自擬補腎祛瘀方對多囊卵巢綜合征模型大鼠的作用及機制研究*

牛永莉，王艷，孔麗，謝廣妹

（1.酒泉市人民醫院 生殖醫學科，甘肅 酒泉 735000；2.甘肅省婦幼保健院 生殖中心，甘肅 蘭州 730050）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）為育齡女性常見病，發病率約8%[1]。PCOS 是一種生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內分泌紊亂綜合征，目前認為與雄激素及促黃體生成素異常、胰島素抵抗等多種因素有關[2]。PCOS 屬中醫“閉經”“不孕”范疇，以腎功能失調為本，痰濁、血淤為標，中醫治療宜補腎為主，祛瘀為輔[3]。以往研究表明[4]，中醫治療PCOS 費用低廉、不良反應少且無絕對用藥禁忌，在PCOS 的臨床治療中受到重視。研究認為[5]，PCOS 的發生與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）介導的核因子κB（nuclear factor κB, NF-κB）/核因子IκB（inhibitor of NF-κB,IκBα）信號通路激活有關。其中，NF-κB 有多項調控功能，調控TNF-α/NF-κB/IκBα 信號通路可成為PCOS 防治的新靶點，但目前相關的研究較少。本研究采用自擬補腎祛瘀方治療PCOS 并分析其對TNF-α/NF-κB/IκBα 信號通路的影響，以期明確其治療PCOS 的可能作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物80 只SPF 級SD 雌性大鼠，6 周齡，體重（180±10）g[由中國科學院上海藥物研究所提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2020-0005]。喂養條件：溫度20℃、濕度50%，每日喂新鮮水及飼料。

1.1.2 實驗試劑和藥物TNF-α 抗體、NF-κB（P65）抗體及IκBα 抗體（英國Abcam 公司），鼠抗人β-actin（生工生物工程上海股份有限公司），羊抗鼠二抗、DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），SYBP?Premix Ex TaqTM（日本TaKaRa 公司），PCR 引物（寶生物工程大連有限公司），TRIzol（美國英杰生命技術有限公司），TBST 試劑（上海科拉曼試劑有限公司）。補腎化瘀方（酒泉市人民醫院中醫藥劑室配置），達英-35（拜耳醫藥保健有限公司），來曲唑（大連美侖生物技術有限公司），羧甲基纖維素鈉、水合氯醛、0.9%氯化鈉溶液（北京博爾邁生物技術有限公司）。

1.1.3 實驗儀器臺式高速離心機（美國Sigma 公司），電泳儀（美國BIO-RAD 公司），實時熒光定量PCR 儀、PCR 擴增儀、恒溫箱（美國Thermo 公司），顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），酶標儀（美國Benchmark 公司），血糖儀（德國羅氏診斷有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型復制80 只大鼠隨機分為對照組20 只、模型復制組60 只。采用來曲唑法復制模型：來曲唑灌胃1 mg/（kg·d），連續28 d，模型復制組給予高脂高糖飼料和9%葡萄糖水。模型復制成功后分為模型組、西藥組及聯合組，每組20 只。

1.2.2 藥物干預對照組和模型組根據大鼠體重給予1 mL/（kg·d）氯化鈉溶液灌胃，參考《中藥藥理研究方法學》[6]換算用藥劑量。自擬補腎祛瘀方組成：女貞子、墨旱蓮各15 g，菟絲子、山茱萸、丹參、川芎、赤芍、桃仁、紅花各10 g，由醫院中醫藥劑室加水煎煮成湯劑，湯劑終濃度為1 g/mL。聯合組每天根據體重給予補腎祛瘀湯劑11 g/kg 和4.5 mg/kg 二甲雙胍灌胃，西藥組僅給予4.5 mg/kg 二甲雙胍灌胃，聯合組與西藥組均灌胃28 d。

