甲氧基聚乙二醇2000-氫化大豆磷脂酰乙醇胺的制備及性能探究

于殿宇， 張寅風(fēng)， 高佳佳， 曲佳瑤， 吉曉蕊， 羅淑年，張晨晨， 楊福明,2， 朱秀清,3

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030) (九三食品股份有限公司2，哈爾濱 150069) (哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品學(xué)院3，哈爾濱 150028)

脂質(zhì)體是一種人工膜，是一種封閉的球形囊泡，通常含有一層或多層磷脂雙分子層[1]，具有無(wú)毒無(wú)害、無(wú)免疫原性、易實(shí)現(xiàn)靶向性等特點(diǎn)，從20世紀(jì)70年代開(kāi)始用作藥物載體[2]。磷脂是脂質(zhì)體制備的重要原料，在醫(yī)藥、食品、化妝品等加工行業(yè)中應(yīng)用廣泛。磷脂包括天然磷脂和合成磷脂，但人工合成的磷脂制備過(guò)程復(fù)雜，成本較高，動(dòng)物磷脂中含有膽固醇，人體攝入過(guò)多容易誘發(fā)疾病，安全性難以保證[3]，不宜用在藥物中。隨著磷脂在醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用范圍的不斷增加，制藥業(yè)對(duì)純度高的天然植物磷脂的需求不斷增大[4]。

非轉(zhuǎn)基因的大豆?jié)饪s磷脂多用于生產(chǎn)卵磷脂[5]，其副產(chǎn)物中的磷脂酰乙醇胺(PE)安全健康、價(jià)格低廉，對(duì)提高記憶力、增強(qiáng)大腦機(jī)能、調(diào)節(jié)血脂有益[6，7]。但磷脂酰乙醇胺相關(guān)產(chǎn)品不穩(wěn)定，應(yīng)用受限[8]，為了使其具有優(yōu)良性質(zhì)，需要進(jìn)行改性處理。磷脂氫化改性可以使油脂穩(wěn)定性提高，親水性增強(qiáng)[9]。

催化加氫法是通過(guò)高溫和催化劑來(lái)催化油與氫的反應(yīng)，但是PE中的乙醇胺對(duì)催化劑有抑制作用，且溫度較高會(huì)導(dǎo)致反式脂肪酸的形成[10]。超臨界CO2氫化法對(duì)PE改性可以克服通過(guò)高溫和催化劑加氫的弊端，有效減少反式脂肪酸的形成[11]，還有助于加快反應(yīng)速率，提高催化劑活性，得到的產(chǎn)品碘價(jià)低、色澤淺、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性好[12]。

聚乙二醇是一種親水性聚合物，在脂質(zhì)體膜上插入帶有水溶性聚合鏈的聚合物,可以獲得更長(zhǎng)的血循環(huán)時(shí)間[13]。相關(guān)研究表明，分子質(zhì)量為2 ku的甲氧基聚乙二醇MPEG表現(xiàn)出最佳性能[14]。為避免修飾分子時(shí)產(chǎn)生交聯(lián)，采用一端以甲基封閉的MPEG[15]。

目前，利用插入PEG基團(tuán)的腦磷脂生產(chǎn)的藥物載體得到了廣泛的應(yīng)用，Rupa等[16]用PEG2000-PE/TPGS混合膠束結(jié)合難溶性抗癌物藥物紫杉醇后提高了生物利用率；Su等[17]探究奧曲肽- peg - dspe的合成，為制備明確的藥物傳遞系統(tǒng)提供了靶向分子；Mitra等[18]探討開(kāi)發(fā)PLA-PCL-PEG-PCL-PLA膠束改善了地塞米松的眼通透性。但是，直接用磷脂制成的脂質(zhì)體氧化穩(wěn)定性還有待提高[19]。

本研究以非轉(zhuǎn)基因的大豆?jié)饪s磷脂生產(chǎn)卵磷脂過(guò)程中的副產(chǎn)物為原料，采用化學(xué)合成法制備一種性價(jià)比更高的藥用輔料MPEG2000-HSPE，并對(duì)產(chǎn)品性能進(jìn)行研究，以期提高PC的副產(chǎn)物綜合利用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

