Zr-Fc MOF@MN復合微針的制備及其光熱抗菌性能

袁穎慧，尚亞廷，郭江娜，周瑩杰，嚴 鋒,

（1. 東華大學材料科學與工程學院, 纖維材料改性國家重點實驗室, 上海201620；2. 蘇州大學材料與化工學部, 江蘇省新型功能高分子材料工程實驗室, 江蘇 蘇州215123）

皮膚和軟組織感染是臨床上常見的復雜感染，影響范圍廣且發病率和死亡率高[1]。常規皮膚慢性感染多采用含抗生素藥膏涂敷到患處表面治療，但藥物的利用率低且細菌易向皮下組織遷移，導致涂敷的藥膏對皮膚深處的感染無效。微針（MN）可以以微創方式穿透皮膚角質層，將藥物遞送至皮下細菌感染部位，是一種皮下感染的有效治療方式[2]?？扇芙馕⑨樢话阌伤苄跃酆衔锶缇垡蚁┐迹≒VA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和透明質酸（HA）等制備而成[3,4]。當微針插入皮膚組織接觸到組織液后，聚合物快速溶解并釋放出針內藥物，其制作方式簡單、成本低，與其他類型的微針相比具有更好的工業化前景。PVA和PVP是常見的水溶性高分子，被廣泛應用于醫藥、生物等領域[5-7]或制備生物安全性水溶性微針。在微針內部可以封裝多種抗菌活性物質[8]（如氯霉素[9]、兩性霉素B[10]、新型抗菌肽[11]、水楊酸[12]以及陽離子聚合物[13-17]等）用于細菌感染治療。傳統抗生素存在誘發細菌耐藥性的風險，因此開發新型抗菌劑并進一步構建高效微針組合策略，以提高其在抗菌應用中的療效仍是目前面臨的重要挑戰。

光熱療法（PTT）是一種利用光熱劑在近紅外光照射下將光能轉化為熱能產生局部熱量，造成不可逆的細胞損傷局部治療方式，具有遠程可控性、低毒性和較少的副作用等優點[18]。PTT最初是癌癥治療的替代療法，而近年來PTT作為一種廣譜抗菌的物理殺菌方式，因具有治療時間短、不產生耐藥性等特點，在細菌感染治療領域備受關注[19]。常見的光熱劑有銀納米粒子[20]、金納米粒子[21]、聚多巴胺[22]以及金屬有機框架（MOF）[23]等。其中MOF作為一種新型光熱劑，高摩爾消光系數以及獨特的電子結構，使其光熱轉換效率與其他光熱劑相比具有明顯優勢[24]，因而更受青睞。傳統的PTT療法材料用于治療皮下感染時多采用注射方式，將光熱劑注射到細菌感染部位，給患者造成一定痛苦，因而需要構建新的低損傷或無痛策略將光熱劑輸送至感染部位。

本文將具有高光熱轉換效率的鋯-二茂鐵基MOF（Zr-Fc MOF）納米片負載到可溶解微針基質（V(PVA)/V(PVP)=1/2）中制備具有光熱抗菌性能的微針。首先利用氯化鋯（ZrCl4）與1,1’-二茂鐵甲酸（Fc(COOH)2）有機配體、乙酸（CH3COOH）調節劑的水熱反應制備生成Zr-Fc MOF納米片，并進一步將其負載到PVA/PVP微針中制備Zr-Fc MOF@MN，研究了Zr-Fc MOF及Zr-Fc MOF@MN在808 nm近紅外光下的光熱性能及抗菌性能。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

Fc(COOH)2、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、CH3COOH：化學純，上海泰坦科技股份有限公司；聚乙烯醇（PVA, 1799型）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP, K30型，Mw=4.0×104）：上海泰坦科技股份有限公司；ZrCl4：化學純，上海邁瑞爾化學技術有限公司；曲拉通：x-100 型，上海源葉生物科技有限公司；聚二甲基硅氧烷（PDMS）微針模具：微針針列數量 15×15，微針貼片外圍尺寸 15.2 mm×15.2 mm，臺州微芯醫藥科技有限公司；LB培養基：杭州微生物試劑有限公司；金黃色葡萄球菌（S. aureusATCC 6538）、大腸桿菌（E. coli8099）：由蘇州大學提供。

