高產糖苷酶非釀酒酵母菌株篩選、鑒定及其發酵過程中酶活性變化

任學梅，姚紅紅，嚴幻汝，祝 霞,2，楊學山,2,

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

源自葡萄果實的香葉醇、芳樟醇、-松油醇等揮發性單萜類物質，具有多種花香和水果氣息，是決定干白葡萄酒品種香氣特征的關鍵性化合物。但它們多以無味的糖苷鍵合態香氣前體形式存在，其中雙糖苷約占80%以上，其次為單糖苷形式（約10%），三糖苷含量最低。鍵合態前體物可在發酵過程中由--葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）和其他糖苷酶的協同作用下水解釋放。在葡萄酒釀造過程中添加外源性--葡萄糖苷酶可能引發非特異性水解反應或形成不良風味，而使用可以分泌--葡萄糖苷酶的酵母菌作為發酵劑，能引發鍵合態品種香氣物質的充分釋放，提升葡萄酒的區域典型性和感官復雜性。與釀酒酵母（）不同，一些非釀酒酵母（non-）菌株可以分泌高活性的--木糖苷酶（EC 3.2.1.37）、--阿拉伯呋喃糖苷酶（EC 3.2.1.55）和--鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40），先裂解雙糖苷鍵生成相應的單萜基--葡萄糖苷，再通過--葡萄糖苷酶的作用釋放單萜，從而提高葡萄酒品種的香氣和風味。López等篩選出高產--葡萄糖苷酶和--木糖苷酶酵母菌株，通過釀酒實驗發現，接種優選非釀酒酵母進行發酵，總萜烯含量增加1.1～1.3 倍，Padilla等研究發現，由于--葡萄糖苷酶的活性，接種菌株增加了-松油醇、香葉醇和橙花醇的濃度。總體而言，現在大部分研究主要集中在非釀酒酵母菌株分泌的--葡萄糖苷酶活性對葡萄酒香氣復雜性的影響，然而對菌株的雙糖苷酶活性，特別是發酵過程中酶活性的菌株差異探究還十分欠缺。

本實驗從寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產區自然發酵葡萄汁中分離酵母菌株，以WL培養基和七葉苷培養基初步評價非釀酒酵母菌株的--葡萄糖苷酶活性，再通過對硝基苯酚（-nitrophenol，-NP）法定量測定并篩選雙糖苷酶活性較高的菌株；利用模擬干白葡萄酒發酵體系，評估優選本土非釀酒酵母菌株在模擬葡萄汁發酵過程中酶活性動態變化。本實驗旨在獲得釀造適應性優良的高產糖苷酶非釀酒酵母菌株，為進一步提升葡萄酒香氣品質提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 葡萄樣品與商業酵母

葡萄樣品均采自寧夏賀蘭山東麓不同葡萄酒產區。采自閩寧立蘭酒莊的霞多麗、赤霞珠，還原糖質量濃度分別為243.06、241.52 g/L，pH值分別為3.91、3.74，可滴定酸質量濃度（以酒石酸計）分別為5.15、5.81 g/L；采自青銅峽西鴿酒莊的霞多麗、赤霞珠，還原糖質量濃度分別為246.37、234.42 g/L，pH值分別為3.86、3.94，可滴定酸質量濃度分別為5.64、5.09 g/L；采自甘城子古城人家酒莊的赤霞珠，還原糖質量濃度為236.21 g/L，pH值為3.89，可滴定酸度質量濃度為5.71 g/L。

346商業非釀酒酵母 法國Lallema公司。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母浸粉、2%瓊脂，自然pH值（5.4），121 ℃滅菌20 min。

WL培養基購自北京奧博星生物技術有限責任公司。稱取80.25 g WL培養基，加入1 000 mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解，分裝，121 ℃高壓滅菌20 min，pH 5.5±0.2。

賴氨酸培養基購自青島日水生物技術有限公司。稱取66.3 g賴氨酸培養基于1 L含8.4 mL乳酸鉀的蒸餾水中，用乳酸調節pH值（pH 5.0±0.2），121 ℃滅菌20 min。

七葉苷篩選培養基：0.3%七葉苷、0.05%檸檬酸鐵、0.2% NaCl、0.05% MgSO·7HO、0.1% KHPO，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：1%吐溫80、1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、0.3%硝酸銨、0.05% MgSO·7HO、0.4% KHPO。

模擬葡萄汁：240 g/L葡萄糖、1.5 g/L酵母浸粉、0.3 g/L檸檬酸、5 g/L酒石酸、5 g/L-蘋果酸、2 g/L(NH)SO、5 g/L KHPO、0.4 g/L MgSO、0.2 g/L NaCl、0.05 g/L MnSO、50 mg/L SO，用0.5 mol/L NaOH調pH值至3.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

