circRNA_103809調節胃癌干樣細胞特性和線粒體功能的研究

鄭小紅，金正偉，董慶煥，謝 楊

胃癌是全球極為常見的惡性腫瘤，盡管針對胃癌相關的分子研究不斷深入，但是胃癌病死率依舊呈上升趨勢[1]。由于胃癌發病早期無明顯特異性癥狀，與胃炎和胃潰瘍等疾病極為相似，極易造成誤診，延誤治療時機[2]。隨著病情的不斷發展，胃癌晚期患者會出現胃痛、惡心嘔吐，部分患者會出現吞咽困難等局部癥狀[3]。胃癌晚期患者可能出現淋巴結轉移，是造成患者治愈率不高、預后不佳的主要原因[4]。隨著高通量測序技術的快速發展，越來越多環狀RNA(circRNA)被發現，成為研究者關注的重點。circRNA是一類特殊的非編碼RNA分子，呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解[5]。既往研究表明circRNA_103809可調控肝癌細胞增殖[6]。但其在胃癌中的作用機制尚無統一定論。本文旨在分析circRNA_103809調節胃癌干樣細胞特性和線粒體的作用機制。

1 材料與方法

1.1主要細胞 胃癌細胞株(SGC-7901)購自中國科學院細胞庫。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、兔抗人單克隆抗體(Bax)、裂解半胱天冬酶9(cleaved cas9)/半胱氨酸蛋白酶9(Caspase9)、裂解半胱天冬酶3(cleaved cas3)/半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)和相應二抗購自武漢博歐特生物科技有限公司；Trizol、逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自上海吉至生化科技有限公司；兔抗人circRNA_103809抗體和抗人β-actin抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司；兔抗人細胞黏附分子44(CD44)、胚胎干細胞關鍵蛋白(SOX2)和八聚體結合轉錄因子4(OCT4)抗體購于英國Abcam公司。

1.2circRNA_103809干擾序列設計 circRNA_103809 shRNA及空載質粒均購自中國碧云天生物技術研究所。將SGC-7901細胞分成Control組、shRNA-NC組、circRNA_103809-shRNA1組、circRNA_103809-shRNA2組和circRNA_103809-shRNA3組，分別接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養后，shRNA-NC組采用空轉質粒轉染，circRNA_103809-shRNA1組、circRNA_103809-shRNA2組和circRNA_103809-shRNA3組導入circRNA_103809基因。按照RT-PCR逆轉錄試劑盒說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。以逆轉錄后的樣品為模板進行RT-PCR反應，設置反應條件。選擇β-actin作為內參，檢測circRNA_103809水平。確定circRNA_103809-shRNA1組、circRNA_103809-shRNA2組和circRNA_103809-shRNA3組轉染成功，進行后續實驗。

1.3RT-PCR測定CD44、SOX2和OCT4 分別收集穩定篩選的細胞，Trizol用于提取總RNA，NanoDrop2000分光光度儀測定RNA濃度，根據逆轉錄試劑盒合成cDNA，在RT-PCR儀上進行PCR擴增,設置反應條件。實驗進行3組平行重復。CD44上游引物序列為5'-CGGACACCATGGACAAGTTT-3'，下游引物序列為5'-CCGTCCGAGAGATGCTGTAG-3'。SOX2上游引物序列為5'-GAAAAGGCGTGTGGTGTGAC3-3′，下游引物序列為5′-CGCTGATTGGTCGCTAGAAAC-3′。OCT4上游引物序列為5′-AGGATCCCCCGCCGGAACAA-3′，下游引物序列為5′-GAGTTCCCGCGTTGCCCCTC-3′。根據樣本的Ct值計算2-ΔΔCt值，計算每個腫瘤樣品中的目的基因對于正常樣品的倍數差異。

1.4顯微觀察腫瘤細胞成球情況 取各組處于對數生長期細胞以1×105/ml的密度接種于6孔板中進行培育，1周后收集成球細胞，重制成單細胞懸液進行傳代培養，分別檢測培育1周后每團細胞超過100個的成球細胞數目及成球細胞的成球直徑。

1.5流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位 SGC-7901細胞線粒體膜電位采用JC-10染色及流式細胞儀檢測。將各組細胞制成密度為1×105個/ml懸液，接種于6孔板中，培養48 h后加入JC-1染色液1 ml，37 ℃避光孵育，1000 r/min離心5 min，棄上清液，加入緩沖液沖洗，后采用流式細胞儀檢測JC-1熒光信號。

1.6Western blot法檢測干細胞標志物 檢測各組干細胞標志物CD44、SOX2和OCT4蛋白表達水平，取各組對數生長期細胞以1200 r/min離心10 min后加入裂解液重懸細胞并裂解、離心，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取待測蛋白，用BCA法測量蛋白濃度并定量。凝膠電泳后轉PVDF膜2 h。5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，一抗孵育過夜，取出使用PBST反復洗滌3次，添加相應二抗于室溫孵育1.5 h。選擇β-actin作為內參，采用軟件獲得蛋白條帶并計算每組條帶的灰度值。