1.2 Zr-Fc MOF的制備

將ZrCl4（1.5 mmol），Fc(COOH)2（1.5 mmol）和CH3COOH（75 mmol）溶于45 mL的DMF中，超聲處理10 min后，置于100 mL的聚四氟乙烯容器中，在150 ℃下進行水熱反應，12 h后離心（10 kr/min，15 min）去除上清液并收集得到粗產物。將粗產物依次用DMF和去離子水超聲清洗、離心，重復3次，除掉未反應的物質。最終所得Zr-Fc MOF分散在水中，超聲20 min并儲存備用。表征前將Zr-Fc MOF分散液放入真空冷凍干燥機中干燥，得到Zr-Fc MOF納米片粉末。

1.3 Zr-Fc MOF的結構表征與性能測試

1.3.1 Zr-Fc MOF的結構表征X射線衍射（XRD）儀：德國布魯克公司D2 Phaser型，測試范圍5°～40°；冷場發射掃描電子顯微鏡（SEM）：日本日立公司SU8010型，噴金45 s，電壓1 kV；納米粒度與電位分析（DLS）儀：英國馬爾文公司Nano ZS型，水為溶劑，樣品質量濃度為1 mg/mL；傅里葉紅外光譜（FT-IR）儀：美國賽默飛世爾科技公司Nicolet iS50型，KBr壓片制樣，波數范圍4 000～500 cm-1，掃描次數32次。

1.3.2 Zr-Fc MOF的性能測試 光熱性能：采用808 nm近紅外激光器（中國上海熙隆光電科技有限公司FC-808-2000-MM型）照射Zr-Fc MOF的水分散液，通過紅外線熱像儀（美國菲力爾公司FLIR One型）記錄溫度隨時間的變化。

抗菌性能：經Zr-Fc MOF處理后的菌液（S. aureus,105CFU/mL或E. coli,108CFU/mL）在37 ℃培養箱中共培養4 h，取10 μL菌液滴加到LB固體培養基上涂板，每組3個平行樣。平板倒置放到37 ℃培養箱中12 h后，取出平板拍照并記錄細菌菌落數，與Zr-Fc MOF共培養的細菌為試驗組，未與Zr-Fc MOF共培養的細菌為陰性對照組，通過試驗組和對照組的菌落數計算抗菌率（Ra），計算公式如下：

其中：Nnegative為陰性組的細菌菌落數，Nsample為試驗組的細菌菌落數。

細菌微觀形貌：在96孔板底部放入無菌聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜，然后加入等體積的Zr-Fc MOF溶液與菌液，在有/無近紅外光照處理后，將孔板放置在37 ℃的培養箱4 h。培養結束后，取出PET薄膜并浸入w=2.5%的戊二醛溶液中固定2 h，然后用體積分數為10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液進行梯度脫水，通過SEM觀察細菌形貌。

1.4 微針貼片的制備和性能測試

1.4.1 微針貼片的制備以PVA和PVP為微針基質，制備可溶性微針。首先稱取不同質量的PVA，溶于10 mL去離子水中，浸泡12 h使PVA粒子溶脹，再置于98 ℃的油浴鍋中攪拌12 h，使其充分溶解，最終獲得PVA-X（X為聚合物溶液的質量分數，下文同）。稱取不同質量的PVP溶于10 mL的去離子水中，獲得PVP-X。將兩者以不同比例混合，獲得微針基質混合液。取適量滴入PDMS微針模具中，抽真空將針尖和組分內的空氣抽出，重復進行抽放操作，使聚合物進入微針針尖，然后放入烘箱（60 ℃）干燥，將成型的微針貼片與模具剝離。將Zr-Fc MOF 加入聚合物混合基質中，其他步驟與前述相同，即可制得負載Zr-Fc MOF的微針（Zr-Fc MOF@MN），微針貼片的制備過程如圖1所示。用光學顯微鏡觀察微針形貌，并測量尺寸。