1.2.3 大鼠體重檢測藥物干預前及藥物干預28 d 后稱量各組大鼠體重，比較藥物干預前后大鼠體重變化。

1.2.4 大鼠性激素水平檢測大鼠于16 周齡、動情間期當晚20 點開始禁食，至次日早晨8 點空腹取腹主動脈血5～8 mL，3 500 r/min離心15 min，取上清液，置入-20℃冰箱冷凍保存待測。參照放射免疫法試劑盒說明書測定睪酮（T）、促卵泡激素（FSH）、黃體生成素（LH）的水平。抽血稱重后采用脊椎脫臼法處死所有大鼠，取大鼠卵巢組織待測。

1.2.5 Western blotting檢測大鼠卵巢組織中TNF-α、NF-κB、IκBα 蛋白相對表達量剪碎30 mg 卵巢組織，加1 mL PBS，10 000 r/min、4℃下離心1 min，洗凈組織上的血污及黏液等。加300 μL 蛋白裂解液，研磨后置于冰上20 min 至細胞裂解。12 000 r/min、4℃下離心15 min，所得上清液即為全蛋白提取液，置于-80℃冷凍保存備用。提取蛋白液，電泳、轉膜、封閉，取出PVDF 膜放入TBST 中漂洗3 次，分別加入TNF-α 抗體、NF-κB（P65）抗體、IκBα 抗體及鼠抗人β-actin，震蕩過夜。取出膜，放入TBST 中漂洗3 次后置于二抗中震蕩2 h。放入TBST 中漂洗3 次，滴加顯色液，緊密結合膜蛋白面與膠片，強曝光5 min 左右，用Image Quant 350 成像系統掃描并保存圖像，分析TNF-α、NF-κB、IκBα 蛋白相對表達量。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測大鼠卵巢組織中TNF-α、NF-κB、IκBα mRNA 相對表達量洗凈研缽等器皿，用雙蒸水和焦碳酸二乙酯水分別沖洗，于180℃下烘烤4 h 去除RNA 酶。切取50～100 mg 組織在研缽中研磨成粉，將粉末移至無RNA 酶的EP 管中，加1 mL TRIzol 后混勻。靜置5 min 后加入氯仿200 μL，震蕩15 s 混勻，靜置5 min，4℃下離心15 min。待EP 管中液體分層后，用100 μL 移液槍將上層液體吸到新的無RNA酶的EP 管中，并加入等體積異丙醇，混勻后靜置10 min 并再次離心10 min。EP 管底部白色物質即為RNA，倒掉管中液體后加入1 mL 75%乙醇，顛倒EP 管數次，離心5 min。倒掉上清液，用移液槍吸凈管底液體，靜置5 min 干燥。加入30～50 μL DEPC 水并用移液槍吹打使RNA 充分溶解。取2 μL總RNA，凝膠電泳檢測完整性。各組大鼠總RNA 的電泳圖中可見明顯2 個條帶，根據遷移率分別是18 S 和28 S，且電泳圖中無明顯雜帶和向前拖尾的現象，說明RNA 提取成功，完整性較高，純度滿足后續PCR 擴增要求。參照TaKaRa試劑盒說明書配制逆轉錄體系20 μL（5×PrimeScriptTMBuffer 4 μL、Total RNA 4 μL、RNase Free dH2O 12 μL），37℃15 min，85℃5 s，4℃30 min 獲取cDNA。qRT-PCR 反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，95℃退火5 s、60℃延伸30 s，40 個循環，循環結束后95℃延伸15 s。引物序列：①TNF-α：正向5'-TCTCTTCAAGGGACAA GGCT-3'，反 向5'-TCCTGGTATGAAATGGCAAA-3'，引物長度78 bp；②NF-κB：正向5'-GCCTCATCCAC ATGAACTTG-3'，反向5'-CGCTTCTTCACACACTGG AT-3'，引物長度120 bp；③IκBα：正向5'-CTGTACG CCCCAGCATCT-3'，反向5'-GCACCCAAAGTCACCAA G-3'，引物長度144 bp；④β-actin：正向5'-CGGTCA GGTCATCACTATCG-3'，反向5'-TTCCATACCCAGGA AGGAAG-3'，引物長度79 bp。以β-actin 為內參，計算各組ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。目的基因相對表達量用2-ΔΔCt表示。

