基于化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合甘油二酯和甘油三酯分析的橄欖油等級(jí)的鑒別

趙善貞， 封卓然， 包 明， 伊雄海， 鄧曉軍， 郭德華， 丁 濤， 柳 菡

(上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心1，上海 200135) (南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心2，南京 210000)

橄欖油屬木本植物油，是由新鮮的油橄欖果實(shí)直接冷榨而成的，被認(rèn)為是迄今所發(fā)現(xiàn)的油脂中最適合人體營(yíng)養(yǎng)的油脂。橄欖油的主要成分是甘油三酯(Triglycerides，TAGs)和甘油二酯(Diacylglycerol，DAGs)，其中甘油三酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)95%～98%[1]，其余成分包括游離脂肪酸、甾醇、酚類物質(zhì)等，這些物質(zhì)在橄欖油在加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定變化。為了對(duì)橄欖油的真實(shí)屬性進(jìn)行確認(rèn)，歐盟[2]和國(guó)際橄欖油理事協(xié)會(huì)[3]早在90年代就建立了橄欖油和橄欖果渣油特性及分析方法法規(guī)，我國(guó)在2019年也制定了橄欖油分級(jí)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)[4]。

除了制定與施行各種標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)以外，有效的橄欖油摻偽檢測(cè)手段也尤為重要，橄欖油的真?zhèn)舞b別[5-6]和質(zhì)量分級(jí)檢測(cè)[7-9]一直以來(lái)都是國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)的大力發(fā)展，采用主成分分析和聚類分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，研究食品化學(xué)測(cè)量值與體系的狀態(tài)之間建立聯(lián)系成為一個(gè)研究熱點(diǎn)[10-13]，國(guó)內(nèi)針對(duì)油脂化學(xué)計(jì)量學(xué)現(xiàn)有報(bào)道涉及橄欖油的微量元素[14-15]、脂肪酸[16]、風(fēng)味物質(zhì)[17]，揮發(fā)性特征成分[18]等。國(guó)外對(duì)油脂的真實(shí)屬性進(jìn)行確認(rèn)，也建立了較多計(jì)量學(xué)分析方法[19]。對(duì)不同產(chǎn)地、品種橄欖油的鑒別[20-22]；不同種類油脂或者摻假鑒別[23-27]，方法多采用橄欖油中的TAGs、DAGs結(jié)合甾醇類，脂肪酸等的檢測(cè)，并進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，未有僅采用TAGs、DAGs進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析的報(bào)道。而針對(duì)對(duì)不同等級(jí)橄欖油中的鑒別有紫外吸收光譜分析[28]，毛細(xì)管電泳法[29]，甘油二酯和脂肪酸之間的比例[30]，以及甘油二酯同分異構(gòu)體之間的差異[31]等。采用紫外吸收光譜分析方法，影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度的因素較多；毛細(xì)管電泳法方法直接通過(guò)不同等級(jí)橄欖油的電子影像分析圖差異來(lái)進(jìn)行PCA分析，方法對(duì)圖譜要求較高；而采用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定橄欖油中的甘油二酯和脂肪酸含量，前處理通常需要衍生，較為繁瑣。本方采用高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離源-質(zhì)譜/質(zhì)譜法對(duì)初榨橄欖油和精煉橄欖油中的DAGs和TAGs進(jìn)行測(cè)定，樣品經(jīng)稀釋后直接上機(jī)分析，根據(jù)測(cè)得的DAGs以及TAGs的母離子、子離子進(jìn)行定性分析，推測(cè)可能的DAGs以及TAGs類型，再對(duì)各類型的DAGs和TAGs進(jìn)行定量分析，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)初榨橄欖油和精練橄欖油進(jìn)行等級(jí)鑒別，并找出差異性物質(zhì)。現(xiàn)有報(bào)道中，通過(guò)TAGs和DAGs含量差異結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)橄欖油進(jìn)行等級(jí)鑒別的方法較為少見(jiàn)，本方法前處理方法簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)便，可為橄欖油等級(jí)鑒別提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈，丙酮 (色譜純)，0.45 μm 濾膜，有機(jī)系。已確認(rèn)屬性的16種初榨橄欖油和26種精煉橄欖油樣品，均收集于國(guó)內(nèi)外各橄欖油企業(yè)，5種未知屬性的橄欖油作為測(cè)試樣品對(duì)建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證。本方法中初榨橄欖油為1～16號(hào)樣品，精煉橄欖油為17～42號(hào)樣品，測(cè)試樣品為S1～S5號(hào)樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

API 4000液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀，配有APCI源。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取(0.5±0.001)g 試樣于10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，制備成5%的樣品溶液，經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀進(jìn)行定性和定量分析。