濃縮磷脂(酸價(jià)：16.75 mg KOH/g，碘價(jià)：79.75 gI2/100 g，水分及可揮發(fā)物0.75%，丙酮不溶物60.33%，乙醚不溶物0.07%)。聚乙二醇單甲醚2000；氫氣、二氧化碳、氮?dú)?純度≥99%)；Pd/C催化劑；溴乙酸叔丁酯(98%)；二氯亞砜(SOCl2，99%)。

1.2 磷脂酰乙醇胺的純化

對(duì)PC副產(chǎn)物進(jìn)行溶劑萃取，得到高純度的PE。首先采用95%的乙醇，在料液比為1∶3，溫度為-13 ℃的條件下去除副產(chǎn)物中的PC；再用90%的石油醚，在料液比為1∶4，溫度為30 ℃的條件下進(jìn)行萃取，去除肌醇等其他磷脂，最終得到粉狀淡黃色磷脂酰乙醇胺[20]。

1.3 磷脂酰乙醇胺的氫化

將純化后的PE充分溶解于無(wú)水乙醇的混合溶劑中，與Pd/C催化劑儀器加入密封好的反應(yīng)釜，向內(nèi)通入CO2并對(duì)反應(yīng)釜進(jìn)行試漏。確定反應(yīng)釜密封狀態(tài)良好后排出反應(yīng)釜中的CO2，再充入CO2，反復(fù)3～5次以置換出反應(yīng)釜中的空氣，從而保證氫化反應(yīng)的安全進(jìn)行。最后一次先后充入CO2和H2，使釜內(nèi)總壓為11 MPa[21]。攪拌、升溫，保持恒定的氫化條件至一定反應(yīng)時(shí)間。氫化結(jié)束后降溫降壓，放出反應(yīng)釜內(nèi)氣體，轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物于燒杯中。在55 ℃條件下旋蒸去除溶劑，最后干燥獲得成品。

1.4 聚乙二醇單甲醚2000酰氯的合成

圖1為聚乙二醇單甲醚2000合成聚乙二醇單甲醚2000酰氯的全過(guò)程。將干燥的聚乙二醇單甲醚MPEG2000全部溶解于無(wú)水二氯甲烷溶液中，通入N2后加氫氧化鈉固體反應(yīng)，然后加入溴乙酸叔丁酯，得到羧基聚乙二醇單甲醚2000。將其加入到二氯甲烷中，再向反應(yīng)體系中加入二氯亞砜，得到白色固體即為聚乙二醇單甲醚2000酰氯。

圖1 mPEG2000合成聚乙二醇單甲醚2000酰氯全過(guò)程

1.5 磷脂酰乙醇胺的培化

將氫化磷脂酰乙醇胺與聚乙二醇單甲醚2000酰氯的溶于一定量氯仿中，加入三乙胺進(jìn)行反應(yīng)，在適宜溫度為條件下反應(yīng)一段時(shí)間后將未反應(yīng)的三乙胺和氯仿蒸除，將獲取的固體減壓干燥，后將未反應(yīng)的聚乙二醇單甲醚2000酰氯通過(guò)無(wú)水乙醚去除，真空干燥稱重，最終得到MPEG2000-HSPE[22]。而后將三乙胺鹽酸鹽通過(guò)四氫呋喃沉淀出來(lái)，離心分離，將離心管下層固體真空干燥后進(jìn)行稱重，用于計(jì)算MPEG2000酰氯的轉(zhuǎn)化率。

1.6 產(chǎn)品理化性質(zhì)測(cè)定

1.6.1 分散力的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)硬水的配制：一般依據(jù)碳酸鈣來(lái)表示硬度，計(jì)為0.342 mg/mL，稱取無(wú)水CaCl2顆粒0.304 g及0.13 g的MgCl2-6H2O置于1 000 mL的容量瓶?jī)?nèi)，再利用蒸餾水定容至刻度線。取1 mg/mL的試樣、4 mg/mL的油酸鈉及硬水于容量瓶中(100 mL)，三者的加量分別為50、5、10 mL，加蒸餾水定容后搖勻，定容后立即用波長(zhǎng)λ為700 nm的光和1 cm比色槽測(cè)定其吸光度，同時(shí)與空白樣傳統(tǒng)藥用輔料(MPEG2000-SPE)對(duì)比，以此來(lái)判斷樣品的分散力[23]。

