ACTN4、HPV16 E7檢測在食管癌患者診斷及預后判斷中的價值

王 力，邸 靜

商洛國際醫(yī)學中心醫(yī)院病理科，陜西商洛 726000

食管癌是一種發(fā)生在食管上皮的消化道惡性腫瘤，因病理類型的差異而有所不同，在我國發(fā)病率較高，僅次于胃癌，但食管癌的病因與發(fā)病機制迄今尚不明確。據(jù)統(tǒng)計，我國每年約有15萬人因食管癌而死亡，由于食管癌在早期癥狀較輕，除吞咽有哽噎感外無其他不適，因此多被患者所忽視，影響了治療時間，這也是造成食管癌病死率較高的原因之一[1]。食管是幽門螺桿菌感染的必經(jīng)之路，也是與人乳頭瘤狀病毒(HPV)感染有關(guān)的原因之一，近年來HPV與食管癌之間的關(guān)系逐漸被人們重視[2]。α-輔肌動蛋白4(ACTN4)作為血影蛋白超家族的成員，是一種膜相關(guān)骨架蛋白的肌動蛋白，可參與細胞骨架重組以及調(diào)節(jié)細胞黏附及形態(tài)，通過與肌動蛋白相結(jié)合保持細胞骨架完整性和調(diào)節(jié)細胞運動[3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ACTN4與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且ACTN4表達降低后可顯著抑制包括口腔鱗狀細胞、腦膠質(zhì)瘤細胞、星形細胞瘤細胞在內(nèi)的多種腫瘤的活性[4]。但目前對ACTN4在食管癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用以及與臨床指標的相關(guān)性方面還少有證實。本研究通過免疫組化檢測HPV16 E7、ACTN4在食管癌組織中的表達，并分析其與食管癌患者臨床病理特征和術(shù)后生存期的關(guān)系，旨在為HPV16 E7、ACTN4在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用以及食管癌的診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2019年5月在本院進行食管癌手術(shù)治療的80例患者為研究對象，食管癌病理組織及癌旁2 cm正常組織均保存于本院病理科。納入標準：接受手術(shù)治療的原發(fā)性食管癌，初次手術(shù)，術(shù)前未接受全身治療。排除標準：無明確病理診斷，化學療法治療者，語言障礙及存在精神障礙者，客觀或主觀原因退出者。所有患者中位年齡55歲，<55歲和≥55歲患者分別為36例和44例；腫瘤最大徑≤3 cm及>3 cm的分別為46例、34例；病理分級Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級分別為26例、35例和19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為43例，未轉(zhuǎn)移為37例，本研究已取得患者同意，且不違背本院倫理規(guī)定。

1.2儀器與試劑 HPV16 E7、ACTN4單克隆抗體(美國Abcam公司)，SP9002免疫組化試劑(中國上海鼎杰生物有限公司)；蘇木青染色體(中國南京建成生物有限公司)。

1.3方法 常規(guī)10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片，采用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)處理過的載玻片行免疫組化。

1.4免疫組織化學染色檢測HPV16 E7、ACTN4表達 嚴格按照試劑盒說明書進行操作，切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復1 min，30 mL/L過氧化氫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液3 min×5次，HPV16 E7、ACTN4一抗(1∶200)5 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液3 min×5次，加入聚合物增強劑，35 ℃孵育10 min，磷酸鹽緩沖液3 min×5次，加入酶標抗兔聚合物放大劑，常溫孵育15 min，磷酸鹽緩沖液清洗，蘇木精復染5 min，2%鹽酸乙醇分化10 s，自來水返藍15 min，切片自然風干，中性樹膠封片，DAB顯色后蘇木素復染，顯微鏡下觀察拍照。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析診斷價值。聯(lián)合診斷采用Logistic回歸模型構(gòu)得到新預測變量用于食管癌的診斷。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1食管癌組織和癌旁組織中HPV16 E7、ACTN4表達情況 HPV16 E7陽性的組織標本中，細胞膜和細胞質(zhì)呈黃棕色。食管癌組織的HPV16 E7陽性表達率為70.00%(56/80)，癌旁正常組織的HPV16 E7陽性表達率為17.50%(14/80)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=50.40，P<0.001)。ACTN4陽性的組織標本中，細胞質(zhì)和細胞膜呈淡黃色，食管癌組織的ACTN4陽性表達率為65.00%(52/80)，癌旁組織的ACTN4陽性表達率為22.50%(18/80)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=33.03，P<0.001)。

