卵巢儲備功能減退患者卵泡液外泌體對小鼠卵母細胞體外成熟的影響

沈開元，楊冠群，羅平，代小麗，黃萍，梁媛媛，李順，陳立群，曲曉力

(柳州市人民醫院生殖醫學科，柳州 545006)

卵巢儲備功能減退(DOR)能夠造成女性生育力下降甚至不孕，因此如何修復、改善女性卵巢儲備提高輔助生殖技術(ART)成功率是亟待解決的重要問題之一。DOR患者生育力低下不僅體現在竇卵泡數的減少，而且卵泡液中活性氧(ROS)增多、卵巢顆粒細胞的異常凋亡、線粒體功能異常等也會影響卵母細胞的成熟和發育潛能[1-3]。外泌體是參與細胞間通訊的膜性囊泡，細胞在正常和病理條件下都能分泌特異的外泌體，卵泡液中同樣存在大量的外泌體。本課題組非常關注DOR患者卵泡液外泌體是否參與調控了卵母細胞發育過程。因此本研究嘗試通過構建小鼠卵母細胞體外成熟模型，觀察卵母細胞成熟的相關指標來探究外泌體對卵母細胞成熟的影響，以期為女性因DOR導致的生育功能降低和不孕癥的診療提供新的科學實驗數據。

材料與方法

一、實驗動物和材料

1.實驗動物：SPF級4～6周齡C57BL/6J未孕雌性小鼠20只，體重25～30 g，購自廣東省醫學實驗動物中心[生產許可證編號：SCXK(粵)2018-0002]。動物購入后在人工控制環境下進行1周的適應性喂養，保持14 h光照/10 h黑暗的光周期，室溫24℃，隨后納入實驗。

2.卵泡液樣本：DOR患者卵泡液收集標準和方法參考之前發表論文所述方法[4]。納入標準：(1)年齡≤35歲，均有排卵證據；(2)月經周期第3天竇卵泡計數(AFC)≤5～7個；(3)抗苗勒管激素(AMH)<0.5～1.1 ng/ml、基礎FSH>10 U/L。以上3項符合2項并排除輸卵管梗阻或男方因素導致不孕的患者納入研究。排除標準：(1)合并有其他女性內外科疾病如多囊卵巢綜合征(PCOS)、高泌乳素血癥和盆腔輸卵管炎癥等；2)存在不良生活習慣(抽煙、酗酒等)和體重超重(體質量指數BMI≥25 kg/m2)的患者。

符合納入標準的患者取卵手術時收集第一管澄清無血染的卵泡液，每3個患者卵泡液樣本合并為一份，均一混合樣本用于外泌體的提取純化。本研究共收集3管上述樣本。所有患者均簽署知情同意書，本研究通過柳州市人民醫院醫學倫理委員會審查[審批號2020(KY-E-18-01)]。

3.主要試劑：外泌體提取純化試劑盒(上海宇玫博生物科技)；孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、M2培養液、透明質酸酶和未成熟卵培養液(南京愛貝生物科技)；Dio細胞膜熒光探針試劑盒(南京凱基生物科技)；RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)、反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)以及熒光定量試劑盒(TB GreenFast qPCR Mix)(Takara，日本)。

4.主要儀器：體視顯微鏡(SMZ745，Nikon，日本)；倒置熒光顯微鏡(T2R，Nikon，日本)；qPCR儀(Lightcycler 480，Roche，瑞士)；酶標儀(VarioskanTMLUX，Thermo，美國)。