1.3.2 液相色譜條件

借鑒何榕等[32]的方法并稍作修改。色譜柱：Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，粒徑5 μm) 3根串聯(lián)；流動(dòng)相：丙酮/乙腈(50∶50)；等度洗脫；洗脫時(shí)間：120 min；流速： 0.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

正離子模式；質(zhì)荷比(m/z)范圍：300～1 050；APCI源溫度：250 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理與化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

采用SPSS 24.0 軟件對(duì)測(cè)得的DAGs以及TAGs數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并計(jì)算不同等級(jí)橄欖油中DAGs、TAGs的組內(nèi)方差和組間方差。將整理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到SIMCA 14.0軟件中進(jìn)行PCA、PLS-DA分析，并進(jìn)行置換檢驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證模型的可靠性。采用Metaboanalyst 6.0進(jìn)行HCA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAGs以及TAGs的定性和定量分析

含有長(zhǎng)鏈脂肪酸的DAGs、TAGs，隨著烴基碳鏈的增多極性越來(lái)越弱，而APCI源適用于弱極性化合物的檢測(cè)，因此這里采用APCI源對(duì)DAGs和TAGs進(jìn)行分析。DAGs和TAGs在APCI源中主要形成3種類型的碎片離子： ?；x子[RCO]+、單?；视碗x子[M+H-RCOOH-RCO]+，以及二酰基甘油離子[M+H-RCOOH]+等。根據(jù)這些碎片離子峰的特征，可以推測(cè)甘油三酯的結(jié)構(gòu)。

在質(zhì)荷比(m/z)300～1 050內(nèi)對(duì)試樣進(jìn)行全掃描后，參考已有文獻(xiàn)[33]中DAGs以及TAGs的母離子，對(duì)掃描范圍內(nèi)的母離子的質(zhì)荷比進(jìn)行提取。根據(jù)提取到的母離子、子離子，和已有報(bào)道的DAGs以及TAGs的母離子以及子離子進(jìn)行比對(duì)，推測(cè)出可能的DAGs以及TAGs的類型。本方法檢測(cè)到的橄欖油中的DAGs包括LL、OL、OO、OS等DG，TAGs包括LLL、OLLn、OLL、OOLn、POLn、PLnP、OOL、POL、OOO、POO、POP、OMoO等，本方法檢測(cè)到的橄欖油中的甘油二酯以及甘油三酯見(jiàn)表1。

表1 本方法檢測(cè)到的橄欖油中的甘油二酯以及甘油三酯

根據(jù)初榨橄欖油和精煉橄欖油的定性分析結(jié)果，提取各類型的DAGs以及TAGs，對(duì)DAGs以及TAGs進(jìn)行定量分析。以歸一化法計(jì)算各DAGs以及TAGs相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，2種等級(jí)橄欖油中DAGs以及TAGs的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)表2。

表2 兩種等級(jí)橄欖油中DAGs以及TAGs的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 不同等級(jí)橄欖油的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.2.1 DGs以及TAGs的PCA分析以及PLS-DA分析

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)以及偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。方法首先以本文中所檢測(cè)到的所有DAGs以及TAGs的響應(yīng)值為變量進(jìn)行分析。兩種等級(jí)橄欖油等級(jí)鑒別的PCA圖及PLS-DA圖如圖1所示，可以看出初榨橄欖油樣品位于圖1右下側(cè)，精煉橄欖油樣品位于圖1的左上側(cè)，但是兩者之間分界不明顯，部分橄欖油在等級(jí)差異分析中存在難以鑒別的情況。

圖1 橄欖油等級(jí)鑒別的PCA圖及PLS-DA圖

2.2.2 數(shù)據(jù)顯著性差異分析

主成分分析的實(shí)際應(yīng)用中，采取的是變量變換手段，最終目的就是為了根據(jù)實(shí)際的情況，選取幾個(gè)幾乎可以涵蓋所有總體信息的主成分，以達(dá)到降維的目的，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步的分析[34]。這里對(duì)兩種等級(jí)橄欖油中各DAGs和TAGs采用假設(shè)檢驗(yàn)(hypothesis testing)[35]，進(jìn)行顯著性差異分析。計(jì)算不同等級(jí)橄欖油中DAGs和TAGs中各變量的F值和P值。F值是各組分組間方差和組內(nèi)方差的比率，F(xiàn)值可以用來(lái)計(jì)算各個(gè)變量對(duì)給定組分的貢獻(xiàn)度。F值越大，表示變量之間的差異性越大。另一個(gè)參數(shù)P值為F值的倒數(shù)，也用于表示分組錯(cuò)誤的可能性。P<0.05時(shí)，該變量之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01時(shí),變量之間有極顯著差異。對(duì)上述初榨橄欖油和精煉橄欖油DAGs、TAGs各組分的峰面積的組間方差和組內(nèi)方差進(jìn)行計(jì)算，求出各變量的F值以及P值，對(duì)F值由大到小，即P值由小到大進(jìn)行排序，甘油二酯、甘油三酯的F值和P值，由表3可以看出，DAGs中的LL、OO、OL以及TAGs中的OLLn、LLL、OOL以及OLL的P<0.05。這表明這些DAGs和TAGs存在顯著差異，和不同等級(jí)橄欖油的等級(jí)鑒別關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。

