基于生物信息學方法探討肛門濕疹差異基因的免疫浸潤及中藥預測分析

朱鳳儀 ，張濤 ，周小勇 （通信作者*）

（1.湖北中醫(yī)藥大學第一臨床學院，湖北 武漢 430000 ; 2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700）

0 引言

肛門濕疹（Anal eczema, AE）是指發(fā)生于肛門周圍皮膚，以瘙癢、潮濕、散在丘疹及滲液為主要表現(xiàn)的皮膚疾病[1]。AE的發(fā)病機制復雜[2]，多與生活環(huán)境、氣候條件等外在因素和感染、免疫、內分泌失調等內在因素相互作用有關[3]。當前對AE的治療多以抗組胺類藥物、糖皮質激素及對癥治療為主[4]，但因其易復發(fā)，遷延難愈多不易被患者接受。免疫因素在AE 的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，因此從免疫細胞浸潤對AE發(fā)病機制進行探討，對實現(xiàn)AE的精準治療有重要意義。故本次研究基于AE患者基因芯片，篩選差異表達基因，通過CIBERSORT反卷積算法，進行免疫細胞浸潤分析，以期為AE的免疫精準治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 AE基因芯片數(shù)據(jù)

登錄GEO基因芯片數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）， 以“Anal eczema”“Perianal Eczema”“Eczema”為關鍵詞檢索基因芯片數(shù)據(jù)及平臺文件，通過平臺文件將芯片數(shù)據(jù)轉化為基因名稱。

1.2 差異表達基因的確定

借助R軟件的“l(fā)imma”程輯包對AE及健康對照組的基因表達數(shù)據(jù)進行差異分析，以|logFC|≥ 2，P＜0.05為篩選條件[5]，以 logFC 的正負值代表基因的上調及下調表達，在R軟件中安裝“ggpubr”“ggplot2”“pheatamp”程輯包，繪制差異表達基因火山圖及熱圖，選取上調及下調排名前20的基因繪制偏差圖。

1.3 差異表達基因蛋白互作網(wǎng)絡及核心蛋白篩選

登錄 String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），選擇Multiple proteins，在搜索條目下輸入1.2獲取到的差異表達基因，限定物種為Homo Sapiens，最低交互評分設置為0.9，設置自動刪除游離基因，其余設置保持不變，構建PPI功能蛋白作用網(wǎng)絡，并繪制網(wǎng)絡圖。為篩選核心蛋白，將生成的蛋白相互作用條目Node1、Node2以及Combined-scorce導入到Cytoscape3.8.0，選擇APP條目下的CytoNCA插件進行網(wǎng)絡拓撲分析。

1.4 差異表達基因的GO、KEGG富集分析

基于R軟件對1.2中獲取到的EOA差異表達基因的細胞成分、分子功能、生物學過程以及信號通路進行富集分析。在Bioconductor（https://www.bioconductor.org/）網(wǎng)站安裝“Biocmanager”“org.Hs.eg.db”“Colorspace”“Stringi”“DOSE”“ClusterPr ofiler”“enrichplot”“Pathview”等程輯包。選擇物種為人（Homo spanies），設定P＜0.05，對 EOA 差異表達基因及l(fā)ogFC值進行富集分析，輸出富集結果并繪制圈圖。

1.5 獲取免疫浸潤矩陣

將GEO數(shù)據(jù)庫獲取到的基因芯片數(shù)據(jù)分組，登錄CIBERSORT數(shù)據(jù)庫獲取免疫細胞基因表達矩陣[6]。通過反卷積算法進行免疫浸潤分析，包括T細胞、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞等22中免疫細胞的矩陣，為獲取數(shù)據(jù)的準確性，設定P＜0.05，循環(huán)次數(shù)為100次。

1.6 免疫矩陣的主成成分分析

為分析AE患者與健康對照組間的差異，通過R語言對對1.5中獲取的免疫浸潤矩陣進行主成成分分析，借助“ggplot2”程輯包繪制PCA圖。

1.7 免疫浸潤分析

通過R語言對納入樣本的UC與正常對照組的組織樣本進行22種免疫細胞浸潤分析，獲取AE與健康對照組免疫細胞差異情況及特征，繪制相關性熱圖及小提琴圖。

1.8 AE免疫細胞浸潤潛在中藥預測

登錄Coreminemedical數(shù)據(jù)庫（https://www.coremine.com），將1.3中獲得關鍵靶基因及1.4中獲得到的免疫相關生物學過程輸入Coreminemedical，設置P＜0.05。繪制網(wǎng)絡圖。

2 結果

2.1 EOA差異表達基因結果

通過對GEO數(shù)據(jù)庫AE相關基因探針篩選，確定GSE63741基因芯片數(shù)據(jù)及GPL19471平臺文件作為本次研究對象。包括29名AE患者及30名健康對照組，共59個樣本的基因表達數(shù)據(jù)，獲得差異表達基因92個，其中49個上調基因，43個下調基因。選取上調及下調排名前20的差異基因繪制差異表達偏差圖和熱圖，見圖1A，圖1B，選取所有差異表達基因繪制火山圖，見圖1C。