1.2.7 免疫組織化學檢測大鼠卵巢組織中TNF-α、NF-κB、IκBα 蛋白陽性表達卵巢組織常規固定、石蠟包埋、切片（厚度4 μm），脫蠟止水，5%的牛血清白蛋白封閉10 min。滴加一抗后4℃下過夜；滴加二抗后37℃下孵育20 min。蘇木精復染2 min，脫水后常規透明、封片，顯微鏡下拍照，取5 個不同高倍鏡視野，IPP 6.0 軟件分析圖像，記錄陽性細胞平均光密度（OD）值，取3 次平均值作為最終結果，OD 值越高表示陽性表達率越高。陽性判定：TNF-α、NF-κB、IκBα 以細胞核中可見棕黃或棕褐色顆粒為陽性表達。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，進一步兩兩比較采取LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠藥物干預前后體重比較

各組大鼠藥物干預前體重比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠藥物干預28 d 后體重比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，模型組的體重高于另外3 組（P＜0.05），西藥組高于聯合組和對照組（P＜0.05），聯合組高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠藥物干預前及藥物干預28 d后的體重比較（n=20，g，±s）

表1 各組大鼠藥物干預前及藥物干預28 d后的體重比較（n=20，g，±s）

注：①與模型組比較，P ＜0.05；②與西藥組比較，P ＜0.05；③與對照組比較，P ＜0.05。

藥物干預28 d后210.78±10.33①②231.16±15.17 225.65±13.02①219.32±11.62①②③5.150 0.003組別對照組模型組西藥組聯合組F 值P 值藥物干預前190.54±8.11 189.18±9.13 188.69±10.14 190.88±10.52 0.245 0.865

2.2 各組大鼠血清性激素水平比較

各組大鼠血清T、FSH、LH 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，模型組血清T、FSH、LH 水平高于另外3 組（P＜0.05），西藥組高于聯合組與對照組（P＜0.05），聯合組高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清性激素水平比較 （n=20，±s）

表2 各組大鼠血清性激素水平比較 （n=20，±s）

注：①與模型組比較，P ＜0.05；②與西藥組比較，P ＜0.05；③與對照組比較，P ＜0.05。

LH/（mIU/mL）34.51±6.78①②47.15±11.63 43.12±10.97①39.22±7.56①②③6.512 0.001組別對照組模型組西藥組聯合組F 值P 值T/（ng/dL）11.91±2.26①②17.5±5.76 15.87±4.98①13.66±4.21①②③5.999 0.001 FSH/（mIU/mL）9.94±2.82①②14.79±4.63 13.08±3.99①11.71±3.41①②③6.343 0.001

2.3 各組大鼠TNF-α、NF-κB、IκBα 蛋白相對表達量比較

各組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB、IκBα 蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，模型組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB 蛋白相對表達量高于另外3 組，IκBα 蛋白相對表達量低于另外3 組（P＜0.05）；西藥組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB 蛋白相對表達量高于聯合組與對照組（P＜0.05），同時聯合組高于對照組（P＜0.05）；西藥組大鼠卵巢組織IκBα 蛋白相對表達量低于聯合組與對照組（P＜0.05），同時聯合組低于對照組（P＜0.05）。見圖1 和表3。

表3 各組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB、IκBα蛋白相對表達量的比較 （n=20，±s）

表3 各組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB、IκBα蛋白相對表達量的比較 （n=20，±s）

注：①與模型組比較，P ＜0.05；②與西藥組比較，P ＜0.05；③與對照組比較，P ＜0.05。

IκBα蛋白相對表達量0.71±0.22①②0.46±0.12 0.55±0.16①0.61±0.20①②③6.495 0.001組別對照組模型組西藥組聯合組F 值P 值TNF-α蛋白相對表達量0.38±0.07①②1.45±0.21 1.13±0.19①0.67±0.14①②③6.416 0.001 NF-κB蛋白相對表達量0.53±0.18①②0.81±0.26 0.73±0.24①0.64±0.20①②③5.867 0.001