1.6.2 碘值的測(cè)定

采用A. S. Sarpal B的方法測(cè)定碘值。

1.6.3 乳化性的測(cè)定

用50 mL的蒸餾水溶解0.05 g培化磷脂酰乙醇胺，置于100 mL的具塞三角瓶?jī)?nèi)，再量取50 mL的正己烷，放置于振蕩速率為105 r/min的水浴恒溫振蕩器中5 min，測(cè)定正己烷與水分散10 mL消耗的時(shí)間[24]，重復(fù)測(cè)定3次取平均值，并與同樣條件下測(cè)定的MPEG2000-SPE樣品作對(duì)比。

1.7 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)獲取的數(shù)據(jù)，用3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)取得的平均值來(lái)表示，采用 SPSS 16.0 軟件進(jìn)行方差分析以及多重比較分析，并利用 Origin 9.0 軟件處理實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脂酰乙醇胺純化

用乙醇冷凍萃取，獲得PE純度為78.44%，得率為89.32%，與Heikki等[25]的結(jié)果相似；最后經(jīng)過(guò)石油醚的萃取，在此工藝條件下浸提的磷脂酰乙醇胺液相色譜圖如圖2所示，磷脂酰乙醇胺純達(dá)到91.28%，PE得率為86.83%。

圖2 純化后的樣品液相色譜圖

2.2 磷脂酰乙醇胺的超臨界CO2氫化工藝

2.2.1 催化劑用量對(duì)PE超臨界CO2氫化的影響

圖3 催化劑添加量對(duì)超臨界CO2氫化PE的影響

在氫化溫度為60 ℃， 氫氣分壓為4 MPa，CO2分壓為7 MPa，攪拌速度為300 r/min的條件下氫化120 min，催化劑添加量對(duì)磷脂酰乙醇胺中的反式脂肪酸及碘值的影響如圖3所示。隨著氫化催化劑添加量的增加，氫化PE的反式脂肪酸勻速上升，而碘值先迅速降低后趨于平緩，這是因?yàn)樵诖呋瘎┖枯^少時(shí)，可以形成的金屬-氫及金屬-雙鍵配合物含量較少，得到的半氫化中間體也很少，此時(shí)增加催化劑的添加量，會(huì)顯著增加催化反應(yīng)速率；當(dāng)催化劑添加量在4%以上時(shí)，隨著催化劑用量增加，產(chǎn)品碘值下降不大但反式脂肪酸的含量顯著增大[26]。綜合考慮氫化反應(yīng)產(chǎn)物和成本，選擇氫化催化劑添加量為磷脂質(zhì)量的4%。

2.2.2 氫化溫度對(duì)PE超臨界CO2氫化的影響

在催化劑添加量為4%，氫化溫度分別為50、60、70、80、90、100 ℃，氫氣分壓為4 MPa，CO2分壓為7 MPa，攪拌速度為300 r/min的條件下氫化120 min，得到的不同氫化溫度對(duì)超臨界CO2氫化反應(yīng)的影響，氫化溫度對(duì)超臨界CO2氫化PE的影響如圖4所示。

圖4 氫化溫度對(duì)超臨界CO2氫化PE的影響

從圖4可以看出，隨著氫化溫度的增加，氫化磷脂酰乙醇胺碘值先快速下降后趨于平緩，氫化磷脂酰乙醇胺中的反式脂肪酸含量先緩慢升高后快速升高。氫化反應(yīng)是放熱反應(yīng)，適當(dāng)?shù)丶訜嵊欣跉涓玫厝芙庥谌軇┲校呋瘎┑靡猿浞诌€原和活化，此外，在超臨界CO2條件下，反應(yīng)中的氣液之間的傳質(zhì)阻力可大大降低，反應(yīng)速率增加。當(dāng)溫度太高時(shí)會(huì)導(dǎo)致催化劑表面氫分布不充分從而降低反應(yīng)速度，造成磷脂的變質(zhì)。當(dāng)催化溫度為60 ℃時(shí)，碘值變化的顯著性下降，反式脂肪酸含量的變化顯著增加。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選取最適氫化溫度為60 ℃[27]。

2.2.3 氫化時(shí)間對(duì)PE超臨界CO2氫化的影響

在催化劑添加量為4%，氫化溫度為60 ℃，氫氣分壓為4 MPa，CO2分壓為7 MPa，攪拌速度為300 r/min，氫化時(shí)間分別為80、90、100、110、120、130 min，得到不同氫化時(shí)間對(duì)超臨界CO2氫化反應(yīng)的影響，氫化時(shí)間對(duì)超臨界CO2氫化PE的影響如圖5所示。