二、研究方法

1.未成熟卵母細胞收集及體外成熟培養(IVM)：小鼠腹腔注射PMSG 10 U，46～48 h后頸椎脫臼處死小鼠，75%乙醇消毒小鼠腹部，眼科剪剪開小鼠腹部，只剪取小鼠卵巢并去除周圍脂肪團，分離的卵巢立即轉入M2培養液中清洗，隨即轉入做有數個200 μl M2培養液微滴的培養皿中；在顯微鏡下用1 ml無菌注射器針頭戳破卵巢上的卵泡，用合適直徑的巴氏吸管挑選培養皿底部卵丘顆粒細胞完整、大小均一的卵丘-卵母細胞復合物(COCs)轉入含有不同濃度外泌體的體外成熟培養皿中，進行體外成熟培養；COCs體外培養14～16 h后評估卵母細胞卵丘擴展情況，隨后COCs轉入0.1%透明質酸酶中消化30 s，燒制直徑為100 μm的巴氏吸管將卵母細胞吸出，在M2培養液中吹打掉多余的顆粒細胞，使卵母細胞完全裸露并清洗3次，統計卵母細胞第一極體排出的情況。

2.卵母細胞卵丘擴展指數：參考Vanderhyden等[5]和Fagbohun等[6]提出的方法來評估卵母細胞卵丘擴展情況，卵丘擴展評分標準：0級，卵丘沒有擴展，卵母細胞貼到培養皿底部；1級，只有最外層的1～2層卵丘顆粒細胞擴展；2級，外層的卵丘顆粒細胞呈放射狀擴展，觀察到整個COC較蓬松；3級，放射冠部分不擴展，其余的均擴展；4級，全部卵丘顆粒細胞擴展。卵丘擴展指數=[(0級卵母細胞數×0)+(1級卵母細胞數×1)+(2級卵母細胞數×2)+(3級卵母細胞數×3)+(4級卵母細胞數×4)]/卵母細胞總數。

3.體內成熟小鼠COCs收集方法：在小鼠腹腔注射PSMG 10 U，46～48 h后再次腹腔注射HCG 10 U，16 h后處死小鼠剪取小鼠的輸卵管，在M2培養液中清洗并在顯微鏡觀察下使用1 ml注射器針頭劃破輸卵管膨大的壺腹部讓COCs流出，收集體內成熟COCs使用PBS清洗掉培養液后備用。

4.外泌體攝入驗證實驗：外泌體提取方法同樣參考之前論文所述方法[4]。卵泡液上清離心去除細胞和組織碎片，使用劑盒提取純化后添加PBS進行重懸，并將重懸液分為每管50 μl，-80℃冰箱保存備用。卵泡液外泌體用Dio熒光探針進行染色，參考文獻[7-8]的方法并進行了相應修改，具體步驟如下：50 μl外泌體儲存液中添加工作濃度為1 μg/ml Dio探針，37℃孵育30 min后使用外泌體提取試劑盒的純化柱子，12 000 r/m、4℃離心10 min去除多余的熒光染料；設置含有相同濃度Dio探針的等體積PBS液體為陰性對照組，與外泌體處理組同時進行相應處理；各挑選新鮮的10枚未成熟COCs分別放入含有工作濃度為20 μg/ml Dio標記外泌體和陰性對照PBS的體外成熟培養液微滴(5枚COCs/微滴)中孵育16 h，共孵育在5%CO2、38℃的培養箱中進行；將與外泌體共孵育后COCs轉入4%多聚甲醛中，37℃固定15 min，PBS清洗3次轉入500 μl Hoechst 33342中避光孵育5 min對細胞核進行染色；最后PBS清洗3次，在熒光顯微鏡下觀察COCs攝入外泌體的情況。

5.外泌體處理濃度篩選實驗：卵泡液外泌體使用PBS重懸并純化后，每份外泌體樣本取20 μl并加入20 μl RIRP-PMSF(100∶1)的裂解液，冰上放置20 min后，4℃條件下12 000 r/m離心10 min，取上清液20 μl使用BCA法在酶標儀上測定蛋白濃度；用IVM體外成熟培養液配制外泌體工作液，根據測定的外泌體蛋白濃度，設置不同濃度分組：0、50、100和150 μg/ml 4個濃度處理小鼠未成熟卵母細胞，每組均進行3次生物學重復試驗。根據卵母細胞成熟情況確定外泌體的最佳添加濃度并用于下一步的實驗。