圖1 差異表達基因的偏差圖熱圖及火山圖

2.2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡構建及關鍵蛋白篩選

在STRING網(wǎng)站構建差異表達基因蛋白互作網(wǎng)絡，去除游離基因后結果見圖2A。為篩選網(wǎng)絡關鍵蛋白，將得到的string_interactions.txt文件導入到Cytoscape3.8.0，選擇CytoNCA對網(wǎng)絡進行拓撲分析。篩選參數(shù)：介度中心性（Betweenness Centrality），緊 密 中 心 性（Closeness Centrality），節(jié) 度 中 心 性（Degree Centrality），特 征 向量（Eigenvector Centrality），局 部 連 通 性（Local Average Connectivity-based method LAC），網(wǎng)絡關鍵蛋白為 CCL2、CCND1、S100A7，見圖2B。

圖2 差異基因PPI網(wǎng)絡圖及網(wǎng)絡關鍵蛋白

2.3 GO及KEGG富集分析

通過R語言對AE差異表達基因進行GO功能及KEGG通路富集分析，GO共富集到137個生物學過程（BP）條目，免疫相關生物學過程涉及到角質細胞分化、皮膚角化等免疫相關途徑。KEGG通路富集到了6個通路結果，主要涉及金黃色葡萄球菌感染、雌激素信號通路、IL17信號通路。根據(jù)富集結果，各自選取排名前5的GO條目及KEGG通路，根據(jù)logFC值，繪制圈圖，見圖3A，3B。

圖3 差異基因富集結果圈圖

2.4 EOA的免疫分布特征

在CIBERSORT數(shù)據(jù)庫中獲得22中免疫細胞矩陣，通過反卷積法以P＜0.05，循環(huán)100次，共獲得59個可信樣本的免疫細胞浸潤矩陣，對免疫細胞浸潤矩陣的組成成分分析，結果顯示AE組與健康組見差異區(qū)分明顯，見圖4A。圖4B顯示了免疫細胞浸潤比例，左側30個為健康組織樣本，右側29個為AE組織樣本。結果顯示，單核細胞（Monocytes）在兩組間均呈現(xiàn)較高比例。靜息樹突狀細胞（Dendritic cells resting）、幼稚 CD4 T細胞（T cells CD4 naive）在AE組占比較高。記憶性B細胞（B cells memory）、活化NK細胞（NK cells activated）在正常組中占比較高。根據(jù)樣本中免疫細胞浸潤比例繪制熱圖，見圖4C。

圖4 AE的免疫分布特征

2.5 免疫浸潤差異分析

根據(jù)免疫細胞在不同組織間的差異表達量，以P＜0.05為標準對AE組及健康組的免疫浸潤差異進行可視化分析，繪制小提琴圖，見圖5，結果顯示，M1型巨噬細胞（Macrophages M1，P=0.01），靜息樹突狀細胞（Dendritic cells resting，P=0.021），活化的樹突狀細胞（Dendritic cells activated，P＜0.001），活化的肥大細胞（Mast cells activated，P＜0.001），在AE組織中表達明顯增加。記憶性 B 細胞（B cells memory，P=0.003），巨噬細胞M2（Macrophages M2，P＜0.001），在正常組織中表達明顯增加。

圖5 AE的免疫浸潤差異分析小提琴圖

2.6 免疫細胞相關性分析

為探究免疫細胞間是否相關，對22中免疫細胞進行相關性分析，見圖6，顏色越紅則正相關性越強，顏色越藍則負相關性越強。幼稚CD4 T細 胞（T cells CD4 naive） 與 CD8 T細 胞（T cells CD8）有較強的正相關（r=0.68），巨噬細胞M0（Macrophages M0）與單核細胞（Monocytes）有較強的正相關（r=0.39）。γT細胞（T cells gamma delta）與活化的NK細胞（NK cells activated）有較強的負相關（r=-0.39），幼稚B細胞（B cells naive）與漿細胞（Plasma cells）有較強的負相關（r=-0.35）。

圖6 EOA的免疫細胞相關性分析

2.7 AE免疫細胞浸潤中藥預測結果

通過Coreminemedical數(shù)據(jù)庫預測UC免疫細胞浸潤有效中藥，設置P＜0.05，結果顯示，黃柏、苦參、蒼術、連翹、梔子、生地黃、龍膽與AE免疫細胞浸潤關聯(lián)度較高，提示其可能作為治療AE的有效中藥通過調節(jié)免疫細胞及功能起到治療EOA的作用，見圖7。