圖1 微針貼片制備流程Fig. 1 Preparation process of microneedle patch

1.4.2 微針貼片的溶解性能制備負載羅丹明B（RhB）的微針（Zr-Fc MOF@RhB@MN）貼片，并裁剪成2塊3 mm×3 mm樣品，分別放置到1 mL的去離子水中，分別放置于室溫環境和60 ℃烘箱中，1 h后觀察微針貼片的形貌變化以及RhB的釋放情況。

1.4.3 抗菌性能取10 μL菌 液（106CFU/mL）滴 在Zr-Fc MOF@MN上，用808 nm近 紅 外 光 照 射10 min（2.6 W/cm2）后在37 ℃的培養箱中培養。4 h后加入900 μL LB液體培養基稀釋菌液，并進行涂板，每組3個平行樣，培養24 h后記錄菌落數。Zr-Fc MOF（250 μg/mL）的抗菌性能測試步驟同上。其中對照組為100 μL的磷酸鹽（PBS）緩沖液與100 μL菌液共培養。為驗證溫度的影響，設置對照組，即100 μL的PBS緩沖液與100 μL菌液混合放置在57.4 ℃的水浴鍋內10 min，再放入37 ℃的培養箱中共培養，培養時間均為4 h?？咕视嬎愎脚c“1.3.2”部分相同。

1.4.4 溶血測試取4 mL新鮮血液，1 500 r/min離心15 min后收集底部紅細胞，用PBS緩沖液洗滌至上清液澄清，最后獲得的紅細胞用PBS緩沖液配制成體積分數2%的溶液。將制備的Zr-Fc MOF(250 μg/mL)、Zr-Fc MOF@MN、φ=2%的曲拉通以及PBS緩沖溶液，各取100 μL與100 μL的紅細胞混合，其中Zr-Fc MOF和Zr-Fc MOF@MN設置808 nm近紅外激光照射10 min（2.6 W/cm2）光照組和無光照組，φ=2%的曲拉通與PBS緩沖溶液分別為陽性對照組和陰性對照組，隨后在37 ℃的烘箱中共孵育3 h。孵育結束后，離心（1 500 r/min,15 min），吸取100 μL上清液至96孔板，測試576 nm處的光密度（OD）值。溶血率（RH）計算公式如下：

其中：ODnegative，ODpositive分別為陰性組和陽性組的光密度值，ODsample為試驗組的光密度值。

2 結果與討論

2.1 Zr-Fc MOF的結構表征

水熱法合成Zr-Fc MOF納米片是一種自下而上的合成方法[25,26]，通過控制MOF晶體生長方向，Zr6作為金屬次級構筑單元（SBU），Fc(COOH)2作為有機配體，合成二維納米片，其制備示意圖如圖2所示。

圖2 Zr-Fc MOF的制備示意圖Fig. 2 Schematic diagram of Zr-Fc MOF preparation

圖3 （a）為Zr-Fc MOF的XRD圖譜，其XRD衍射峰與之前的報道一致，二維晶體結構的晶胞參數與文獻[26,27]相同。在Zr-Fc MOF的FT-IR圖譜（圖3 （b））中可觀察到Fc(COOH)2的特征峰，其中1 697 cm-1處為C=O的伸縮振動吸收峰，1 494 cm-1處為茂環上C=C的伸縮振動吸收峰，784 cm-1處為茂環上C-H的彎曲振動吸收峰[28]，這些特征峰表明了二茂鐵結構的存在。Zr-Fc MOF納米片的尺寸測試結果如圖3 （c）所示，Zr-Fc MOF平均尺寸為673.3 nm。Zr-Fc MOF為矩形片層結構，同時SEM觀察到存在邊緣蜷曲片層（圖3 （d））。上述測試結果證明成功合成了Zr-Fc MOF納米片。