6.研究分組：實驗設置3個組，小鼠體內成熟的COCs為對照組(control)、小鼠COCs體外成熟過程中添加外泌體為添加組(exo+)，COCs體外成熟過程中未添加外泌體設置為未添加組(exo-)。每組每次收集COCs約25～30枚，共3次生物學重復試驗。

7.熒光定量PCR：收集各組成熟后的COCs按照試劑盒的實驗步驟提取總RNA后測濃度并逆轉錄為cDNA作為PCR模板備用。使用熒光定量PCR的方法分別測定卵丘擴展相關基因Has2、Tnfaip6和Ptgs2以及凋亡因子Bax、Bcl2的mRNA相對表達水平，引物詳情見表1。采用兩步法進行PCR反應，擴增條件為：94℃預變性30 s(1個循環)；擴增反應94℃ 5 s，60℃ 10 s(40個循環)。反應結束后使用2-ΔΔCt方法進行相對定量分析，以H2A.Z作為內參基因。

表1 引物序列

三、統計學分析

結 果

一、COCs攝入外泌體驗證試驗

為了驗證COCs能否攝入卵泡液外泌體，我們將標記有Dio染料的外泌體在COCs體外成熟培養過程中共孵育16 h后進行拍照觀察，結果顯示，卵丘顆粒細胞中有Dio熒光信號，而卵母細胞中沒有發現熒光信號，說明卵泡液外泌體能夠被卵丘顆粒細胞攝入(圖1)。

放大圖中白色三角符號示Dio標記的外泌體。圖1 COCs攝入外泌體驗證試驗

二、DOR患者不同濃度卵泡液外泌體對小鼠卵母細胞體外成熟的影響

不同卵丘擴展分級情況如圖2A所示。隨著卵泡液外泌體添加濃度的升高，低卵丘擴展等級的卵母細胞數量逐漸增多(圖2B)；此外添加不同濃度外泌體處理小鼠未成熟COCs 16 h后，各添加組COCs的卵丘擴展指數顯著低于0 μg/ml組(P<0.05)，并且隨著濃度的升高擴展指數逐漸降低(圖2C)。

不同濃度外泌體處理組的GV期卵母細胞百分比均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05)，而MⅡ期卵母細胞百分比均顯著低于0 μg/ml組(P<0.05)。進一步分析發現隨著外泌體濃度的增加，卵母細胞阻滯在GV期的比率呈顯著升高的趨勢，發育至MⅡ期卵母細胞的比率呈顯著降低的趨勢(P<0.05)。當添加濃度達到150 μg/ml，體外成熟后的GV期卵母細胞百分比顯著高于0 μg/ml組，MⅡ期卵母細胞百分比則顯著低于0 μg/ml組(P<0.01)(表2)。因此選擇150 μg/ml作為后續實驗的工作濃度。

A：卵丘擴展級別(a：0級；b：1級；c：2級；d：3級；e：4級)；B：不同濃度外泌體處理組的卵丘擴展狀況；C：不同濃度外泌體處理組的卵丘擴展指數比較。與0 μg/ml組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 卵母細胞體外成熟培養后卵丘擴展級別和卵丘擴展指數

表2 不同濃度卵泡液外泌體處理對卵母細胞體外成熟的影響[n(%)]

三、外泌體對小鼠COC卵丘擴展和細胞凋亡相關基因mRNA表達水平的影響

各組小鼠COCs中卵丘擴展相關基因Has2的mRNA表達水平的差異無統計學意義(P>0.05)；exo+組和exo-組的Tnfaip6、Bcl2和BaxmRNA表達水平均顯著低于control組(P<0.05或P<0.01)，exo+組Ptgs2的mRNA表達水平顯著低于control組(P<0.05)；此外，exo+組Tnfaip6、Ptgs2和Bcl2的mRNA表達水平均顯著低于exo-組(P<0.05或P<0.01)(圖3)。

