小柴胡湯及亞胺培南西司他丁對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的體外抑菌效果及生物膜清除作用的機制研究

高 吟, 張立紅, 張志斌, 胡錫池

(1.江蘇省無錫市中醫醫院 檢驗科, 江蘇 無錫, 214000;2.江蘇省無錫市第二人民醫院 檢驗科, 江蘇 無錫, 214000)

鮑曼不動桿菌是革蘭陰性條件致病菌, 無鞭毛，幾乎無動力，在大自然中廣泛存在[1]。鮑曼不動桿菌是重癥監護室院內感染主導細菌之一[2]。抗生素的濫用易導致鮑曼不動桿菌產生多重耐藥性[3]。耐碳青霉烯類抗菌藥物對β-內酰胺酶作用穩定，臨床上分離出耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(CRAB)的數量逐年上升[4]。小柴胡湯出自東漢名醫張仲景所著《傷寒論》，由柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、生姜、大棗等中藥組成，可用于治療傷寒少陽證，具有解表散熱、疏肝和胃的功效[5-6]。本研究探討小柴胡湯聯合亞胺培南西司他丁對CRAB的體外抑菌效果及對生物膜的清除作用，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株及藥物來源

本研究隨機選取江蘇省無錫市第二人民醫院2019年1月—2021年4月分離出的不同樣本來源的鮑曼不動桿菌菌株，剔除同一患者相同部位分離的重復菌株。樣本來源于痰液、尿液、腦脊髓、傷口膿液等標本。參考文獻[7]進行小柴胡湯的藥物配制。按照小柴胡湯藥加水煎煮2次，每次1.5 h, 濾液濃縮; 半夏、生姜用75%乙醇浸泡24 h, 收集提取液，回收乙醇，與上述濃縮液合并，濃縮至60 ℃下相對密度為1.08～1.10的藥液，噴霧干燥，制成干浸膏粉，備用。注射用亞胺培南西司他丁(上海輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20067765)。

1.2 儀器與設備

VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀(法國梅里埃); 96孔細胞培養板(美國Corning公司); 半自動多點接種儀(日本株式會社); 全功能微孔板檢測酶標儀(美國Biotek公司); 德國Eppendorf公司PCR擴增儀。

1.3 CRAB菌株鑒定和菌懸液的配置

將采集的樣本接種于麥康凱培養基進行細菌分離和培養，根據菌落具體形態選擇疑似鮑曼不動桿菌的菌落進行初步分離，接種于鮑曼不動桿菌顯色培養皿, 35 ℃下恒溫孵育24 h。采用VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀進行菌種鑒定。所有操作嚴格遵循使用說明書，且同一患者多次送檢標本檢出同一菌株按1株計算。將鑒定出的鮑曼不動桿菌進行耐藥檢驗，最終獲得60株非重復CRAB，接種至菌種保存管中，置于超低溫冰箱中保存。

將凍存CRAB菌株復蘇3代后，挑選4～5個菌落，接種于滅菌MHB肉湯中, 37 ℃ 培養箱增菌6 h, 此時細菌處于對數生長期，菌液采用比濁儀調整濁度至0.5麥氏濃度后，再以MHB肉湯稀釋，最終將菌懸液濃度調整為1×106CFU/mL備用。

1.4 抗菌藥物制備

A組藥物為小柴胡湯中藥提取物，最終稀釋濃度為256.00、128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50 μg/mL, 共10個濃度。B組藥物為亞胺培南西司他丁，最終濃度為256.00、128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50 μg/mL, 共10個濃度，備用。

1.5 微量棋盤稀釋法

依據96孔板棋盤法將配制好的不同濃度的小柴胡湯(A組藥)與亞胺培南西司他丁抗菌藥物(B組藥)兩兩組合，第1列加入A組藥，最后一排加入B組藥，藥物濃度由低到高，用來測定單藥最低抑菌濃度(MIC)值; 將制備好的CRAB菌液加入96孔平板的1～11列中。最后一排加入質控菌，分別設陽性對照(只加細菌，無藥物)和陰性對照(只加肉湯，無細菌)。挑選適量菌落于肉湯中稀釋，使最終每個孔內菌液濃度為5×105CFU/mL, 震蕩后放入37 ℃孵育箱中培養20 h, 觀察結果。

