薏苡仁新標(biāo)準(zhǔn)中玉米赤霉烯酮測定法的方法確認(rèn)及驗證過程

謝燕

福建省龍巖市食品藥品檢驗檢測中心，福建龍巖 364000

薏苡仁收載于《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）2020年版一部，來源于禾本科植物薏米Coix lacryma-jobi L.var.ma-yuen（Roman.）Stapf的干燥成熟種仁。新版《中國藥典》與舊版比較，薏苡仁項下只新增了玉米赤霉烯酮的限量檢查，其他無變化，《中國藥典》同時也新增了玉米赤霉烯酮測定法的兩個方法：液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。藥品檢驗機構(gòu)在首次使用薏苡仁新標(biāo)準(zhǔn)時，必須進行方法確認(rèn)，并對分析方法中關(guān)鍵的指標(biāo)進行有選擇性的驗證。驗證的指標(biāo)有：專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。實驗室應(yīng)驗證哪些指標(biāo)，并沒有一個統(tǒng)一明確的規(guī)定，這就導(dǎo)致實驗室需要自主判斷方法的復(fù)雜程度，確定哪些方法學(xué)參數(shù)對檢驗結(jié)果影響最大。本文以“玉米赤霉烯酮測定法”的第二法為實例，對方法確認(rèn)的內(nèi)容進行闡述。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

薏苡仁，采購于普通藥店，樣品信息具體見表1。所有批次樣品粉碎過2號篩備用。

表1 樣品信息

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品

玉米赤霉烯酮對照溶液（中國食品藥品檢定研究院，批號：610022-202101）。

1.1.3 主要試劑

甲醇、乙腈為色譜純，水為一級水，氯化鈉為分析純；ZearaStar型免疫親和柱（Romer labs），Whatman玻璃微纖維濾紙（cytiva）。

1.1.4 主要儀器

1.2 方法

1.2.1 色譜-質(zhì)譜條件

1.2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI），負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，離子源溫度：500℃，電噴霧電壓：-4500 V，氣簾氣：35.0 psi，離子源氣1：50 psi，離子源氣2：50 psi，碰撞氣：氬氣。組分的質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

表2 玉米赤霉烯酮的保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對照品貯備溶液 精密量取玉米赤霉烯酮對照溶液1 ml置于100 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。經(jīng)含量折算后，濃度為101 ng/ml。

1.2.2.2 供試品溶液 取薏苡仁粉末20 g，加氯化鈉4 g，精密加入90%乙腈100ml，勻漿處理2min（13000r/min），離心10 min（4000 r/min），精密量取上清液10 ml，置50 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心10 min，用玻璃纖維濾紙濾過，精密量取續(xù)濾液20 ml通過免疫親和柱，用水10 ml重力自然洗脫，棄去洗脫液，使空氣進入柱子，將水?dāng)D出柱子，再用1.5 ml甲醇浸泡柱子約3 min后收集洗脫液，置2 ml量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液即得。

1.2.2.3 空白溶液 除不加供試品外，同供試品溶液操作制備。

1.2.2.4 對照品加標(biāo)溶液 精密量取玉米赤霉烯酮對照溶液適量加90%乙腈制成0.1 μg/ml的溶液。

2 方法確認(rèn)的驗證內(nèi)容與結(jié)果

2.1 專屬性（空白試驗）

采用空白溶液來判斷在目標(biāo)物區(qū)域是否存在干擾。當(dāng)空白溶液的干擾峰峰面積不高于標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度最低點峰面積的一半時，可認(rèn)為專屬性良好。結(jié)果顯示空白溶液在對照品相同保留時間處無干擾峰（圖1）。

圖1 薏苡仁（174.9/317.3）色譜圖

2.2 準(zhǔn)確度（加樣回收試驗）

精密稱取薏苡仁（批號：2009004）粉末20 g，精密加入對照品加標(biāo)溶液20 ml，按照“1.2.2.2”項下方法制備加標(biāo)樣品溶液，平行制備6份，依法進行測定，計算回收率，具體見表3，結(jié)果提示方法的回收率良好。

表3 加標(biāo)回收試驗結(jié)果（n=6）

2.3 精密度

2.3.1 方法精密度（重復(fù)性）

取同一批樣品（批號：2009004）按照“2.2”項下方法制備加標(biāo)樣品溶液，平行制備6份，依法進行測定，計算RSD為3.09%，結(jié)果表明方法的精密度良好。