七葉苷、NP、對硝基苯基---葡萄糖苷（-nitrophenyl---glucopyranoside，NPG）、對硝基苯基---鼠李糖苷（-nitrophenyl--rhamnopyranoside，NP-Rha）、對硝基苯基---阿拉伯糖苷（-nitrophenyl---arabinopyranoside，NPAra）、對硝基苯基---木糖苷（-nitrophenyl--xylopyranoside，NP-Xyl） 上海源葉生物科技有限公司；酵母浸粉、蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；500051S立式高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SPX-300-II生化培養箱 上海躍進器械醫療有限公司；H2050R高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；Genesis 10S紫外-可見分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 美國ABI Veriti公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄汁自然發酵過程中還原糖測定及酵母菌株的分離純化

自然發酵：在葡萄成熟期采收葡萄并運回實驗室。無菌狀態下將新鮮成熟度好的葡萄破碎，裝入5 L無菌發酵罐中，添加30 mg/L SO，進行自然發酵。霞多麗葡萄于20 ℃發酵，赤霞珠葡萄于25 ℃發酵，每天定期搖瓶2 次。

于不同發酵時期（2、4、6、8、11、15 d）定時取樣，利用梯度稀釋涂布平板法，依次稀釋6 個梯度，振蕩搖勻后吸取100 μL 3 個梯度（10、10、10）稀釋液涂布于WL培養基，28 ℃培養5 d，每個梯度做3 個重復。

菌株分離與純化：根據WL固體培養基菌落的顏色及形態，對菌株進行初步區分，分別放在40%的滅菌甘油中，于-80 ℃保存備用，用于后續實驗。

參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定不同發酵時期葡萄汁的還原糖含量。

1.3.2 菌株產--葡萄糖苷酶定性篩選

將200 μL滅菌的七葉苷培養基添加到96 孔培養板中，接入20 μL活化后的供試菌液，于28 ℃培養24 h。按照顯色等級測定供試菌株產--葡萄糖苷酶的活性，深黑色記為“++++”表示最高酶活性，黑色記為“+++”表示中酶活性，深灰色記為“++”表示低酶活性。

1.3.3 糖苷酶活性定量測定

1.3.3.1--葡萄糖苷酶活性測定

參考錢超方法繪制NP標準曲線，以NP濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標。

參考López等方法測定酶活性并略作修改。供試菌株在YPD培養基培養48 h后，按5%的接種量接種于發酵培養基中，200 r/min、28 ℃下搖床培養72 h。取5 mL發酵液于離心管中，8 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，即得粗酶液。取0.5 mL粗酶液、1.2 mL pH 5.0檸檬酸-磷酸緩沖液（含0.1 mol/L檸檬酸和0.2 mol/L磷酸氫二鈉）、0.25 mL 5 mmol/L-NPG混合，于50 ℃培養30 min，加入1 mL 1 mol/L NaCO終止反應，在400 nm波長處測定吸光度。對照組為未進行反應的樣品。

根據標準曲線計算最終酶活性。酶活性單位（U）定義為pH 5.0、50 ℃條件下，1 min水解-NPG產生1 μmol-NP所需的酶量。

1.3.3.2 雙糖苷酶活性定量測定

參考López等方法，并略作修改。取0.25 mL粗酶液，0.6 mL檸檬酸-磷酸緩沖液（0.1 mol/L檸檬酸和0.2 mol/L磷酸氫二鈉，pH 5.0），分別與0.13 mLNP-Rha、NP-Ara、NP-Xyl（5 mmol/L）混合后，于50 ℃反應30 min，加入1 mL 0.5 mol/L NaCO終止反應，在400 nm波長處測定吸光度。對照組為未進行反應的樣品。

根據標準曲線計算最終酶活性。酶活性單位（U）定義為pH 5.0、50 ℃條件下，1 min水解NP-Rha、NPAra、NP-Xyl產生1 μmol-NP所需酶量。

1.3.4 菌株的分子生物學鑒定

參考田進等方法，并略作修改，提取基因組DNA，并進行PCR擴增及測序。

1.3.5 優選非釀酒酵母在模擬葡萄汁發酵中發酵動力學及糖苷酶活性動態變化

1.3.5.1 模擬葡萄汁發酵過程中發酵動力學

在20 mL固相微萃取（solid-phase micro-extraction，SPME）小瓶中進行純菌種微規模發酵（3 個獨立的重復），發酵小瓶中含有16 mL模擬葡萄汁。將6 株優選非釀酒酵母、、3 株、于YPD液體培養基活化，以1×10CFU/mL接種量接種。用頂部裝有穿孔硅塞和一次性注射器針頭密封小瓶，并在20 ℃下進行發酵。通過質量減輕監測發酵過程，如果連續3 d沒有觀察到進一步的質量減輕，則發酵被評估為“停滯”。每天通過測定CO釋放造成的瓶子質量損失監測發酵動力學。

1.3.5.2 模擬葡萄汁發酵過程中糖苷酶活性測定

選擇產酶性能較好的6 株非釀酒酵母菌株，按1×10CFU/mL接種量接種于500 mL含有400 mL模擬葡萄汁的錐形瓶，以商業非釀酒酵母346做對照，于20 ℃恒溫發酵。每天監測各發酵液--葡萄糖苷酶、--木糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶的活性變化，酶活性測定參考1.3.3節的方法進行。

