人腦膠質瘤中硒蛋白P表達及臨床意義

劉 鋒，楊 濤，程 鈺，李永來，趙子龍，李東波，張淳華，羅長穩

(1.安康市中心醫院神經外科，陜西 安康 725000；2.安康市中心醫院病理科，陜西 安康 725000)

膠質瘤是顱內最常見的原發性中樞神經系統惡性腫瘤，由于膠質瘤呈侵襲性生長與正常腦組織界限不清，手術難以徹底切除侵入腦組織的腫瘤細胞，術后極易復發，且血腦屏障限制了抗癌藥物進入中樞神經系統，當前即使手術聯合放化療的綜合治療，高度惡性的膠質母細胞瘤患者的中位生存期仍不超過1年，臨床預后極差，臨床上膠質瘤的治療仍是一個難題。因此，研究腦膠質瘤的發病機制，尋找早期診斷、預防和治療腦膠質瘤的更為有效的方法具有非常大的臨床實用價值。硒蛋白P是血漿中含量最多的一種硒蛋白，目前研究證實，硒蛋白P具有抗氧化硝酸化[1]、清除自由基[2]、抗腫瘤[3]等作用。隨著對硒蛋白P研究的不斷深入,其抗腫瘤和誘導癌細胞凋亡作用越來越受到重視。然而，截至目前，關于硒蛋白P在人腦膠質瘤組織中表達變化的研究尚未見報道。本研究利用免疫組化技術觀察硒蛋白P在人腦膠質瘤中的表達，并探討其臨床意義，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本收集 收集安康市中心醫院神經外科自2003年1月至2020年5月手術切除的51例膠質瘤標本和9例顱腦損傷內減壓手術獲得的正常腦組織標本作為對照組。膠質瘤患者中男31例，女29例；年齡3～67歲，平均44.9歲。按《2016年世界衛生組織中樞神經系統腫瘤分類》標準，WHOⅠ級10例，WHOⅡ級14例，WHOⅢ級14例，WHOⅣ級13例。所有膠質瘤標本經病理科檢查確診，患者術前均未接受放化療或免疫治療，無糖尿病等基礎疾病，具有詳細的臨床病理資料和手術記錄。研究方案經安康市中心醫院倫理學委員會批準同意。

1.2 試劑與方法 膠質瘤標本和對照組腦組織標本均經4%中性甲醛溶液固定，常規脫水后進行石蠟包埋，并制成蠟塊。使用德國Leica公司生產的石蠟切片機切片，膠質瘤和正常腦組織的石蠟標本均采用連續切片，切片的厚度均為5 μm。切片成功后按常規步驟進行脫蠟、水化、抗原修復，加一抗兔抗人硒蛋白P多克隆抗體(批號：GTX105647)4 ℃過夜，滴加IgG二抗室溫孵育2 h，DAB顯色、沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，封片，光鏡下觀察并攝片。實驗所需試劑均由安康市中心醫院病理科集中采購。

1.3 實驗結果判定標準 硒蛋白P以胞漿染色為棕黃色者為陽性反應細胞，染色陽性細胞數量評分：0 分(全片未見著色或少于5%細胞散在著色),1分(5%～25%細胞著色)，2分(25%～50%細胞呈陽性)，3分(50%～75%細胞染色陽性),4分(>75%細胞染色陽性)。染色強度評分：0分(陰性)，1分(弱陽性)，2分(中等陽性)，3分(強陽性)。染色陽性細胞數量評分與染色強度評分之積為最終染色評分標準：0分(陰性)，1～4分(弱表達)，5～8分(中等表達)，9～12分(強表達)。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計學軟件進行分析，等級資料使用非參數檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 硒蛋白P在正常腦組織和膠質瘤組織中的表達 免疫組織化學染色顯示硒蛋白P在正常腦組織和膠質瘤組織中均表達，硒蛋白P著色部位主要位于細胞質內，弱表達呈淡黃色，強表達者呈棕黃，染色為彌漫性分布(圖1)。

注：A、F為正常腦組織；B、G為WHOⅠ級膠質瘤組織；C、H為WHOⅡ級膠質瘤組織；D、I為WHOⅢ級膠質瘤組織；E、J為WHOⅣ級膠質瘤組織。A～E為HE染色(×10)；F～J為硒蛋白P免疫組織化學染色(×40)

