淫羊藿苷對模擬高原環境下雄性大鼠生殖系統損傷的保護作用研究

張喜艷，柏鑫，閻一鑫，陳克明，王玲*

(1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四○醫院生殖醫學中心，蘭州 730050；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四○醫院基礎醫學實驗室，蘭州 730050；3.甘肅中醫藥大學，蘭州 730030；4.甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室，蘭州 730050)

淫羊藿苷是傳統中藥淫羊藿的主要活性成分，具有廣泛的藥理和生物活性，包括抗炎、抗抑郁、抗腫瘤活性、抗氧化作用、雌激素活性、心血管保護、促進骨愈合和神經保護、免疫調節和改善性功能[1]。淫羊藿作為治療男性生殖功能障礙的傳統中藥已有數千年的歷史[2]，但很少有研究調查其對生殖功能(如精子發生和睪酮產生)的其他藥理活性或其潛在機制。不孕癥已成為全球公共衛生問題，影響全球約12%～15%的夫婦[3]，在不孕原因中男性因素占50%[4]。男性不育的原因是廣泛的，目前研究表明，缺氧是男性不育的主要原因之一，環境性缺氧和病理性缺氧對男性的精液參數、睪丸功能、生殖激素分泌和妊娠結局均產生不利影響[5]。本研究旨在觀察淫羊藿苷對模擬高原環境下的大鼠出現的生殖損傷的保護作用，以期為淫羊藿苷的臨床藥物開發提供實驗依據。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物：30只12周齡SPF級雄性Wistar大鼠，體重(220±15)g，購自蘭州大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK(甘)2018-0002。

實驗廢棄物及動物尸體等按照《醫療廢物管理條例》要求進行無害化處理，實驗過程嚴格遵守國家科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》，盡可能減少對動物的傷害。實驗得到了聯勤保障部隊第九四○醫院動物倫理委員會的批準。

2.實驗試劑：淫羊藿苷(HI008055298)購自寶雞市辰光生物科技有限公司；丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成科技有限公司；血清睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)的試劑盒購自睿信生物科技有限公司；精子形態學快速染色液及精子活體染色液購自上海索萊寶生物科技有公司。

3.主要儀器：DYC-3070型模擬高原低壓低氧動物實驗艙群(貴州風雷航空軍械)；光學顯微鏡(鳳凰光學)；TG16-WS臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發)；Epoch熒光酶標儀(美國伯騰)。

二、實驗方法

1.動物分組與處理：大鼠適應性喂養1周后，隨機分為平原對照組、高原模型組和淫羊藿苷實驗組，每組10只。平原對照組大鼠飼養于本院SPF級動物實驗中心(海拔1 400 m)，高原模型組和淫羊藿苷實驗組飼養于模擬高原動物實驗艙，以5 m/min的速度上升至海拔6 000 m高度[6]。淫羊藿苷實驗組每天上午9時給予淫羊藿苷100 mg/kg[7]灌胃，連續30 d，其余兩組給予等體積生理鹽水灌胃。在實驗期間，各組大鼠自由攝食飲水，光照時間8：00～20：00，溫度為24℃±1℃。每周稱量所有大鼠體質量。

2.組織取材及處理：干預期滿后各組大鼠禁食水12 h，麻醉后迅速剪開腹腔，暴露腹部內容物，將其推向一側，牽拉精索，引出睪丸和附睪，摘取雙側睪丸和附睪；剔除粘連的血管、脂肪等組織，雙側睪丸組織稱重后將左側睪丸放入4%多聚甲醛溶液中，右側睪丸放入-80℃冰箱中保存待用。將大鼠腹主動脈暴露完全，尋找最佳穿刺點采集血液，室溫下靜置30 min后放入4℃冰箱中冷藏30 min以使血清析出，2 000～2 500 r/min離心20 min，將上清液儲存于2 ml無菌無酶的 EP管中，-20℃保存備用。睪丸指數=睪丸重量/體質量。