圖5 氫化時(shí)間對(duì)超臨界CO2氫化PE的影響

由圖5可以得出，隨著氫化時(shí)間的延長(zhǎng)，氫化PE的碘值先迅速下降后趨于平穩(wěn)，這是因?yàn)樵跉浠磻?yīng)剛開(kāi)始階段，PE的不飽和程度還比較高，反應(yīng)物較為充足，反應(yīng)速度較快，但是隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，PE中能夠被催化劑表面活性點(diǎn)吸附的雙鍵減少，氫氣在催化劑表面不斷被消耗，催化劑也不斷鈍化，所以在120 min后氫化PE的碘值雖然不斷下降，但反應(yīng)速度降低，原因是磷脂酰乙醇胺中能夠被催化劑表面活性點(diǎn)吸附的雙鍵減少，反應(yīng)速度減小；此外，生成的半氫化中間體有一部分生成了較為穩(wěn)定的反式脂肪酸，其與順式脂肪酸相比不易被氫化。綜合考慮，氫化時(shí)間選取120 min為宜[28]。

2.2.4 氫化分壓力對(duì)PE超臨界CO2氫化的影響

在催化劑添加量為4%，氫化溫度為60 ℃，氫氣分壓分別為1、2、3、4、5、6 MPa，CO2分壓為7 MPa，攪拌速度為300 r/min的條件下氫化120 min。氫化分壓對(duì)超臨界CO2氫化磷脂酰乙醇胺碘值和反式脂肪酸的影響如圖6所示。隨著氫氣分壓的增加，氫化PE的碘值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且由于增大氫氣壓力增大了催化劑表面氫氣的濃度使得反式脂肪酸含量降低。但是氫氣分壓超過(guò)4 MPa以后，雖氫化PE中反式脂肪酸繼續(xù)緩慢下降但碘值下降的不明顯。這是因?yàn)樵谝欢ǖ臍錃夥謮悍秶鷥?nèi)，隨著氫氣分壓的增大，溶解于溶劑中的氫含量也隨之增加，有利于氫化反應(yīng)的進(jìn)行，但是隨著氫氣含量的進(jìn)一步增加，溶解于溶劑中的氫氣已經(jīng)達(dá)到飽和，此時(shí)繼續(xù)增加氫氣分壓，并不能有力地促進(jìn)氫化反應(yīng)的進(jìn)行，故選擇氫氣分壓為4 MPa較為合適[29]。

圖6 氫氣分壓對(duì)超臨界CO2氫化PE的影響

最終確定超臨界CO2氫化條件為：催化劑添加量為4%，氫化溫度分別為60 ℃，氫氣分壓為4 MPa，CO2分壓為7 MPa，攪拌速度為300 r/min的，氫化時(shí)間為120 min。在此條件下，所得磷脂酰乙醇胺碘值含量下降，穩(wěn)定性有所增強(qiáng)。

2.3 磷脂酰乙醇胺的培化工藝

探究了物料比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、三乙胺添加量對(duì)聚乙二醇單甲醚2000酰氯轉(zhuǎn)化率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

從圖7中可以看出，隨著氫化磷脂酰乙醇胺的含量逐漸增加，聚乙二醇單甲醚2000酰氯的轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)明顯增加的趨勢(shì)，當(dāng)物料比大于3.5∶1時(shí)，轉(zhuǎn)化率上升緩慢，原因可能為體系中的聚乙二醇單甲醚2000酰氯充分發(fā)生反應(yīng)，相對(duì)而言加入過(guò)多的HSPE對(duì)反應(yīng)無(wú)較大影響。隨著溫度的升高，此時(shí)溫度促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率顯著增加[30]；當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率增加緩慢，同時(shí)過(guò)高的溫度會(huì)造成氫化磷脂酰乙醇胺的變性。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，分子之間更容易接觸，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率隨之增加。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，體系中的反應(yīng)物已充分反應(yīng)，濃度較低，即使延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間產(chǎn)物的產(chǎn)率也不會(huì)發(fā)生較大改變[31]。聚乙二醇單甲醚2000酰氯與HSPE反應(yīng)生成HCl，加入的三乙胺可以與HCl結(jié)合生成三乙胺鹽酸鹽，從而催化反應(yīng)的進(jìn)行。隨著三乙胺添加量的增加，聚乙二醇單甲酸2000酰氯轉(zhuǎn)化率逐漸增加，當(dāng)三乙胺用量為3 mL時(shí)，聚乙二醇單甲醚2000酰氯的轉(zhuǎn)化率為83.64%，隨著三乙胺添加量的進(jìn)一步增加，其轉(zhuǎn)化率增加較小[32]。因此，MPEG2000-HSPE的最佳培化條件為：物料為3.5∶1，溫度為50 ℃，反應(yīng)時(shí)間為4 h，三乙胺添加量為3 mL。