圖1 各組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB、IκBα蛋白的表達

2.4 各組大鼠TNF-α、NF-κB、IκBα mRNA 相對表達量的比較

各組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB、IκBα mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，模型組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB mRNA 相對表達量高于另外3 組，IκBα mRNA 相對表達量低于另外3 組（P＜0.05）；西藥組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB mRNA 相對表達量高于聯合組與對照組（P＜0.05），聯合組高于對照組（P＜0.05）；西藥組大鼠卵巢組織IκBα mRNA 相對表達量低于聯合組與對照組（P＜0.05），聯合組低于對照組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠TNF-α、NF-κB、IκBα mRNA相對表達量比較 （n=20，±s）

表4 各組大鼠TNF-α、NF-κB、IκBα mRNA相對表達量比較 （n=20，±s）

注：①與模型組比較，P ＜0.05；②與西藥組比較，P ＜0.05；③與對照組比較，P ＜0.05。

TNF-α mRNA 0.67±0.21①②1.01±0.34 0.90±0.29①0.76±0.24①②③5.990 0.001組別對照組模型組西藥組聯合組F 值P 值NF-κB mRNA 0.53±0.18①②0.83±0.24 0.72±0.20①0.61±0.19①②③6.498 0.001 IκBα mRNA 0.58±0.20①②0.39±0.11 0.44±0.13①0.52±0.15①②③6.750 0.001

2.5 各組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB、IκBα 的OD值比較

各組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB、IκBα 的OD 值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，模型組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB 的OD 值高于另外3 組，IκBα 的OD 值低于另外3 組（P＜0.05）；西藥組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB 的OD 值高于聯合組與對照組（P＜0.05），聯合組高于對照組（P＜0.05）；西藥組大鼠卵巢組織IκBα 的OD 值低于聯合組與對照組（P＜0.05），聯合組低于對照組（P＜0.05）（見表5）。各組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB、IκBα 陽性表達見圖3～5。

表5 各組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB、IκBα的OD值比較 （n=20，±s）

表5 各組大鼠卵巢組織TNF-α、NF-κB、IκBα的OD值比較 （n=20，±s）

注：①與模型組比較，P ＜0.05；②與西藥組比較，P ＜0.05；③與對照組比較，P ＜0.05。

IκBα 0.78±0.24①②0.44±0.16 0.59±0.17①0.67±0.19①②③6.302 0.001組別對照組模型組西藥組聯合組F值P值TNF-α 0.40±0.14①②0.76±0.23 0.65±0.21①0.52±0.16①②③11.165 0.001 NF-κB 0.49±0.15①②0.74±0.23 0.66±0.21①0.58±0.17①②③6.195 0.001

圖3 各組大鼠卵巢組織TNF-α蛋白陽性表達 （免疫組織化學×200）

圖4 各組大鼠卵巢組織NF-κB蛋白陽性表達 （免疫組織化學×200）

圖5 各組大鼠卵巢組織IκBα蛋白陽性表達 （免疫組織化學×200）

3 討論

研究發現[7]，PCOS 易增加子宮內膜癌的發病風險，積極治療PCOS 對女性月經失調、不孕癥及各種遠期并發癥有較好的預防作用。由于對PCOS發病機制認識的局限性，目前國內外尚無統一的規范治療方案，臨床治療多以促排卵等對癥處理為主，但存在停藥復發或治療無效等問題。西藥基礎上聯合中醫藥治療PCOS 具有不良反應少，且能有效改善患者癥狀，受到臨床歡迎。