表3 甘油二酯、甘油三酯的F值和P值

2.2.3 有顯著性差異的DGs和TAGs的PCA分析以及PLS-DA分析

采用所有檢測(cè)到的的DAGs以及TAGs進(jìn)行PCA和PLS-DA分析效果并不理想，因此這里取上述經(jīng)顯著性差異分析后，P<0.05的橄欖油DAGs以及TAGs組分，即DAGs中的LL、OO、OL以及TAGs中的LLL、OLLn、OOL、OLL進(jìn)行PCA以及PLS-DA分析。兩種等級(jí)橄欖油等級(jí)鑒別的PCA圖及PLS-DA圖如圖2所示，給出采用有顯著性差異的DGs和TAGs分析的PCA圖(圖2a)以及PLS-DA圖(圖2b)。經(jīng)過(guò)顯著性差異分析后，2種不同等級(jí)橄欖油之間分離度增加， 樣品組內(nèi)可得到較好的聚類分離效果，不同等級(jí)橄欖油在2個(gè)模型中的分布情況十分相似。PLS-DA作為有監(jiān)督的模式判別模型，具有一定的數(shù)據(jù)過(guò)擬合風(fēng)險(xiǎn)，需要對(duì)建立的模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)。作為一個(gè)可靠的有監(jiān)督模型，Q2回歸線在y軸上的截距要小于0。初榨橄欖油的確證模型中，R2回歸線在y軸上的截距為-0.003 27；Q2回歸線在y軸上的截距為-0.115；精煉橄欖油的確證模型中，R2回歸線在y軸上的截距為0.003 6；Q2回歸線在y軸上的截距為-0.105，2個(gè)確證模型的Q2均小于0；這表明本方法建立的PLS-DA模型是可靠的。

圖2 橄欖油等級(jí)鑒別的PCA圖及PLS-DA圖

圖3 基于DAGs和TAGs的2種等級(jí)橄欖油鑒別的聚類分析熱圖

2.2.4 聚類分析

聚類分析(HCA)是聚類算法的一種，通過(guò)計(jì)算不同類別數(shù)據(jù)點(diǎn)間的相似度來(lái)創(chuàng)建1棵有層次的嵌套聚類樹。本方法對(duì)具有顯著性差異的DAGs和TAGs，采用HCA對(duì)進(jìn)行聚類和評(píng)估變量。基于DAGs和TAGs的兩種等級(jí)橄欖油鑒別的聚類分析熱圖如圖3所示，由圖3可以看出，通過(guò)HCA分析，樣品被分為2類，且均可正確分類。由此可見(jiàn)，本方法采用PCA和PLS-DA建立的橄欖油鑒別方法是可靠的。

2.2.5 特征化合物的確定

在PLS-DA分析中，自變量投影重要性指標(biāo)(VIP)被用于判斷單個(gè)自變量在解釋因變量時(shí)的重要性，是PLS模型的精度分析以及影響機(jī)制。對(duì)有顯著差異的TAGs和DAGs建立的PLS-DA模型，其VIP值進(jìn)行考察，可以看出LL、OLLn、LLL、OO的VIP值大于1，是橄欖油等級(jí)鑒別模型的重要變量。TAGs和DAGs中的LL、OLLn、LLL、OO在2種橄欖油中的相對(duì)含量差異較大，在2種等級(jí)的橄欖油鑒別中起著重要作用。

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)市售的5個(gè)精煉橄欖油樣品進(jìn)行檢測(cè)后，采用建立的PCA和PLS-DA模型對(duì)樣品進(jìn)行分類，橄欖油樣品都和精煉橄欖油的位置更接近，因此將該5個(gè)樣品歸類為精煉橄欖油，和樣品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)一致。

3 結(jié)論

本方法采用HPLC-APCI-MS/MS法對(duì)不同等級(jí)橄欖油中的DAGs以及TAGs進(jìn)行定量測(cè)定。建立了不同等級(jí)橄欖油的PCA以及PLS-DA鑒別模型。結(jié)果表明DAGs中的LL、OO，TAGs中的LLL、OLLn是橄欖油等級(jí)鑒別模型的重要變量，這4種DAGs以及TAGs在精煉橄欖油中的含量高于其在初榨橄欖油中的含量。采用HAC可以對(duì)橄欖油進(jìn)行準(zhǔn)確分類，可為不同等級(jí)橄欖油等級(jí)鑒定提供新思路。