圖7 EOA免疫浸潤中藥預測網(wǎng)絡圖

3 討論

隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展，高蛋白高熱量飲食的攝入，AE的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢[7]。肛門皮膚瘙癢、滲液等臨床癥狀典型，雖不危及生命，但病情遷延難愈，反復發(fā)作，嚴重影響了患者的生活質量[8]。AE的發(fā)病與局部炎性因子釋放，免疫變態(tài)反應密切相關。因此尋找新的免疫治療靶點對AE的診療具有重要意義。本次研究通過對AE差異表達基因的PPI網(wǎng)絡構建與富集分析，篩選出CCL2、CCND1、S100A7為關鍵靶基因。CCL2是由細胞分泌的信號蛋白，具有誘導免疫細胞定向趨化的功能[9]，研究表明[10]，CCL2可以在Fas配體的作用下活化，導致濕疹表皮角質化，加劇炎癥反應。CCND1為特異性周期蛋白，與細胞增殖密切相關[11]，在AE發(fā)病時，大量免疫細胞在發(fā)病部位浸潤增殖，CCND1介導免疫變態(tài)反應。S100A7是一種促炎蛋白，又被稱為銀屑素，最早發(fā)現(xiàn)于銀屑病患者血清中，與病情程度呈正相關[12]，研究表明[13]，S100A7的水平與銀屑病皮膚組織IL4、IL22、IL26表達正相關。目前有關S100A7與AE的相關性尚未有報道，這可能是AE的新的治療靶點。本次研究篩選到的關鍵靶基因在AE的診療上提供新的治療靶點與研究方向。

對AE差異表達基因的GO、KEGG富集結果顯示，涉及角質細胞分化、皮膚角化等免疫相關途徑；與金黃色葡萄球菌感染、雌激素信號通路、IL17信號通路密切相關。固有免疫功能的正常是避免濕疹發(fā)病的關鍵，GO富集到的角質細胞分化，皮膚角化等生物學過程是AE發(fā)病時主要的病理變化，皮膚角化指的是AE發(fā)病時肛周皮膚的炎性退行性病變[14]，角質細胞是構成表皮層的主要細胞成分，角質細胞分化是皮膚角化的基礎[15]，抑制肛周皮膚的角質化對治療AE有重要意義。由于肛門周圍皮膚位置的特殊性，致使其容易受到各種致病菌的感染。研究表明[16]，濕疹患者皮損部位的金黃色葡萄球菌密度要顯著高于非皮損部位，金黃色葡萄球菌感染是導致AE炎性病變的重要原因[17]。激素水平與濕疹的發(fā)病密切相關，研究表明[18]，女性患者濕疹的發(fā)病率顯著高于常人，雌激素的周期性波動會導致皮膚免疫及屏障功能降低，加重炎癥性皮膚病的病情程度。IL-17是Th17細胞的主要效應因子[19]，由活化的T細胞產(chǎn)生[20]，可刺激上皮細胞、成纖維細胞產(chǎn)生IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子導致皮膚炎癥反應[21]。GO及KEGG富集結果綜合顯示了AE的發(fā)病過程是由多種免疫功能及激素水平失調導致炎性因子的高表達的結果。

為探究免疫細胞浸潤在AE發(fā)病中的作用，采用反卷積法以P＜0.05為標準進行免疫細胞浸潤分析，M1型巨噬細胞，靜息樹突狀細胞，活化的樹突狀細胞等在AE組織中表達明顯增加。巨噬細胞位于胃腸道粘膜固有層中,受NF-κB調節(jié)，參與Th、Treg介導的免疫反應[22]。單核細胞受不同刺激后活化為M0、M1型或M2型巨噬細胞，M1型分泌促炎因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和趨化因子CXCL8、CXCL10，促進炎癥反應[23]，M2型分泌抑炎因子IL-10及TGF-β，抑制炎癥反應[24]。樹突狀細胞是起哨兵作用的抗原提呈細胞[25]，主要位于表皮固有層，受抗原刺激激活后，其樹突狀突起伸入上皮，交錯進入上皮細胞，粘附抗原和細菌，并釋放IL-2，誘導單純T細胞向Th1細胞分化，激活適應性免疫應答[26]。本次研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞M1在AE皮損組織中高表達，巨噬細胞M2型在正常組中高表達，表明本次免疫細胞浸潤預測的AE免疫分析具有一定的參考意義。

AE屬中醫(yī)學“濕疹”的范疇，濕熱是造成AE發(fā)病的重要原因，或因素體脾虛，濕邪內生；或因肆食肥甘厚味，損傷脾胃，內生濕熱，濕熱下注肛門發(fā)病；或因久居濕熱之地，外感六淫侵襲機體，濕熱之邪困遏肌表，發(fā)為AE。中醫(yī)藥在AE的診療上可以辨證論治，清熱利濕，祛風止癢，療效穩(wěn)定。本次研究將獲得到的AE關鍵靶基因及免疫生物學過程通過Coremine數(shù)據(jù)庫對潛在治療AE免疫浸潤相關的中藥進行預測，結果顯示，黃柏、苦參、蒼術、連翹、梔子、生地黃、龍膽出現(xiàn)頻次較大，黃柏、苦參可清熱利濕止癢，連翹、梔子清熱解毒，蒼術健脾燥濕，生地養(yǎng)陰生津，龍膽清熱瀉火。本次研究預測的中藥在臨床中皆在AE的治療上有著廣泛的應用，如復方黃柏液，苦參膠囊等，在臨床中治療AE取得了顯著的療效。

綜上所述，本次研究基于生物信息學的分析方法對AE的差異基因進行富集及免疫細胞浸潤機制分析，預測了潛在治療中藥，對后續(xù)的研究及中藥臨床應用具有一定的指導意義。