2.2食管癌HPV、ACTN4表達與臨床病理特征分析 HPV16 E7陽性表達與食管癌患者年齡、腫瘤最大徑、腫瘤類型無關(guān)(P>0.05)，而與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、N分期、M分期有關(guān)(P<0.05)；ACTN4陽性表達與食管癌患者年齡、腫瘤最大徑、腫瘤類型無關(guān)(P>0.05)，而與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、N分期、M分期有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 食管癌HPV16 E7、ACTN4表達與臨床病理特征分析

2.3HPV16 E7、ACTN4檢測用于食管癌診斷的價值 繪制HPV16 E7、ACTN4單獨及聯(lián)合檢測用于食管癌診斷的ROC曲線：HPV16 E7檢測的靈敏度為81.30%，特異度為80.70%，曲線下面積(AUC)為0.768；ACTN4檢測的靈敏度為74.2%，特異度為76.5%，AUC為0.713；HPV16 E7、ACTN4聯(lián)合檢測的靈敏度為90.60%，特異度為86.20%，AUC為0.825。見圖1。

圖1 HPV16 E7、ACTN4單獨及聯(lián)合檢測用于食管癌診斷的ROC曲線

2.4HPV16 E7、ACTN4表達與食管癌患者預后的關(guān)系分析 HPV16 E7陽性食管癌患者2年生存率為44.64%(25/56)，HPV16 E7陰性患者2年生存率為70.83%(17/24)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ACTN4陽性食管癌患者2年生存率為42.30%(22/52)，ACTN4陰性食管癌患者2年生存率為71.42%(20/28)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 HPV16 E7表達與食管癌患者預后的關(guān)系分析

圖3 ACTN4表達與食管癌患者預后的關(guān)系分析

3 討 論

近年來外科手術(shù)在食管癌領域的應用已經(jīng)取得了明顯的進步，但食管癌患者術(shù)后生存率以及生活質(zhì)量方面仍受多種因素影響[5]。因此，深入了解與食管癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的潛在分子機制，找尋與食管癌預后相關(guān)的分子靶點，為日后食管癌等疾病的研究提供有力證據(jù)非常必要。流行病學和生物學證據(jù)表明，HPV16 E7與食管癌的發(fā)生有關(guān)，而且食管癌患者HPV的感染率為50%～70%，這也是晚期食管癌患者存活率較低的原因之一[6]。ACTN4作為一種肌動蛋白，可增加腫瘤細胞的活性，并同腫瘤的轉(zhuǎn)移與不良預后密切相關(guān)，有研究表示，ACTN4在多種癌癥中呈高表達，并在多數(shù)癌癥中有促進癌細胞增殖的作用，因此研究ACTN4、HPV16 E7在食管癌組織中的表達及其與患者臨床病理特征和生存預后的關(guān)系尤為重要[7]。