圖3 Zr-Fc MOF的（a）XRD譜圖、（b）FT-IR譜圖、(c）粒徑分布圖和（d）SFM微觀形貌照片Fig. 3 (a) XRD pattern, (b) FT-IR spectra, (c) size distribution and (d) SEM microtopography of Zr-Fc MOF

2.2 Zr-Fc MOF 的光熱性能

Zr-Fc MOF具有高光熱轉換效率[25]，Zr-Fc MOF的光熱性能測試結果如圖4所示。隨著Zr-Fc MOF質量濃度的增加和光照時間的延長，Zr-Fc MOF分散液的溫度不斷升高，在光照10 min左右達到平衡值。當光功率密度為2.6 W/cm2時（圖4 （a）），300、400、500 μg/mL的Zr-Fc MOF分散體系在光照10 min后溫度可分別達到42.0、57.4、52.5 ℃，分別提高約22.0、37.4、32.5 ℃。在相同條件下，水的溫度略有上升，經過20 min的照射，溫度只增加了6.7 ℃。光功率密度對體系的光熱性也具有一定影響，當光功率密度為0.65 W/cm2時（圖4 （b）），500 μg/mL的Zr-Fc MOF分散液的最高溫度僅為31.2 ℃，明顯低于2.6 W/cm2光照下的溫度。此外，由熱成像圖（圖4 （c））分析也觀察到了類似的溫度變化。上述結果表明Zr-Fc MOF具有良好的光熱性能。

圖4 （a,b）Zr-Fc MOF在近紅外光照射下的溫度隨時間變化曲線；（c）近紅外光（808 nm，2.6 W/cm2）照射下Zr-Fc MOF分散液（ρ=500 μg/mL）的熱紅外圖像Fig. 4 (a,b)Time-temperature change curves of Zr-Fc MOF suspensions NIR irradiation; (c) Thermographic images of Zr-Fc MOF (ρ=500 μg/mL) during the NIR irradiation (808 nm, 2.6 W/cm2)

2.3 Zr-Fc MOF的抗菌性能

Zr-Fc MOF的光熱抗菌性能如圖5所示。將不同質量濃度Zr-Fc MOF與細菌菌液混合，經近紅外光照射（10 min）或無光照條件下處理后孵育進行細菌涂板（圖5（a，b）），結果顯示光照組隨著Zr-Fc MOF質量濃度的增加，菌落數目急劇下降。這是由于Zr-Fc MOF質量濃度提高，體系溫度升高使細菌細胞膜通透性增加，外膜脂質分子紊亂，細胞膜結構受損，進而導致細菌死亡。光照時間對抗菌效果的影響如圖5（c，d）所示，當ρ（Zr-Fc MOF）= 250 μg/mL時，近紅外光照10 min，抗菌率可達100%。而當ρ（Zr-Fc MOF）= 125 μg/mL時，細菌菌落數沒有隨著光照時間的延長而明顯減少，因為在該質量濃度下，體系溫度最高約為40 ℃，不足以有效殺死細菌。

圖5 Zr-Fc MOF的抗菌性能Fig. 5 Antibacterial properties of Zr-Fc MOF

Zr-Fc MOF與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用后細菌形貌的變化如圖6所示。陰性對照組（圖6（a，a1））中的細菌形貌完整，表面光滑。在無近紅外光照射的試驗組中（圖6（b，b1）），Zr-Fc MOF納米片與細菌相互黏連，但細菌形貌完整，沒有出現細胞凹陷，表明單獨的Zr-Fc MOF與細菌作用不能殺滅細菌。近紅外照射10 min后，大腸桿菌（圖6（c））中間發生凹陷，細菌細胞破裂；金黃色葡萄球菌（圖6（c1））邊緣發生凹陷，整個細胞干癟，細菌內溶質流出，結構受損，細菌死亡。