2.2 硒蛋白P在WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤組織中表達下調，但與病理級別無相關性 5組樣本(正常腦組織、WHOⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤組織)中硒蛋白P表達強度比較有統計學差異(均P<0.01)，見表1。其中男性和女性組織標本中硒蛋白P表達強度比較無統計學差異(Z=0.464，P=0.496)；≥50歲和<50歲組織標本中硒蛋白P表達強度比較無統計學差異(Z=0.727，P=0.394)。進一步的兩兩分析發現，正常腦組織與WHOⅠ級膠質瘤組織硒蛋白P表達強度比較無統計學差異(Z=8.050，P=0.277)，而正常腦組織與WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤組織硒蛋白P表達強度組間比較有統計學差異(均P<0.05)。WHOⅠ級膠質瘤組織與WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤組織硒蛋白P表達強度組間比較有統計學差異(均P<0.05)。WHOⅡ級、Ⅲ級和Ⅳ級膠質瘤組織硒蛋白P表達強度組間比較無統計學差異(均P>0.05)，見表2。結合各組間的平均秩可知，硒蛋白P在正常腦組織和WHOⅠ級膠質瘤組織中表達強度高于WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤組織。

表1 硒蛋白P表達與正常腦組織及腦膠質瘤臨床特征的關系(例)

表2 硒蛋白P表達與正常腦組織及腦膠質瘤病理級別的關系

3 討 論

硒是人體必需的微量元素，在人體內主要以硒蛋白P的形式發揮其生理功能。硒蛋白P主要在肝臟中合成，它作為硒轉運體，維持腦組織中的抗氧化硒酶，在硒代謝和抗氧化防御中起關鍵作用[4]。近年來，硒蛋白P在抗腫瘤方面的作用越來越受到人們的重視。研究表明硒蛋白P可通過多種機制發揮其抗腫瘤作用[5]，它是癌基因和抑癌基因表達的調節因子，具有清除自由基抗氧化作用，可促進DNA損傷修復[6]，可誘導癌細胞凋亡[7]，亦可通過調節機體免疫功能發揮抗腫瘤作用[8]。有研究表明，硒蛋白P對多種癌癥具有抗癌效應，包括乳頭狀甲狀腺癌[9]、結腸癌[10]、肝癌[11]、前列腺癌[12]、胰腺癌[13]等。已有研究證實，硒蛋白在正常腦組織中廣泛表達，主要分布于小腦、嗅球、海馬區和額葉皮質，神經元和星形膠質細胞中也有其表達，硒蛋白P在維持正常的腦功能中發揮著重要作用，對神經細胞具有保護作用[14]。硒參與了中樞神經系統疾病的病理，如阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化癥和癲癇，還參與中樞神經系統的多種功能，如運動表現、協調、記憶和認知，硒和硒蛋白可能在腦信號通路中發揮作用，硒蛋白在大腦皮質和海馬γ-氨基丁酸(GABA)細小蛋白陽性中間神經元的發育和功能中具有特殊的重要性。多巴胺通路可能也依賴于硒，硒在黑質紋狀體通路中表現出神經保護作用，并在較高濃度下對多巴胺能神經元產生毒性。硒和硒蛋白在神經傳遞中的作用可能不僅限于抗氧化性質，還可能影響炎癥反應，影響蛋白質磷酸化和離子通道，改變鈣穩態和腦膽固醇代謝，硒蛋白P通過與突觸后載脂蛋白E受體2(ApoER2)相互作用發揮直接信號傳遞功能[15]，由此可見硒與大腦關系密切。然而，目前有關硒蛋白P在腦膠質瘤組織中的表達及病理級別的相關性尚未見報道。

我國膠質瘤年發病率為(5～8)/10萬，5年病死率在全部腫瘤中占第三位，約占中樞神經系統惡性腫瘤80%，是顱內最常見的惡性腫瘤，其發病機制尚不清楚。WHO中樞神經系統分類將膠質瘤分為WHOⅠ-Ⅳ級，其中Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質瘤約占20%，由于其侵襲性生長方式，手術難以徹底切除侵入腦組織中的腫瘤細胞，低級別膠質瘤患者的復發率仍較高，其治療方式也受諸多因素影響；Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質瘤約占80%，即使手術聯合化療、放療的綜合治療，高度惡性的膠質母細胞瘤患者的中位生存期仍不超過1年，臨床預后極差。近年來隨著對膠質瘤分子機制的不斷深入研究，發現膠質瘤的組織學特征和分子學特征與其預后存在一定的相關性[16-18]，同時也存在很大程度上的異質性，因此單一的臨床診療思路并不適合所有的膠質瘤患者，而個體化的膠質瘤治療策略已是當前和以后膠質瘤治療的主要模式。膠質瘤的個體化治療就需要不斷地深入研究膠質瘤的組織學特征和相關分子機制。