圖7 反應(yīng)條件對(duì)聚乙二醇單甲醚2000轉(zhuǎn)化率的影響

2.4 MPEG2000-HSPE產(chǎn)品紅外分析結(jié)果

對(duì)磷脂酰乙醇胺、氫化磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇單甲醚2000酰氯及MPEG2000-HSPE四種載體進(jìn)行FT-IR特征吸收峰檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示。

2.5 培化磷脂酰乙醇胺的理化特性

2.5.1 MPEG2000-HSPE的分散性

乳狀液中分散相會(huì)自發(fā)地向著凝聚的方向前進(jìn)，為了維持體系的穩(wěn)定需要借助分散力的存在來(lái)阻止，因此，實(shí)驗(yàn)應(yīng)對(duì)產(chǎn)品的分散性能進(jìn)行測(cè)定。表1是在λ=700 nm，b=1 cm條件下，MPEG2000-SPE和MPEG2000-HSPE的吸光度的測(cè)定結(jié)果。吸光度越小一定程度上也就意味著物質(zhì)的分散性能越好[32]。從表1可以看出MPEG2000-HSPE比MPEG2000-SPE的吸光度要小很多，說(shuō)明MPEG2000-HSPE具有更好的分散性，改性方法有效的改變了粒子表面性質(zhì)，降低了界面能，避免粒子之間的聚集，最終可以維持乳化液穩(wěn)定性。

2.5.2 MPEG2000-HSPE的碘值含量

碘值常用來(lái)反映化合物的氧化穩(wěn)定性，不飽和程度越小，碘值越低，樣品就越穩(wěn)定。由表2可以看出，MPEG2000-HSPE比傳統(tǒng)的脂質(zhì)體原料MPEG2000-SPE飽和程度更高，抗氧化能力更強(qiáng)。

表2 MPEG2000-SPE和MPEG2000-HSPE碘值比較

2.5.3 MPEG2000-HSPE的乳化性

乳化力是衡量表面活性劑乳化能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)，表3為MPEG2000-SPE和MPEG2000-HSPE使水-正己烷兩相分開(kāi)10 mL所耗費(fèi)的時(shí)間[34]。從表3中可以看出，MPEG2000-HSPE的分離時(shí)間遠(yuǎn)超于MPEG2000-SPE，說(shuō)明改性后培化的磷脂酰乙醇胺乳化穩(wěn)定性更好。

表3 MPEG2000-SPE和MPEG2000-HSPE乳化性比較

3 結(jié)論

將非轉(zhuǎn)基因的大豆?jié)饪s磷脂生產(chǎn)腦磷脂過(guò)程中的副產(chǎn)物進(jìn)行純化，成功得到了純度高的磷脂酰乙醇胺。將純化后的產(chǎn)物進(jìn)行超臨界CO2氫化，在催化劑用量為4%，氫化時(shí)間為120 min，較低溫度條件下，所得產(chǎn)品的碘值為23.27 gI/100g， 且產(chǎn)品TFAs含量較低。利用氫化后的產(chǎn)物與聚乙二醇2000酰氯合成MPEG2000-HSPE，轉(zhuǎn)化率為84.63%。紅外光譜分析表明，聚乙二醇單甲醚2000酰氯與HSPE成功聚合，產(chǎn)生了—NH，產(chǎn)物中存在MPEG2000-HSPE。與傳統(tǒng)藥用輔料MPEG2000-SPE相比，最終產(chǎn)物碘值含量低、分散性能好、狀態(tài)穩(wěn)定、親水性增強(qiáng)。