2.3.2 儀器精密度

精密量取同一對照品溶液連續(xù)進樣測定7次，測定峰面積的RSD，結(jié)果為1.02%，表明儀器精密度良好。

2.4 檢測限

檢測限可分為兩個部分，儀器檢出限和方法檢出限，驗證的是方法檢出限，本文采用信噪比法進行分析，精密量取“2.2”項下的加標(biāo)樣品溶液適量，不斷稀釋至被測物質(zhì)注入超高效液相色譜-質(zhì)譜儀后的信噪比≥3∶1。結(jié)果顯示玉米赤霉烯酮峰的信噪比為7，相應(yīng)的加標(biāo)樣品溶液濃度為0.0404 ng/ml，當(dāng)供試品溶液中藥材含量為0.4 g/ml時，本實驗檢出限為0.1 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢出限為1 μg/kg，表明方法靈敏度良好。

2.5 定量限

采用信噪比≥10:1測定定量限時，本實驗定量限為0.3 μg/kg。根據(jù)《中國藥典》的要求，定量限結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求，因此要用與0.3 μg/kg這個數(shù)據(jù)含量相近的樣品進行驗證。在進行方法確認(rèn)時筆者認(rèn)為無須采用此定量限，在能滿足小于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的定量限4 μg/kg時同時也滿足獲得的信噪比大于等于10∶1即可。因此本實驗以校準(zhǔn)曲線最低點的濃度（1.515 ng/ml）作為定量限（3.8 μg/kg）。

驗證過程：精密稱取薏苡仁（批號：2009004）粉末20 g，精密加入對照品加標(biāo)溶液0.5 ml，按照“1.2.2.2”項下方法制備加標(biāo)樣品溶液，平行制備3份，依法測定峰面積，重復(fù)測定3次，計算回收率，結(jié)果顯示信噪比平均值為508，精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果見表4。

表4 定量限驗證結(jié)果（n=9）

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取對照品貯備溶液，用甲醇稀釋制成濃度為1.515、5.050、10.100、20.200、50.500、75.750 ng/ml的系列對照品溶液。精密吸取上述系列對照品溶液各5 μl，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜儀，測定峰面積，重復(fù)測定2次，以峰面積為縱坐標(biāo)，進樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示在1.515~75.750 ng/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，具體見圖2。

圖2 薏苡仁（174.9/317.3）線性關(guān)系

2.7 樣品測定

取3個批次樣品依法操作，計算供試品的含量（表5）。

表5 樣品中玉米赤霉烯酮的含量測定結(jié)果和檢測結(jié)果

3 討論

3.1 實驗過程遇到的問題

在供試品溶液的制備過程中，發(fā)現(xiàn)離心并不能使溶液澄清，上清液仍渾濁，通過免疫親和柱時，流速十分緩慢，因此增加了玻璃纖維濾紙過濾這一步驟；其次，每一步洗脫都要等到柱內(nèi)液體近干時再進行下一步，否則目標(biāo)物還未被吸附就隨著洗脫液一起被洗脫出去；最后增加甲醇浸泡這一步驟也是為了充分將目標(biāo)物洗脫出來，提高回收率。

3.2 離子對的選擇

《中國藥典》沒有指定定量離子對，筆者選用了響應(yīng)值高（174.9/317.3）的作為定量離子對，這是為了提高檢出限，便于定量。

3.3 報告限的使用

在“中藥中有害物質(zhì)痕量殘留檢測分析質(zhì)量控制指導(dǎo)原則”（中國食品藥品檢定研究院2015年試行版本）中提到了“報告限”，指的是被作為數(shù)值報告的最低濃度，一般等于或略高于最低校準(zhǔn)濃度，可以是“2.5”節(jié)的定量限，也可以是1/10最大殘留限量（maximum residue limit，MRL），只要能滿足風(fēng)險分析的技術(shù)要求，實驗室可以自行擬定。例如薏苡仁標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定每1000 g含玉米赤霉烯酮不得過500 μg，本文便以1/10 MRL作為報告限（即50 μg/kg），見表5；將報告限的數(shù)值固定后，就不必每一次都測定檢出限，可以節(jié)約很多的人力和物力。

4 結(jié)論

方法確認(rèn)過程并不是方法驗證的重復(fù)過程，而是實驗室在實際檢驗條件下進行的適應(yīng)性考察，需要充分考慮分析方法的復(fù)雜程度以及被測樣品的特點；對于玉米赤霉烯酮測定法這種前處理過程復(fù)雜且濃度范圍較大的痕量分析方法，建議對檢測限、定量限、專屬性、準(zhǔn)確度、精密度等5個指標(biāo)進行驗證；對于含量測定這種常量分析方法，建議對準(zhǔn)確度、精密度、專屬性進行驗證；而對于鑒別方法來說，建議對專屬性進行驗證。