3.1 自擬補腎祛瘀方對PCOS 大鼠性激素水平的影響

本研究通過來曲唑法復制大鼠PCOS 模型。來曲唑可促進促性腺激素持續分泌，刺激LH、FSH持續合成，使LH、FSH 無法達到排卵高峰，誘發排卵功能障礙，造成卵巢多囊樣改變[8]。本研究結果顯示，藥物干預后，模型組大鼠體重增加最為顯著，高于另外3 組；西藥組高于聯合組和對照組，聯合組高于對照組。此外，模型組血清T、FSH、LH 高于對照組；且與模型組相比，血清T、FSH、LH 明顯降低，其中聯合組更低，但仍高于對照組。這提示PCOS 會造成血清T、FSH、LH 水平的升高，西藥治療可促進血清T、FSH、LH 降低，而聯合自擬補腎化瘀方治療后，血清T、FSH、LH 會進一步降低。中醫認為[9]，PCOS 病機主要為腎虛、瘀血阻致胞宮，兩者互為因果，形成腎虛血瘀癥，補腎化瘀是PCOS 的主要治療思路。本研究所用自擬補腎化瘀方中，菟絲子、山茱萸補腎益精為君藥，女貞子、墨旱蓮共用為臣藥，可養肝腎、益精血；丹參、赤芍、桃仁活血養血為佐藥，補益而不留瘀；川芎、紅花解郁通達、活血祛瘀，為使藥。諸藥合用精充血足、氣血暢通則經自調，共奏補腎化瘀、活血調經之功[10-11]。現代藥理學研究表明[12-13]，菟絲子可以TNF-α 為靶點調控TNF-α/NF-κB，抑制PCOS 的炎癥反應，從而治療PCOS；墨旱蓮具有抗炎、調節免疫等功效，可通過對卵巢炎癥的抑制作用改善卵巢功能[14-15]；山茱萸的抗炎抑菌作用可有效改善PCOS 大鼠的胰島素抵抗，從而減輕炎癥及氧化應激，降低血清TNF-α 水平，促進卵巢功能的恢復[16]；丹參可通過對外周血單個核細胞NF-κB 活化及TNF-α 表達的影響來調控炎癥反應，且與NF-κB/IκBα 炎癥反應通路之間存在量效時效關系[17-18]。上述研究提示自擬補腎祛瘀方可能是通過對TNF-α/NF-κB/IκBα 炎癥通路的調控來改善卵巢循環與病理狀態，達到治療目的。

3.2 自擬補腎祛瘀方對PCOS 大鼠TNF-α/NF-κB/IκBα 信號通路的調控作用

為探討自擬補腎祛瘀方治療PCOS 的機制，本研究檢測大鼠卵巢組織的TNF-α、NF-κB、IκBα表達，結果顯示模型組大鼠卵巢組織的TNF-α、NF-κB 蛋白表達，mRNA 表達，OD 值均高于對照組，IκBα 蛋白表達，mRNA 表達，OD 值均低于對照組。與模型組相比，西藥組和聯合組卵巢組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達，mRNA 表達，OD 值均降低，其中聯合組更低，但仍高于對照組；與模型組相比，西藥組和聯合組卵巢組織IκBα 蛋白表達，mRNA 表達，OD 值均升高，其中聯合組更高，但仍低于對照組。上述結果表明自擬補腎化瘀方治療PCOS 可上調卵巢組織TNF-α、NF-κB 表達，下調IκBα 表達，PCOS 發病與NF-κB/IκBα 信號通路有關。國外研究表明[19]，細胞在正常生理情況下，NF-κB 與抑制蛋白IκBα 結合成無活性的三聚體并存在于細胞質中；TNF-α 升高會刺激IκBα 磷酸化后與NF-κB 解離，使NF-κB 進入細胞核并轉錄，誘發PCOS[20]。也有研究發現[21]，炎癥因子IκBα 是NF-κB/IκBα 信號通路的關鍵下游因子，抑制IκBα可阻斷該通路，改善PCOS。自擬補腎化瘀方可補益肝腎，活血化瘀，切中病機，并通過影響TNF-α調控的IκBα/NF-κB 信號通路來改善卵巢功能，且可對TNF-α、IκBα、NF-κB 多個靶點進行干預，最終促進性激素水平的恢復。本研究不足之處：PCOS 的發病過程復雜，自擬補腎祛瘀方治療PCOS可能不只對單一信號通路的調控發揮治療作用，其可能涉及的其他信號通路及靶點仍有待進一步探究。

綜上所述，自擬補腎化瘀方治療PCOS 可有效促進LH、FSH、T 等的恢復，且這一作用考慮與TNF-α 介導的NF-κB/IκBα 信號通路的調控有關。