組間比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 各組小鼠COCs中卵丘擴展和細胞凋亡相關基因mRNA表達水平

討 論

卵巢儲備功能減退患者表現為較少的卵巢儲備和激素低反應，同時也存在卵母細胞發育潛能受損的現象[1，9]。卵泡液含有卵母細胞發育所需的激素、蛋白質以及轉錄因子等，為維持和促進卵母細胞的發育成熟物質交換和信號傳遞的提供微環境。因此研究卵泡液成分的傳遞模式有助于了解影響卵母細胞成熟和發育潛能的調控機制。外泌體作為細胞間信號交流的重要工具，對許多細胞生命活動都起到調控作用。近年來研究發現卵泡液外泌體存在特異表達的非編碼RNA，輔助生殖助孕患者卵泡液外泌體存在可能與卵巢功能異常相關的微小RNA(microRNA，miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)差異表達譜[10-11]。我們之前的研究也發現與卵巢功能正常卵泡液樣本相比，DOR卵泡液中外泌體存在差異miRNA表達譜，這種表達差異也許是影響DOR患者卵母細胞的發育潛能的原因之一[4]。本研究目的是了解DOR患者卵泡液外泌體是否對卵母細胞成熟產生影響，為此我們設計構建小鼠的卵母細胞體外成熟模型，通過與DOR患者卵泡液外泌體共孵育培養來觀察卵母細胞成熟的變化。

卵丘擴展和第一極體排出是卵母細胞核和細胞質成熟的重要標志，并且與卵母細胞的受精能力和發育能力密切相關[12]。在體外環境中卵丘可以在卵泡刺激素(FSH)和表皮生長因子(EGF)的刺激下發生擴展，進而調控卵母細胞的成熟[13]。因此我們選擇卵丘擴展指數作為卵泡成熟的判斷指標來觀察外泌體對卵母細胞成熟的影響。我們首先使用Dio熒光探針標記外泌體后與未成熟COCs共孵育培養，結果證實外泌體能夠被COCs周圍的卵丘顆粒細胞攝取；其次，隨著外泌體濃度的升高，卵丘擴展指數呈現顯著降低的趨勢，同時成熟培養后阻滯在GV期的卵母細胞顯著增多，發育至MⅡ期的卵母細胞顯著減少。這提示我們DOR卵泡液外泌體的加入影響了卵丘的擴展，并阻礙了卵母細胞的核成熟。Hung等[14]認為成熟卵泡的卵泡液外泌體可以支持卵丘顆粒細胞的擴展。臨床研究中也發現PCOS患者和子宮內膜異位癥患者的卵母細胞卵丘擴展能力減低、獲卵數減少[15-16]。據此我們推測DOR患者卵泡液外泌體中含有阻礙卵丘擴展的和卵母細胞成熟的相關因子。

