促紅細胞生成素對高糖誘導大鼠近端腎小管上皮細胞轉分化的影響

張錦華，高 明，朱小靜，李立立

(西安市人民醫院 西安市第四醫院腎臟內科，陜西 西安710004)

腎間質纖維化是糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)進展至終末期腎臟病(End-stage renal disease,ESRD)的病理基礎[1]。在DN過程中，腎小管上皮細胞因管腔中葡萄糖濃度變化及次級代謝底物傳遞紊亂等而影響其正常生理功能，打亂細胞因子平衡狀態，抑制維持上皮細胞形態的基因表達，表型標志物E鈣粘蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白(ZO-1)等表達減少，表達肌成纖維細胞表型釋放，出現間充質標志物如α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、成纖維細胞特異性蛋白(FSP)等表達增加，進而出現上皮細胞轉分化成肌成纖維細胞[2-3]，即上皮細胞轉分化(EMT)。一些損傷因素，如炎癥、自身免疫、缺血-再灌注和高血糖等都可誘導成纖維細胞活化，發生EMT。研究證實[4-6]，腎小管上皮細胞EMT是可逆的，因此，臨床上急需尋找能延緩或抑制EMT的方法，藥物治療就顯得尤為重要。

促紅細胞生成素(Erythropoietin,EPO)由腎臟分泌，受腎臟皮質和外髓局部組織氧含量調節，通過腎小管上皮細胞促紅素受體(EPOR)經血液循環作用于骨髓紅系祖細胞，主要作用是促進紅細胞增生[7]。在臨床上EPO主要作為改善腎性貧血的治療藥物，研究證實其在新生兒及癌癥導致的貧血治療方面也有顯著效果[8-10]。研究發現，在各種非造血組織中也廣泛分布EPOR，并發揮促血管生成、胚胎組織發育、抗炎保護等作用，因此被公認為一種全身性保護性細胞因子[11-13]。在急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)中EPO作為一種保護因子，研究最多的即為其抗氧化應激(Oxidative stress,OS)、抗炎抗凋亡作用[14-15]。然而，在慢性腎臟疾病如DN時，EPO是否在抑制OS、預防腎小球硬化、腎間質纖維化等方面的研究尚少。本研究將通過體外細胞實驗，明確EPOR表達情況，進一步研究EPO對高糖誘導的近端腎小管上皮細胞OS和EMT的影響，探討EPO在DN腎臟保護中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 NRK52E細胞購自上海研域生物科技有限公司；EPO由沈陽三生制藥生產；甘露醇購自廣西南寧化學制藥公司；DEME/F12完全培養基購自上海中喬新舟生物科技公司；胎牛血清(FBS)購自美國 Gibco公司；胰蛋白酶消化液(0.25%)購自武漢百浩天生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素雙抗(100×)溶液購自美國賽默飛公司；活性氧ROS含量分析試劑盒購自上海研一生物科技有限公司；兔抗小鼠E-cadherin、α-SMA和EPOR抗體，兔抗小鼠GADPH抗體均購自于美國 Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗購自上海碧云天生物技術有限公司；GAPDH引物購自上海愛丁堡生物科技發展有限公司；反轉錄試劑盒、Real-time RT-PCR試劑盒均購自大連TaKaRa公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與分組：將NRK52E細胞用含10% FBS和100×雙抗的DMEM/F12完全培養基進行培養，適宜條件下培養至指數期，經胰蛋白酶消化后計數，隨機分為五組，分別為正常對照組(NC組)、甘露醇對照組(OC組)、高葡萄糖濃度組(HG組)、HG+EPO 50 U/ml組(E1組)以及HG+EPO 100 U/ml組(E2組)。除NC組不做任何處理外，OC組在培養基中加入19.5 mmol/L甘露醇，排除滲透造成的影響，其余三組培養在25 mmol/L高糖環境中，且E1、E2組按要求添加相應濃度的EPO，共培養48 h后，進行后續實驗。