1.6 聯合用藥的藥效評估

記錄單獨應用2種藥物的MICA和MICB, 并記錄96孔板中聯合區域中最佳組合效應時2種藥物各自的MIC值，并計算聯合抑菌指數(FIC)。FIC=A組藥聯合時MIC值/A組藥單用時MIC值+B組藥聯合時MIC值/B組藥單用時MIC值。當FIC≤0.5時，即2種抗菌藥物為協同作用; 當FIC>0.5～1.0時，即2種抗菌藥為相加作用; 當FIC>1.0～2.0時，即2種抗菌藥為無關作用; 當FIC>2.0時，即2種抗菌藥物為拮抗作用。

1.7 小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨作用及聯合作用后生物膜抑制實驗[8]

將小柴胡湯與亞胺培南西司他丁聯合效果為協同作用的CRAB接種于MHB培養基中，并接種質控菌株，在37 ℃孵育箱內培養20 h, 采用比濁儀將菌液濃度調整為1.0×106CFU/mL, 加入無菌96孔細菌培養板，采用MHB培養基分別將小柴胡湯稀釋成1/4、1/16的MIC系列濃度，將亞胺培南西司他丁稀釋成1/4 MIC、1/16 MIC等系列濃度。以棋盤法將不同濃度的小柴胡湯和亞胺培南西司他丁進行兩兩組合, 37 ℃培養24 h, 每株菌株設立3個復孔，使用結晶紫染色法進行測定，酶標儀測定570 nm下吸光度，采用A570代表生物被膜生物量, A570越高表示生物膜越強。

1.8 細菌DNA的提取及實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測耐藥基因轉錄水平

根據細菌DNA提取試劑盒(購自上海翌圣生物科技股份有限公司)操作步驟提取細菌DNA, 采用50 μL常規反應體系。設置PCR反應條件為: 95 ℃, 5 min預變性; 95 ℃變性10 s, 60 ℃退火35 s, 65 ℃延伸30 s, 擴增35個循環; 最后72 ℃下繼續延伸10 min。引物序列如下,adeJ: 上游序列為5′-ATTGCACCACCAACCGTAAC-3′, 下游序列為5′-TAGCTGGATCAAGCCAGATA-3′;CarO: 上游序列為5′-GACAACTACAGCTTTACTGCT-3′, 下游序列為5′-ACACCAACTTTACCAACTGG-3′; 內參基因選擇16S rRNA: 上游序列為5′-CCTACCAAGGCGACGATCTGT-3′, 下游序列為5′-AACGCTCGCACCCTCTGTATT-3′。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 不同藥物對CRAB的MIC比較

小柴胡湯單獨用藥對CRAB生長有一定的抑制作用, MIC為32 μg/mL, 而亞胺培南西司他丁對CRAB的MIC為16 μg/mL, 見表1。

表1 小柴胡湯和亞胺培南西司他丁藥物對CRAB的MIC比較

2.2 小柴胡湯聯合亞胺培南西司他丁用藥的抑菌情況

小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯合作用于CRAB, 小柴胡湯濃度分別為8.00、4.00 μg/mL而亞胺培南西司他丁濃度分別2.00、1.00 μg/mL時，可抑制 CRAB的生長。不動桿菌藥敏FIC=4/32+2/16=0.25, FIC≤0.5, 提示2種藥物有協同作用，見表2。

表2 小柴胡湯聯合亞胺培南西司他丁用藥的抑菌情況

2.3 小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨作用于CRAB后對生物膜形成能力的影響

1/16 MIC、1/4 MIC的小柴胡湯單獨作用于CRAB的吸光度與空白對照組相比，差異無統計學意義(t=2.611、2.812,P>0.05); 1/16 MIC、1/4 MIC的亞胺培南西司他丁單獨作用于CRAB的吸光度與空白對照組相比，差異無統計學意義(t=1.777、2.717,P>0.05)。見表3。

表3 小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨作用于CRAB對生物膜形成能力的影響

2.4 小柴胡湯與亞胺培南西司他丁聯合作用對CRAB生物膜形成能力的影響

與單獨應用1/16 MIC亞胺培南西司他丁比較，加入1/16、1/4或1 MIC小柴胡湯聯合1/16 MIC亞胺培南西司他丁后的A570值下降，差異有統計學意義(t=4.513、10.515、19.802,P<0.05)。與單獨應用1/16 MIC小柴胡湯比較，加入1/16、1/4或1 MIC亞胺培南西司他丁聯合1/16 MIC小柴胡湯后的A570值下降，差異有統計學意義(t=3.109、5.657、15.461,P<0.05)。見表4。

表4 小柴胡湯與亞胺培南西司他丁聯合作用于CRAB的A570值比較

2.5 小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨用藥和聯合用藥對CRAB外排泵基因adeJ、CarO轉錄水平的影響