3.睪丸組織病理學檢測：取固定于4%多聚甲醛溶液中的左側睪丸組織，常規梯度乙醇脫水、二甲苯處理、石蠟包埋、切片以及HE染色處理。

4.精子懸液指標及精子質量評估：取雙側附睪置于生理鹽水中，剪碎并待精子釋放制備成精子懸液。取一滴精子懸液滴入載玻片，計數每毫升懸液中精子濃度(107/ml)，并在40倍鏡下觀察，計數200個精子，依精子活動狀態分為前向運動(PR)、非前向運動(NP)、及不活動(IM)。精子活動率(%)=(PR+NP)/(PR+NP+IM)。取精子懸液于載玻片涂片后進行Diff-Quik染色，于100倍鏡下觀察，計數畸形的精子(頭部畸形、尾部畸形、其他形態異常)所占比例，每張涂片計數200個以上的精子。取精子懸液于載玻片涂片后采用伊紅-苯胺黑染液染色，于100倍鏡下觀察，計數染色精子和非染色精子(染色為死精子，非染色精子為活精子)，每張涂片計數200個以上的精子。

5.睪丸組織氧化應激指標測定：取右側睪丸組織，按照1∶9的質量比例加入低溫生理鹽水后機械勻漿，4℃條件下3 500 r/min離心10 min，取上清，按照試劑盒說明書進行SOD活力和MDA水平測定。

6.生殖激素檢測：使用酶聯免疫分析法(ELISA)測定大鼠血清T、LH、FSH含量，具體操作按試劑盒說明書要求進行。

三、統計學方法

結 果

一、各組大鼠的一般情況比較

與平原對照組相比，高原模型組與淫羊藿苷實驗組體重均顯著下降(P<0.05)，而淫羊藿苷實驗組與高原模型組體重無顯著性差異(P>0.05)；高原模型組睪丸指數顯著低于平原對照組與淫羊藿苷實驗組(P<0.05)，而淫羊藿苷實驗組的睪丸指數與平原對照組無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

A：大鼠體重逐周變化情況；B：各組的睪丸指數。與其他兩組比較，*P<0.05。圖1 各組大鼠體重變化情況及睪丸指數比較

二、各組大鼠睪丸組織的病理學結果

HE染色結果顯示：平原對照組大鼠的睪丸組織形態完好，生精上皮結構完整，由排列有序的各級生精細胞和成熟的支持細胞組成，上皮下的基膜明顯，管腔內精子豐富，間質細胞成群分布于生精小管之間；高原模型組的大鼠睪丸組織結構異常，生精小管管腔不規則，且大小不一，生精上皮有1～2層生精細胞，且結構紊亂，生精細胞變性壞死脫落至管腔，支持細胞可見大量空泡，上皮下基膜變薄甚至斷裂缺失，管腔正常形態結構消失，管腔內空洞化，無可見的長梭形的精子，間質細胞數量減少，充血水腫，且有大量紅細胞；淫羊藿苷實驗組睪丸組織生精小管形態大小較均一，內約有3～4層排列相對規則的各級生精細胞，偶有脫落壞死的生精細胞，支持細胞有數量較少的空泡，基膜較陽性對照組增厚，管腔較規則，內有大量精子，間質細胞較豐富，偶見炎癥細胞(圖2)。

A：平原對照組；B：高原模型組；C：淫羊藿苷實驗組；紅色箭頭示生精細胞。圖2 睪丸組織的病理學結果比較(HE ×200)

三、各組大鼠的附睪精子質量比較

與高原模型相比，平原對照組及淫羊藿苷實驗組的精子數量、精子存活率和精子總活動率均顯著上升(P<0.01)，精子畸形率顯著下降(P<0.01)；平原對照組和淫羊藿苷實驗組間的精子質量參數無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

四、各組大鼠的血清性激素水平比較

與平原對照組相比，高原模型組大鼠血清T、FSH和LH水平均顯著下降(P<0.01)，而淫羊藿苷實驗組的大鼠血清性激素水平無顯著性變化(P>0.05)；與高原模型組相比，淫羊藿苷實驗組的性激素水平均顯著升高(P<0.01)(圖4)。

與其他兩組比較，**P<0.01。圖3 各組大鼠附睪精子質量情況比較

與其他兩組比較，**P<0.01。圖4 各組大鼠的血清性激素水平

五、各組大鼠睪丸氧化應激指標的比較

與平原對照組相比，高原模型組大鼠睪丸組織SOD活性顯著下降(P<0.01)，MDA水平顯著上升(P<0.01)，淫羊藿苷實驗組睪丸組織氧化應激指標無顯著性變化(P>0.05)；與高原模型組相比，淫羊藿苷實驗組睪丸組織水平SOD活性顯著上升(P<0.01)，MDA水平顯著下降(P<0.01)(圖5)。