圖6 （a～c）大腸桿菌、（a1～c1）金黃色葡萄球菌與Zr-Fc MOF（250 μg/mL）培養后的微觀形貌Fig. 6 Bacterial morphology of (a—c) E. coli and (a1—c1) S. aureus after cocultured with Zr-Fc MOF (250 μg/mL)

2.4 微針的制備及表征

當微針配比為V（PVP-5%）∶V（PVA-5%）=1∶1時，所制備微針針體較軟，針背充滿氣泡，整個微針力學性能差（圖7（a））；進一步調整微針基質配比為V（PVP-30%）∶V（PVA-15%）=2∶1可得到微針針尖形貌完整，針背基體透明，力學性能好的微針（圖7（b））。下文采用該基質配比進一步制備負載Zr-Fc MOF的微針。

圖7 不同比例和質量分數的PVA和PVP所制備的微針宏觀形貌Fig. 7 Macromorphology of microneedles prepared by different proportions and mass fractions of PVA and PVP

制備Zr-Fc MOF@MN的過程如圖8所示。從圖中可見微針針尖形貌完整、堅固，呈四棱錐形，針尖底邊長度約為330 μm，針高約為770 μm，針間間距約為665 μm，Zr-Fc MOF在微針基質中分布較為均勻，且該微針具有一定機械強度。

圖8 Zr-Fc MOF@MN的（a）整體視圖、（b）側視圖和（c）俯視圖Fig. 8 (a) Overall view, (b) side view and (c) vertical view of Zr-Fc MOF@MN

2.5 微針的溶解過程

Zr-Fc MOF@RhB@MN 釋放負載藥物的性能如圖9所示。圖9（a，b）分別為剛加入1 mL去離子水時和放置1 h后的微針貼片溶解釋放示意圖。如圖9（b）所示，當溫度為25 ℃時，微針形貌僅出現些微溶解，而當溫度達到60 ℃時，微針針尖消失，且負載的RhB釋放。試驗結果表明，可溶性微針具有良好的溶解性和藥物釋放性能。

圖9 Zr-Fc MOF@RhB@MN貼片放置在去離子水中的浸泡1 h（a）前（b）后的微針溶解和RhB釋放示意圖Fig. 9 Schematic diagram of the dissolution and RhB release of Zr-Fc MOF@RhB@MN patch soak 1 h (a) before and (b) after dipped in deionized water

2.6 Zr-Fc MOF@MN的抗菌性能

Zr-Fc MOF及Zr-Fc MOF@MN的 抗菌性 能 如圖10所 示。在2.6 W/cm2的 近 紅外光 下 照 射10 min后，Zr-Fc MOF及Zr-Fc MOF@MN溫度升高，有效殺死大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，抗菌率可達100%。結果表明Zr-Fc MOF負載到微針貼片內仍能發揮優異的光熱抗菌作用。

圖10 細菌與Zr-Fc MOF和Zr-Fc MOF@MN的（a）細菌菌落圖像和（b）細菌存活率Fig. 10 (a) Bacterial colony assay and (b) bacterial viability of bacteria cocultured with Zr-Fc MOF and Zr-Fc MOF@MN

2.7 溶血測試

Zr-Fc MOF及Zr-Fc MOF@MN的生物相容性如圖11所示。由圖可見，各樣品的溶血率均小于1%，符合生物醫用材料的溶血標準（小于5%），即表明Zr-Fc MOF及Zr-Fc MOF@MN具有較低的溶血性。

圖11 Zr-Fc MOF和Zr-Fc MOF@MN的溶血率Fig. 11 Hemolysis ratios of Zr-Fc MOF and Zr-Fc MOF@MN

3 結 論

（1）Zr-Fc MOF納米片具有良好的光熱性能，其溫度隨著光照時間及近紅外光功率的增加而上升。

（2）在250 μg/mL的質量濃度下，近紅外光照10 min后，Zr-Fc MOF即可實現抗菌率100%的抗菌效果。

（3）Zr-Fc MOF@MN微針貼片在2.6 W/cm2的近紅外光照10 min條件下抗菌率達100%，抗菌性優異。