2 結果

2.1干擾circRNA_103809穩定細胞株的建立 相比Control組和shRNA-NC組，circRNA_103809-shRNA1組、circRNA_103809-shRNA2組和circRNA_103809-shRNA3組中circRNA_103809 mRNA水平均降低(P<0.05)；相比circRNA_103809-shRNA2組和circRNA_103809-shRNA3組，circRNA_103809-shRNA1組circRNA_103809 mRNA最低(P<0.05)；Control組和shRNA-NC組比較無差異(P>0.05)。見圖1。選擇干擾效果最好的circRNA_103809-shRNA1組做后續研究，簡寫為sh-circ103809。

2.2干細胞標志物CD44、SOX2和OCT4表達比較 相比Control組和shRNA-NC組，sh-circ103809組CD44、SOX2和OCT4蛋白及mRNA水平明顯降低(P<0.05)；Control組和shRNA-NC組CD44、SOX2和OCT4蛋白及mRNA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表1和表2。

表1 各組干細胞標志物CD44、SOX2和OCT4 mRNA水平比較

表2 各組干細胞標志物CD44、SOX2和OCT4 mRNA相對表達水平比較

2.5干擾circRNA_103809表達對凋亡蛋白的影響 Control組和shRNA-NC組Bax/Bcl-2、Caspase9/β-actin、Caspase3、β-actin蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與shRNA-NC組和Control組相比，sh-circ103809組Bax/Bcl-2、Caspase9/β-actin、Caspase3/β-actin蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)。見圖4和表4。

表4 各組凋亡蛋白表達水平比較

2.3干擾circRNA_103809表達抑制腫瘤細胞體外成瘤能力 sh-circ103809組細胞成球率低于Control組和shRNA-NC組(P<0.05)；sh-circ103809組成球直徑明顯小于Control組和shRNA-NC組(P<0.05)；Control組與shRNA-NC組細胞成球率和成球直徑比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組細胞成球率及成球直徑比較

3 討論

胃癌是導致世界范圍內癌癥死亡的主要原因，其具有惡性程度高、生長迅速、轉移率高等特點[7]。目前，臨床上采取的主要治療措施是放化療和手術切除瘤體，但是治療后患者的生存率依舊不高[8]。

本研究發現，相比Control組和shRNA-NC組，sh-circ103809組CD44、SOX2和OCT4蛋白及mRNA水平明顯降低，提示干擾circRNA_103809基因表達可以減少干細胞標志物CD44、SOX2和OCT4表達水平。CD44是腫瘤干細胞標志物之一，廣泛存在于淋巴細胞、上皮細胞、中胚層細胞等各類細胞表面，其與腫瘤浸潤轉移關系的研究已有大量文獻報道[9-12]。SOX2是SOX基因家族的重要成員，有大量文獻報道其與腫瘤細胞增殖、侵襲轉移和維持腫瘤干細胞自我更新具有密切聯系，并在人類胃黏膜上皮細胞的分化過程中具有重要作用[13-15]。有研究表明，SOX2蛋白表達變化與胃癌的發生發展有關[16]。OCT4基因具有多個轉錄起始位點，可轉錄不同的mRNA亞型，從而翻譯成多種蛋白質[17]。OCT4廣泛表達于胚胎及生殖干細胞內，并維持該類細胞潛能分化及自更新功能[18]。有研究報道，OCT4在胃癌、肝癌、乳腺癌中均有表達，參與腫瘤的形成和發展[19]。于洋等[20]發現干細胞標志物OCT4在膀胱癌組織中高表達，且與膀胱癌轉移有關，患者遠期預后不良。本研究結果說明，干擾circRNA_103809基因表達可能通過抑制CD44、SOX2和OCT4表達，抑制腫瘤干細胞的形成，從而達到抑制胃癌進展的效果。

本研究發現sh-circ103809組細胞成球率明顯降低，成球直徑明顯減少，提示干擾circRNA_103809基因表達可抑制其體外成瘤能力。本研究結果還顯示，干擾circRNA_103809基因表達，sh-circ103809組細胞線粒體膜電位明顯下降。線粒體是細胞中重要的組成部分，參與細胞分化、信號轉導和細胞凋亡等生物學過程，而線粒體膜電位則是評估線粒體功能的重要指標[21-22]。當細胞受到外界因素的刺激，線粒體膜電位下降，導致線粒體膜通透性轉運通道開放，大量凋亡誘導因子從線粒體釋放到細胞質中，從而使得細胞加速死亡[23]。因此，促進線粒體膜電位下降則會促進細胞凋亡。

本研究結果顯示，干擾circRNA_103809基因表達，Bax/Bcl-2、Caspase9/β-actin、Caspase3/β-actin蛋白表達水平明顯增加，提示干擾circRNA_103809基因表達可調控凋亡蛋白表達，從而促進胃癌細胞凋亡。通常通過抑制腫瘤抗凋亡基因表達和促進促凋亡基因表達等方式，來加速腫瘤細胞凋亡，其中Bcl-2家族在凋亡基因調控中起重要作用[24]。本研究結果提示，干擾circRNA_103809基因表達后，可通過上調促凋亡Bax蛋白表達，下調抗凋亡Bcl-2蛋白表達，進而影響胃癌的發展進程。

綜上，干擾circRNA_103809表達可以降低線粒體膜電位，有效抑制腫瘤細胞的增長，其調控機制可能是通過抑制干細胞標志物蛋白的表達及促進Bax蛋白表達、抑制Bcl-2蛋白表達，進而影響胃癌的發展進程。