近年來，硒蛋白P的抗癌效應越來越受到廣大學者的關注，為了明確硒蛋白P在膠質瘤中的表達情況及其與膠質瘤惡性程度的關系，本研究采用免疫組織化學染色方法檢測硒蛋白P在正常腦組織及不同級別膠質瘤中的表達。結果顯示硒蛋白P在正常腦組織和膠質瘤組織中均表達，著色部位主要位于細胞質內。進一步分析發現硒蛋白P在正常腦組織和惡性程度相對較低的WHOⅠ級膠質瘤組織中表達均呈強陽性，而在惡性呈較高的WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤組織中硒蛋白P表達程度下降呈弱陽性，且差異具有統計學意義。硒蛋白P在惡性呈較高的WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤組織中表達顯著下調，這與既往研究中硒蛋白P在其他腫瘤中的表達規律一致。王青等[19]報道硒蛋白P在胰腺癌組織中的表達低于癌旁正常胰腺組織，尚未發現硒蛋白P表達強度與腫瘤的分化程度及TNM分期相關。田志帥等[20]通過檢測的60例直腸癌組織、40例直腸腺瘤組織、40例正常直腸組織中硒蛋白P的表達情況，結果發現硒蛋白P在直腸癌組織中表達下調，對直腸癌的發生發展具有重要作用。譚華梁等[21]對首次確診為肝細胞癌的57例患者和同時期體檢健康者50例采用ELISA法檢測血清硒蛋白P水平,結果發現硒蛋白P在肝細胞癌患者血清中表達降低,并認為硒蛋白P可作為肝細胞癌早期診斷的特異性生物標志物。硒蛋白P在前列腺癌、肝癌等腫瘤中表達也下調。硒代胱氨酸通過激活Trxr1靶向抑制氧化損傷介導的細胞凋亡途徑從而抑制人腦膠質瘤生長。硒可通過激活TRPM2通路增強多西紫杉醇對DBTRG膠質母細胞瘤細胞的凋亡效應。我們發現硒蛋白P在惡性呈較高的WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤組織中表達顯著下調，由此，我們推測硒蛋白P在膠質瘤中可能發揮抗腫瘤作用。

進一步組間比較發現硒蛋白P在正常腦組織與WHOⅠ級膠質瘤中的表達強度無統計學差異，WHOⅠ級膠質瘤包括毛細胞型星型細胞瘤、室管膜下瘤、室管膜下巨細胞型星形細胞瘤、黏液乳頭型室管膜瘤、血管中心型腦膠質瘤等，具有生長緩慢的共同特征，常被認為是一種良性腫瘤[16]，這可能是硒蛋白P在正常腦組織與WHOⅠ級膠質瘤中的表達強度無差異的潛在原因，也可能是由于本研究收集的標本量較小有關，我們期待通過更大樣本量的數據分析以得到更準確的結果。硒蛋白P在WHOⅡ級、Ⅲ級和Ⅳ級膠質瘤組織中的表達強度均無統計學差異，提示硒蛋白P與膠質瘤WHO病理級別無相關性，作者進一步分析研究結果發現，硒蛋白P雖然在WHOⅡ級、Ⅲ級和Ⅳ級膠質瘤組織中的表達無統計學差異，但是在不同分子表型的膠質瘤組織中的表達強度有著統計學差異，由于本研究樣本量少，尚未進行詳細分類統計，但這一發現提示硒蛋白P在惡性程度較高的WHOⅡ級、Ⅲ級和Ⅳ級膠質瘤組織中表達下調，可能在不同病理分型的膠質瘤中發揮著不同作用，這一發現有望為膠質瘤病理分型及個體化診斷治療提供新的思路，進一步的大樣本研究有助于揭示硒蛋白P在腦膠質瘤不同病理類型中的表達和臨床意義。

綜上所述，本研究發現硒蛋白P在惡性程度較高的WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤組織中硒蛋白P表達程度下調，硒蛋白P的表達水平與年齡、性別及膠質瘤病理級別無相關性。我們推測硒蛋白P在膠質瘤中可能發揮抗腫瘤作用。后續我們將進一步研究硒蛋白P在膠質瘤中的抗腫瘤作用及其機制。