有研究報道食管鱗癌中有ACTN4、HPV16 E7等致癌因子[7]。國內(nèi)外均有在食管癌組織中檢出ACTN4、HPV16 E7等癌基因的報道，證實其致癌率為64%～67%，并認為ACTN4、HPV16 E7升高與食管癌的發(fā)生密切相關(guān)[8]。本研究的免疫組織化法檢測結(jié)果顯示，食管癌組織中HPV16 E7表達陽性率為70.00%，在癌旁組織中表達為17.50%，ACTN4在食管癌組織陽性表達為65.00%，癌旁正常組織表達為22.50%，表示HPV16 E7、ACTN4均在食管癌中呈高表達，促進疾病發(fā)生、發(fā)展。在食管癌組織中，對癌細胞增殖起促進作用的ACTN4促癌因子的表達上調(diào)會導致癌細胞的異常分化。HPV16 E7抑制MET、EGF等促凋亡因子的表達下調(diào)，會使上皮細胞角化并分化多種相關(guān)的中間纖維成分，這些改變構(gòu)成了食管癌細胞特異性的表達，促進了食管癌疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。MENG等[8]研究表明，在癌細胞內(nèi)，ACTN4可以通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)等產(chǎn)生調(diào)控壓力進而刺激腫瘤細胞的增殖，增加癌細胞活性，促進食管癌發(fā)展。食管癌的致癌機制還可能包括HPV中的E6、E7蛋白誘導的致癌因子。有研究表明，HPV18、16、E7可與E6協(xié)同作用，致使人類上皮細胞永生化并導致相應細胞因子產(chǎn)生紊亂，對癌細胞的惡性轉(zhuǎn)化產(chǎn)生促進作用[10]。在食管癌臨床病理特征中HPV16 E7與ACTN4的陽性表達在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的促進作用。本研究結(jié)果表明，HPV16 E7陽性、ACTN4陽性與患者年齡、腫瘤最大徑、腫瘤類型無關(guān)，而與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，影響食管癌切除術(shù)后患者生存率的主要因素是腫瘤的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況，ACTN4、HPV16 E7陽性表達與細胞癌患者產(chǎn)生的淋巴轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)，ACTN4、HPV可能通過參與細胞轉(zhuǎn)移過程進而促進腫瘤的進展，促進食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[11]。其潛在機制可能為ACTN4通過與鳥苷激酶聯(lián)合而調(diào)控細胞骨架的組織和黏著，進而影響細胞的活動力和腫瘤轉(zhuǎn)移，食管癌中過表達的ACTN4可刺激食管癌細胞產(chǎn)生侵襲性的細胞突起，使其表現(xiàn)出更強的惡性表型，而HPV則主要憑借病毒癌基因在細胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用，在已轉(zhuǎn)化的癌細胞中HPV16 E7基因組通常以缺失性方式整合在癌細胞中，并通過引起其他癌基因的異常活動而發(fā)揮致癌作用，進而促進食管癌等疾病的發(fā)生、發(fā)展[12-13]。

本研究結(jié)果顯示，HPV16 E7陽性食管癌患者的2年生存率為44.64%(25/56)，HPV16 E7陰性食管癌患者的2年生存率為70.83%(17/24)，ACTN4陽性食管癌患者2年生存率為42.30%(22/52)，ACTN4陰性食管癌患者的2年生存率為71.42%(20/28)，提示ACTN4、HPV16 E7可能參與食管癌病程的進展，并對食管癌患者術(shù)后的生存期具有一定影響。在食管癌中HPV16是導致正常細胞不穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，HPV16 E7通過調(diào)控相關(guān)傳導通路進而縮短癌細胞周期，促進癌細胞大量分裂增殖，引起端粒酶等致癌物質(zhì)的活性增加，使癌細胞分裂增殖失控和癌細胞壽命延長[14]。相關(guān)研究表明，ACTN4在人類表皮癌、膀胱癌、胃癌及卵巢癌細胞中均呈高表達，食管癌中ACTN4可通過與Rho家族分子聯(lián)合，影響正常細胞的活動力和腫瘤轉(zhuǎn)移，進而調(diào)控癌細胞組織黏著和癌癥的發(fā)展[15]。HPV16被認為是候選的癌基因，HPV16 E7的陽性表達越高越能夠促進癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移，并與膀胱癌、卵巢癌等多種疾病患者的不良預后有著緊密聯(lián)系，提示HPV16 E7可能位于細胞癌變所經(jīng)過的共同通路上，且能夠普遍參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。

綜上所述，HPV16 E7、ACTN4均在食管癌中呈高表達，并且與病理分級、組織分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并能夠直接影響食管癌患者預后，可以作為食管癌臨床診斷中的重要依據(jù)。