采用RT-PCR檢測小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨用藥和聯合用藥對CRAB外排泵基因adeJ、CarO轉錄水平的影響，結果顯示，與生長對照組相比，亞胺培南西司他丁組中adeJ和CarO呈低表達，聯合組adeJ和CarO呈高表達。小柴胡湯與生長對照組adeJ、CarO相對表達比較，差異無統計學意義(P>0.05), 其他各組adeJ、CarO兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

A: 各組adeJ基因相對表達水平比較; B: 各組CarO基因相對表達水平比較。兩者比較, *P<0.05。

3 討 論

本研究發現，小柴胡湯單獨用藥對CRAB有一定的抑制作用, MIC為32 μg/mL; 亞胺培南西司他丁對CRAB的MIC為16 μg/mL; 小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯合作用于CRAB可發揮協同作用。亞胺培南西司他丁是碳青霉烯類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強及耐受性良好等特點，被廣泛應用于革蘭陽性菌、陰性菌及厭氧菌的治療，亦是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌的有效藥物[9-10]。中藥作為新的抗菌劑來源，與常規抗生素聯合使用可以彌補常規抗生素治療的缺陷，提高抗生素的治療效果。小柴胡湯主要用于治療少陽病寒熱往來、胸脅苦滿、不欲飲食、心煩喜嘔、口苦、咽干、目眩等癥狀，具有解表散熱、疏肝和胃的功效[11-12]。方中柴胡味苦微寒，可疏解少陽; 黃芩苦寒，氣味較重，可清泄邪熱; 半夏、生姜調和胃氣，可降逆止嘔; 人參、炙甘草、大棗益氣和中，可扶正祛邪[13-14]。全方攻補兼施，升降協調，宣通內外，為和解良方。藥理研究[15]證實，小柴胡湯具有保護肝損傷、抗胃潰瘍、抗幽門螺桿菌、抗抑郁、抗菌和抗炎等作用。本研究顯示，小柴胡湯單獨使用對CRAB有一定的抑菌作用，而小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯合使用可發揮協同作用，增強抗生素的抑菌效果。

本研究進一步探討小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯合使用發揮抗菌效果的機制，結果表明，小柴胡湯和亞胺培南西司他丁可進一步激活adeJ、CarO基因，考慮小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯合使用后可降低亞胺培南西司他丁單獨用藥對CRAB的MIC, 可能是外膜孔蛋白基因CarO的激活發揮了主要作用，使小柴胡湯有效成分進入菌體內，從而聯合亞胺培南西司他丁共同發揮抑制細菌生長的作用。外排泵可以輸送多種化合物，與細菌多重耐藥性有關。既往研究[16]表明,CarO表達下調導致進入細菌體內的亞胺培南量減少，達不到抑菌所需對的濃度，從而使細菌產生耐藥性。以上研究均表明, 2種藥物聯用激活了部分外排泵基因表達，對細菌具有一定抑制作用。

生物膜的生成使細菌對常用抗菌藥物具有更強的抵抗力，增強細菌的耐藥性[17]。本研究針對形成生物膜的CRAB進行生物膜抑制實驗，結果表明，小柴胡湯聯合亞胺培南西司他丁具有抗菌協同作用，有抑制和清除CRAB生物膜的作用。小柴胡湯或亞胺培南西司他丁單獨使用時，對生物膜的抑制作用無顯著差異，可能是生物膜阻礙了藥物進入，導致殺菌作用被抑制。細菌生物膜是指細菌在生長過程中黏附于生物或非生物表面，由細菌自身分泌的胞外多糖基質組成的細菌群體，是耐藥基因水平轉移的極好環境，可獲得耐藥基因[18-19]。臨床分離的鮑曼不動桿菌幾乎都有形成生物膜的能力, 48 h內就能夠形成成熟的生物膜，且生物膜形成后需要極高的藥物濃度才可清除，而體內的藥物濃度通常達不到清除所需的濃度，且高藥物濃度將會帶來嚴重不良反應，并且使耐藥基因水平轉移并演變出生物膜形成能力高的耐藥菌株。因此，臨床醫師在治療此類患者時應改變治療方針，除了將治療重點放在預防及診斷上外，也需要及時治療急性感染，盡量杜絕慢性感染的出現以避免生物膜的形成。

綜上所述，小柴胡湯聯用亞胺培南西司他丁表現出協同抑菌作用，在清除生物膜方面，小柴胡湯聯合亞胺培南西司他丁雖然可提高生物膜清除率，但其不良反應很嚴重。小柴胡湯聯合亞胺培南西司他丁可對CRAB發揮抑菌作用，其機制可能是通過激活部分外排泵基因表達而實現的。