卵丘擴展受到多種酶和細胞因子的調控，其中乙酰透明質酸合酶2(HAS2)、前列腺素合成酶2(PTGS2)和腫瘤壞死因子誘導蛋白6(TNFAIP6)等是卵丘基質形成和卵丘擴展維持的主要調控因子。為了進一步了解DOR卵泡液外泌體是否對卵丘顆粒細胞擴展相關的基因起到抑制作用，我們檢測了與外泌體共孵育COCs中相關基因mRNA表達水平的變化。qPCR的結果發現，與體內成熟的COCs相比，外泌體處理的COCs中Ptgs2和Tnfaip6表達水平均顯著降低。據文獻報道人卵丘顆粒細胞中Has2影響著卵母細胞的發育潛能，Has2表達較高的卵母細胞受精后發育至囊胚的幾率更高，反之則容易阻滯在卵裂胚階段[17]；卵巢組織中過高的Has2表達會通過TGF-β1、VEGF及 NF-κB等信號通路作用造成PCOS大鼠卵巢顆粒細胞增殖失控[18]。Yang等[19]通過生物信息學分析發現PCOS患者卵丘顆粒細胞中Has2表達下調，Has2可能是PCOS導致的排卵障礙潛在的治療靶點和診斷生物標記。我們使用DOR卵泡液外泌體處理小鼠COCs后發現Has2的表達沒有顯著變化，提示外泌體可能沒有攜帶影響Has2的表達調控的因子。Ptgs2、Tnfaip6都是參與維持卵丘顆粒細胞間基質的形成促進卵丘擴展的關鍵分子。相關研究指出，促進Ptgs2和Tnfaip6的表達能夠有效提高體外成熟及隨后的胚胎發育效果[20-22]。子宮內膜異位癥患者的顆粒細胞中Ptgs2的表達與正常對照相比顯著降低，抑制了卵丘擴展從而導致患者獲卵數降低[16]。卵泡液外泌體也參與卵丘擴展的調控，Hung等[14]發現從直徑>9 mm的牛成熟卵泡中提取的卵泡液外泌體能夠促進小鼠和牛體外成熟卵母細胞卵丘擴展和相關基因的表達。我們發現DOR卵泡液外泌體能顯著抑制小鼠COCs中Ptgs2和Tnfaip6基因的表達，這提示外泌體可能攜帶了Ptgs2和Tnfaip6基因的抑制因子從而導致COCs卵丘擴展的缺陷。這可能是卵巢因素相關不孕癥患者卵母細胞成熟度和發育潛能較低的原因之一，具體的調控機制值得我們進一步深入研究。

顆粒細胞的凋亡同樣影響著卵母細胞卵丘擴展和成熟。Bcl2及Bax是細胞凋亡抑制/促進經典的標志基因，Bax的過度表達可拮抗Bcl2的保護效應而使細胞趨于死亡。我們檢測了小鼠COCs中Bcl2及Bax的表達情況，發現外泌體抑制了體外成熟小鼠COCs中Bcl2的表達；而外泌體處理并沒有影響小鼠COCs的Bax表達。Bcl2及Bax對顆粒細胞的凋亡調控作用影響卵母細胞的成熟狀態和發育潛能[23]，在卵巢功能相關的疾病研究中，PCOS患者卵巢竇卵泡中顆粒細胞Bcl2表達下調會引起顆粒細胞凋亡增多[24]；卵巢功能不全患者經藥物處理后顆粒細胞Bcl2表達上調、Bax表達下調，減少了細胞的凋亡從而改善了卵巢儲備功能[25]。此外，很多研究也證實外泌體能通過轉移非編碼RNA來調控細胞中Bcl2的表達，Deng等[26]發現間充質干細胞外泌體攜帶的長鏈非編碼RNA LINC00461通過靶向抑制miR-15a/miR-16表達，促進Bcl2的表達，誘導多發性骨髓瘤細胞的增殖并抑制細胞凋亡；C26癌細胞系分泌的外泌體可通過轉移miR-195a-5p/miR-125b-1-3p對Bcl2的負調控作用促進了細胞凋亡，從而誘導了結腸癌惡病體質引起的骨骼肌萎縮的發生過程[27]。綜上所述，我們推測DOR卵泡液外泌體通過調控Bcl2介導的顆粒細胞凋亡調控過程，并且造成卵丘擴展和卵母細胞成熟阻滯。

本研究發現DOR患者卵泡液外泌體能夠抑制小鼠卵母細胞體外成熟過程中卵丘擴展和減數分裂恢復的現象，并且對卵丘擴展相關基因Ptgs2和Tnfaip6和細胞凋亡抑制基因Bcl2產生了顯著的抑制效果；據此推測DOR患者卵泡液中外泌體可能通過轉移miRNA調控卵丘擴展和顆粒細胞凋亡相關基因的表達。我們今后將進一步挖掘外泌體非編碼RNA的作用機制，為卵巢儲備功能減退和卵母細胞發育潛能降低所致不孕患者的診療提供新的思路。