270的靶基因，再通過KEGG富集信號通路選定卵巢類固醇激素生成途徑上的限速酶細胞色素P450 19A1(CYP19A1)為目標靶基因；收集了PCOS與非PCOS不孕患者的CCs，qRT-PCR方法檢測了兩者在組間的表達，結果顯示miR-1270在PCOS患者CCs中表達量降低，CYP19A1的表達量升高；向KGN細胞內轉染miR-1270的模擬物及抑制劑后進行雙熒光素酶報告基因檢測及蛋白質印跡實驗，證實了兩者的靶向關系，在KGN細胞培養基中檢測到雌二醇(E2)的水平差異。miR-1270對CYP19A1的負性調控影響PCOS患者CCs中E2的生成。

六、miRNA在PCOS患者(血清/血漿/卵泡液)外泌體中的異常表達

研究發現，攜帶大量生物活性物質(包括調節性RNA)的外泌體可被鄰近細胞吸收或進入循環系統，并到達遙遠的部位影響受體細胞的生物行為。外泌體傳遞到受體細胞的mRNA可以被翻譯成蛋白質，被認為是細胞-細胞通訊的重要介質[35-36]。王潔等[37]提取了PCOS與非PCOS患者血清中外泌體，經高通量測序技術檢測到差異表達miRNAs共有 243 個，其中表達上調有115個、下調128個，對10個差異顯著miRNAs進行了qRT-PCR檢測，其中miR-378d、miR-378b、miR-4772-3p在PCOS患者血清外泌體中表達上調，miR-5090、miR-3680-3p、miR-6836-5p表達下調；將PCOS患者血清外泌體差異表達miRNAs進行GO富集分析及KEGG功能注釋，結果顯示這些差異表達miRNAs與類固醇激素的合成有關，可參與調節胰島素信號受體通路。Jiang等[38]收集了PCOS與對照組患者血漿進行了外泌體miRNA測序分析，根據測序結果選取差異顯著的miRNAs，通過GO分析和KEGG通路富集顯示差異表達的miRNAs主要富集在軸突導向、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導、胞吞作用、晝夜節律和癌癥等途徑；其中miR-20b-5p、miR-106a-5p及 miR-18a-3p表達上調，miR-126-3p和miR-146a-5p表達下調，將這5種miRNAs與PCOS表型進行相關性分析，顯示miR-20b-5p、miR-106a-5p和miR-18a-3p的表達與血漿睪酮水平呈負相關，miR-18a-3p與竇卵泡計數(AFC)、AMH濃度、LH水平和LH/FSH比值也呈負相關，而miR-146a-5p和miR-126-3p的表達與AFC和AMH濃度呈正相關。這些差異表達的血漿外泌體miRNAs有助于PCOS的診斷及致病風險性預測。Yuan等[39]使用差速離心法提取了 PCOS與對照組患者卵泡液外泌體，通過測序技術發現25個miRNAs存在組間差異，miRNA譜的改變與IR、細胞生長和增殖、細胞衰老和胰島素信號通路等相關聯；篩選出miR-424-5p作為研究靶標，通過qRT-PCR檢測方法發現miR-424-5p均在PCOS患者卵泡液外泌體和原代GCs中低表達，miR-424-5p可促進GCs衰老并抑制細胞增殖，在轉染miR-424-5p模擬物的KGN細胞中觀察到同樣的結果；對miR-424-5p的靶基因進行預測，確定為細胞分裂周期相關4(CDCA4)基因，雙熒光素酶報告檢測結果表明外泌體miR-424-5p通過阻斷CDCA4介導的Rb/E2F1信號，抑制GCs增殖并誘導PCOS細胞衰老。Cui等[40]為了研究PCOS和非PCOS患者的卵泡液、血清中外泌體miRNAs表達譜，通過miRNA探針微陣列技術及測序結果選取異常表達的miRNA進行qRT-PCR驗證，發現其中7個miRNAs(miR-15b-5p、miR-34a-5p、miR-3148、miR-3646、 miR-3976、 miR-4271、 miR-4481)在PCOS患者卵泡液中顯著高表達，對這些miRNAs的靶基因進行GO分析和KEGG通路富集，顯示它們參與MAPK信號通路和卵母細胞減數分裂。Zhang等[41]通過測序及序列技術顯示PCOS患者血清外泌體中差異表達miRNAs有54個，使用qRT-PCR方法測量這些miRNAs的表達情況，其中miR-1299和miR-6818-5p表達顯著上調，miR-1925p和miR-145-5p表達顯著下調；通過GO分析和KEGG通路富集探究這些差異miRNAs靶基因的分子生物學功能及基因通路，發現它們主要參與軸突導向、腫瘤通路和MAPK信號通路等，認為外泌體miRNAs有望成為PCOS臨床診斷的新型分子生物標志物。

以上為多種miRNAs在PCOS患者不同體液、組織中的差異表達情況(相關細節總結于表1)，這些研究表明，miRNAs在調控細胞增殖與凋亡、激素合成、卵泡發育障礙及卵母細胞功能等方面起著關鍵性作用。一些miRNAs被證實與PCOS表型相關，對其功能的研究為PCOS的發病機制提供一定的理論基礎，可作為新型非侵入性生物標志物。

表1 PCOS患者體液/組織中差異表達miRNAs匯總

續表

續表

七、小結與展望

綜上所述，miRNAs在血液、卵巢及外泌體中的差異表達對PCOS疾病的診斷、治療及預后等存在特殊的意義。miRNAs可通過調控靶基因在特定的通路中傳遞特殊信息來影響PCOS的發生發展，可為PCOS患者卵泡發育異常和生育力低下等的發病機制提供理論基礎，有望成為生殖領域診斷性標志物和治療靶點。未來期望可以通過對某些特定miRNA的檢測來達到明確PCOS發病機制、治療及改善預后等目標，這一過程需要更多更深入的研究來實現。

所有作者均聲明不存在利益沖突。