與其他兩組比較，**P<0.01。圖5 各組大鼠的睪丸組織SOD和MDA的水平

討 論

有研究表明，缺氧暴露環境導致體重下降可能與缺氧暴露能提高身體新陳代謝降低食欲有關[7]。Chen等[8]研究發現，平原環境中淫羊藿苷治療的大鼠體重未發生顯著變化，而本次研究結果顯示模擬高原環境會導致大鼠體重增長緩慢，淫羊藿苷給藥后大鼠的體重無顯著性變化，但淫羊藿苷給藥后能夠使大鼠睪丸指數與平原環境下相近，且顯著高于高原模型組，初步說明淫羊藿苷能夠對大鼠睪丸起到一定的保護作用。

睪酮對于性別分化、維持精子發生和男性第二性征的表達至關重要。有研究表明，睪酮在睪丸的形態發育和生殖功能中都起著重要作用[9]。淫羊藿苷在平原環境中對雄性大鼠生殖系統的相關實驗研究結果表明，成年大鼠口服淫羊藿苷顯著提高睪酮水平，并上調睪丸生成基因的表達，如苯二氮卓類受體和類固醇源性急性調節蛋白，改善雄性大鼠的生殖功能[6]。本實驗研究中發現高原環境中血清睪酮水平、FSH水平、LH水平和精子數量較平原對照組降低，在模擬高原環境中給予淫羊藿苷干預后睪酮水平得到好轉，與常德輝等[10]的研究結果一致。缺氧誘導因子-1(HIF-1)是參與細胞對缺氧反應的關鍵轉錄因子，HIF-1 在男性睪丸組織的生殖細胞中穩定表達。膽固醇是合成睪酮的原料[11]，類固醇急性調節蛋白(StAR)介導的膽固醇轉移是睪酮合成的限速步驟，而StAR 是該過程的限速蛋白[12]。Wang等[13]在HIF-1對StAR轉錄調控以及對睪丸細胞合成和分泌睪酮的影響研究中表明，在缺氧條件下，HIF-1水平升高，機體睪酮分泌量降低，HIF-1對StAR的轉錄抑制是缺氧條件下睪酮減少的一種機制。在另一項研究中發現，淫羊藿苷有影響HIF-1表達的潛力[14]，這為以后進一步研究中藥淫羊藿苷的藥用價值提供新思路。

目前研究表明睪丸組織的過氧化損傷是導致睪丸功能受損的重要原因[15]。MDA水平經常被用作組織氧化應激的關鍵指示指標，它是由自由基對細胞膜成分的損傷造成[16]。SOD酶是對抗氧化應激的重要抗氧化防御指標，在細胞中，SOD酶將超氧陰離子(?O2-)轉化為過氧化氫(H2O2)，進而谷胱甘肽過氧化物酶可以將H2O2分解為水[17]。在本研究中，模擬高原低壓低氧環境致使大鼠睪丸組織SOD酶活性降低，而睪丸組織MDA水平升高；然而，高原模擬環境中淫羊藿苷的干預提高了睪丸組織SOD酶的活性，抑制MDA水平。結果表明，由高原低壓低氧環境引起的睪丸組織的氧化應激在淫羊藿苷的干預下得以減輕，提示淫羊藿苷可能具有針對環境性缺氧所介導的生殖毒性的保護作用，其具體保護機制有待進一步研究。

精子質量是評估男性生育能力的重要指標。成熟且有功能的精子發生于睪丸生精小管并儲存于附睪中，慢性低氧導致睪丸生精上皮空泡化、生殖細胞變形或生成減少，從而導致精子數量減少以及精子畸形率增加，精子存活率下降以及精子活力下降[18]。有研究報道，雄性大鼠給予淫羊藿苷處理增加附睪精子數量且對睪丸組織形態學無不利影響[6]。本研究中，高原環境中淫羊藿苷干預能夠改善雄性大鼠精子質量，且睪丸組織病理學形態趨向正常，淫羊藿苷對模擬高原環境所致雄性生殖系統損傷的保護作用機制可能是通過減輕睪丸組織中氧化應激損傷的途徑保護睪丸生精小管，并且與提高生殖激素水平有關，但所涉及的分子水平機制還有待進一步探討。

綜上所述，高原環境中給予淫羊藿苷干預有逆轉生殖毒性損傷的趨勢，表明淫羊藿苷對持續缺氧環境所導致的生殖系統損傷具有保護作用，可能與淫羊藿苷提高血液中的睪酮濃度及增強抗氧化酶的活性，使睪丸組織生精小管免受缺氧應激損傷有關。但本研究中對相應的具體分子機制及雄性生殖系統細胞和基因水平上的研究有所不足，仍有待進一步研究。