1.2.2 活性氧試劑盒檢測ROS水平：采用活性氧ROS分析試劑盒(2’7’-二氫二氯熒光素二乙酸酯DCFH-DA熒光探針)檢測活性氧水平。將五組NRK52E細胞(指數期)接種于96孔培養板中，48 h后吸去培養液，滴加濃度為10 mmol/L的DCFH-DA液，充分覆蓋細胞，37 ℃培養箱避光孵育20 min，吸去DCFH-DA液，用PBS液洗滌3次，收集各組上清液，參照活性氧檢測試劑盒說明書檢測各組NRK52E細胞內的活性氧水平。

1.2.3 RT-PCR：采用RT-PCR檢測E-cadherin、α-SMA和EPOR mRNA相對表達水平，按照RNA抽提試劑盒實驗步驟提取各組細胞的總RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行RT-PCR。擴增程序為：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、58 ℃ 40 s，共40個循環，65 ℃～95 ℃溶解曲線，以GAPDH為內參測定目的基因的表達，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4 Western blot：采用Western blot檢測E-cadherin、α-SMA和EPOR蛋白表達，提取各組NRK52E細胞總蛋白，BCA法蛋白定量，加入緩沖液，蛋白變性后進行SDS-PDGE電泳。PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入E-cadherin抗體(1∶6000)、α-SMA 抗體(1∶1500)、EPOR抗體(1∶2000)以及GADPH(1∶2000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶4000)，振蕩孵育2 h，洗膜后用增強的化學發光法檢測。以GADPH 為內參，計算各組細胞中E-cadherin、α-SMA和EPOR蛋白相對表達水平。

2 結 果

2.1 高糖條件下NRK52E細胞EPOR的表達變化 與NC組比較，OC組EPOR mRNA無統計學差異(P>0.05)；HG組EPOR mRNA表達增加(P<0.05),見圖1A。與NC組比較，OC組EPOR蛋白無明顯變化(P>0.05)，HG組EPOR蛋白表達增加(P<0.05)，見圖1B、C。結果說明，高糖可刺激NRK52E細胞EPOR表達增加，相同滲透濃度的甘露醇不影響細胞EPOR表達。

注：與NC組比較，*P<0.05

2.2 EPO對高糖誘導NRK52E細胞轉分化的影響 與NC組比較，OC組E-cadherin、α-SMA mRNA無統計學差異(均P>0.05)，HG組E-cadherin mRNA表達降低(P<0.05)，α-SMA mRNA表達增加(P<0.05)；與HG組比較，E1和E2組E-cadherin mRNA表達增加(均P<0.05)，α-SMA mRNA表達降低(P<0.05)，且E2組mRNA變化程度較E1組更顯著，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2A。Western blot檢測結果顯示，與NC組比較，OC組E-cadherin、α-SMA 蛋白無統計學差異(均P>0.05)；HG組E-cadherin 蛋白表達降低(P<0.05)，α-SMA 蛋白表達增加(P<0.05)；與HG組比較，E1和E2組E-cadherin 蛋白表達增加(均P<0.05)，α-SMA 蛋白表達降低(P<0.05)，且E2組蛋白變化程度較E1組顯著，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2B、C。結果說明，高糖可誘導NRK52E細胞間充質轉分化，EPO可抑制高糖誘導的NRK52E細胞間充質轉分化，大劑量EPO干預(E2組)較小劑量EPO干預(E1)抑制轉分化效果顯著。

注：與NC組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05；與E1組比較，△P<0.05

2.3 EPO對高糖誘導氧化應激的影響 NC組和OC組ROS水平低，與其他三組比較無統計學差異(均P>0.05)；相較于NC組，HG組細胞ROS水平顯著增加(P<0.05)；相較于HG組，E1和E2組細胞內ROS水平降低，且E2組降低更顯著(P<0.05)，見表2。

表2 各組細胞內ROS水平

3 討 論

DN的早期表現為腎肥大、腎小球和腎小管基底膜增厚及其他明顯的病理特征。隨著疾病的進展，它逐漸演變為腎小管間質纖維化(TIF)、腎小球細胞外基質積聚，TIF是DN進展到ESRD的主要病理基礎，而腎小管上皮細胞通過EMT轉變為肌成纖維細胞是產生細胞外基質的主要細胞，在TIF進展中發揮重要作用。腎小管上皮細胞EMT過程的抑制和治療，是降低慢性腎臟疾病的發病率和病死率的重要方法。

EPO是腎小管旁間質細胞合成的具有刺激造血系統的糖蛋白類激素。EPOR為一種跨膜受體,屬細胞因子受體超家族，腎臟組織內EPOR廣泛表達。研究表明，EPO是體內具有多重器官保護性的細胞因子，在臨床治療中，慢性腎衰竭患者常常采用基因重組技術合成的高純度人促紅素(rhEPO)進行腎性貧血的治療，起到改善臨床指標，優化腎功能等功效[16]。近年來隨著對EPO作用機制的深入研究，發現其除了在造血系統發揮重要作用外，在一些非造血系統組織發現存在有EPOR的分布，如神經系統、睪丸間質細胞等，由于EPOR的廣泛分布，EPO在這些組織在中亦發揮了非常重要的非造血相關的生理作用。燕鵬等[17]動物實驗(大鼠)發現，EPO可降低DN大鼠24 h尿蛋白，具有保護腎臟損傷的作用。陳艷霞等[18]細胞實驗發現，rhEPO可能通過抑制RhoA/ROCK信號轉導通路從而阻止腎小管上皮轉分化，起到腎臟保護作用，在一定范圍內隨rhEPO水平增加保護作用亦明顯增強。

EMT轉變過程由多種轉錄因子和信號通路參與，在EMT過程中，腎小管上皮細胞擔任主導作用，E-cadherin由CDH1基因編碼，Ca2+依賴性的跨膜糖蛋白，屬于Ⅰ型鈣黏蛋白，能夠維持上皮極性和細胞間結構的完整性，是腎小管上皮保持其特性的標志性蛋白，其減少和丟失是EMT的標志，進而導致纖維化形成，α-SMA是成纖維細胞的特征性標志蛋白，纖維化的特征在于α-SMA表達增加。大量研究證實，氧化應激在腎臟纖維化發展中起重要作用。EPO屬于較強的氧自由基清除劑，陳穎東等[19]用EPO治療缺血再灌注大鼠，發現MDA、SOD、NO改變顯著。林才等[20]采用rhEPO治療新生兒缺氧缺血性腦病，發現治療后患兒SOD水平均明顯升高,MDA水平均顯著降低，說明治療后患者氧自由基清除能力增強，氧化應激得到明顯緩解，預后改善。在本研究中發現，高糖誘導NRK52E細胞間充質轉分化后，HG組EPOR表達增加，E-cadherin表達降低，α-SMA 蛋白表達增加，細胞ROS水平顯著增加，說明高糖環境可以引發腎小管上皮細胞EMT，且NRK52E細胞能夠表達EPOR。EPO干預高糖培養的NRK52E細胞發現，EPO抑制高糖引發的EMT，與HG組比較，E1和E2組E-cadherin表達增加，α-SMA表達降低，細胞內ROS水平降低，說明EPO可以減輕高糖導致的氧化應激，對抑制腎小管上皮細胞EMT發揮了一定作用。

綜上所述，EPO能夠抑制腎小管上皮細胞EMT，能夠抑制高糖引發的NRK52E細胞E-cadherin、α-SMA表達異常，緩解高糖誘導的氧化應激，為以后深入探討EPO在DN中保護作用奠定基礎。當然本研究也存在不足之處：①目前尚無EPOR阻斷劑類藥物，無法用特異性EPOR阻斷劑進行EPO發揮小管細胞保護作用的研究；②體外實驗不能完全模擬復雜的體內環境，一些小型臨床研究和動物實驗報道了許多EPO治療的相關不良反應，特別是大劑量應用EPO的情況下。這些可能的不良反應包括高血壓、癲癇發作、血栓形成、高鉀血癥以及促腫瘤生長等。因此對于EPO的腎臟保護作用還有待于大量的臨床試驗證實。