1.4 數據處理

采用Excel 2010、Origin 2018軟件對實驗數據進行處理和作圖，利用Tbtools v1.09876軟件對酶活性測定結果進行聚類分析并繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 葡萄汁自然發酵期間還原糖變化和WL培養基形態鑒定

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，來自寧夏賀蘭山東麓不同葡萄酒產區的霞多麗和赤霞珠葡萄汁在自然發酵條件下還原糖質量濃度逐漸降低；且發酵15 d，霞多麗和赤霞珠葡萄汁均在本土菌株的作用下，順利完成自然發酵（還原糖質量濃度≤4 g/L）。

圖1 不同發酵時期霞多麗（A）和赤霞珠（B）葡萄發酵醪液還原糖變化Fig.1 Changes in reducing sugar in fermented must as a function of fermentation time

根據不同酵母菌株在WL營養瓊脂培養基上的形態和顏色，對其進行初步區分。如圖2所示，將分離的酵母菌株分為20 類。每一類別隨機挑取15～20 株具有代表性的單菌落，共計分離并收集821 株酵母菌株。發酵前期（1～4 d）主要以和發揮主導作用，發酵中期（5～8 d）酵母多樣性增加，出現、、、等酵母菌株，隨著發酵的進行，酵母菌株的多樣性降低，逐漸占據主導地位，完成后續乙醇發酵。

圖2 自然發酵液中分離得到的酵母菌在WL培養基上的形態Fig.2 Colonial morphology of yeasts isolated from spontaneously fermented grape must on WL medium

2.2 酵母菌株產β-葡萄糖苷酶定性篩選分析

酵母菌株可以水解糖苷配基和低聚糖之間的-糖苷鍵，其中起作用的第一類酶是--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶等雙糖苷酶；隨后，--葡萄糖苷酶作用于--葡萄糖苷釋放葡萄糖和芳香糖苷配基。因此，--葡萄糖苷酶是芳香配基釋放的重要限止因子。將保存備用的821 株酵母菌株活化，以七葉苷為底物，通過顯色反應對酵母菌株產--葡萄糖苷酶水平進行篩選。如圖3所示，將96 孔板中顯色較深的菌株挑選出在賴氨酸培養基劃線培養，能夠在賴氨酸培養基上生長的菌株為非釀酒酵母，共從821 株酵母菌株中分離出120 株--葡萄糖苷酶活性較高的非釀酒酵母。

圖3 96 孔板初篩顯色結果Fig.3 Chromogenic results of primary screening in 96-well plates

為進一步利用七葉苷培養基篩選出高產糖苷酶的非釀酒酵母菌株，將培養時間從48 h降低為24 h，對前期篩選出的120 株酵母菌株進行再次篩選培養。觀察七葉苷培養基顯色程度，對120 株酵母菌株產--葡萄糖苷酶能力進行具體劃分。由表1可知，分離自赤霞珠葡萄產-葡萄糖苷酶的供試菌株共75 株。其中，閩寧立蘭酒莊無高產--葡萄糖苷酶的菌株；青銅峽西鴿酒莊高產--葡萄糖苷酶的菌株有4 株，中產5 株，低產10 株；甘城子古城人家酒莊有3 株高產--葡萄糖苷酶的菌株，中產菌株4 株，低產菌株21 株。第2天取樣，產--葡萄糖苷酶菌株總數為20 株；取樣第4天，產--葡萄糖苷酶菌株數為30 株；第6、8、11天取樣，產--葡萄糖苷酶菌株數分別為14、6、5 株。綜上所述，相比于閩寧立蘭酒莊，青銅峽西鴿酒莊與甘城子古城人家酒莊分離菌株--葡萄糖苷酶活性較高；在第4天取樣，分離菌株產--葡萄糖苷酶的能力最強。

由表1可知，自霞多麗葡萄分離的菌株中，共篩選出45 株--葡萄糖苷酶活性較高的菌株。閩寧立蘭酒莊高產-葡萄糖苷酶的菌株有1 株，中產菌株9 株，低產菌株12 株；青銅峽西鴿酒莊高產--葡萄糖苷酶的菌株有2 株，中產10 株，低產11 株。第2天取樣，產--葡萄糖苷酶菌株總數為11 株；第4天取樣，產--葡萄糖苷酶的菌株總數為22 株；第6天取樣，產--葡萄糖苷酶的菌株總數為3 株；第8、15天取樣，產--葡萄糖苷酶的菌株總數分別為6、3 株。綜上所述，閩寧立蘭酒莊與青銅峽西鴿酒莊-葡萄糖苷酶水平差距相對較小，第4、6天取樣，菌株產--葡萄糖苷酶能力較強。

表1 分離自不同產區赤霞珠、霞多麗產β-D-葡萄糖苷酶酵母菌株初篩結果Table 1 β-D-Glucosinase-producing capacity of yeast strains isolated from Cabernet Sauvignon and Chardonnay from different production areas

2.3 酵母菌株糖苷酶活性定量分析

采用-NP半定量比色法評估了41 株本土非釀酒酵母菌株和1株商業346糖苷酶活性。根據標準曲線＝0.009 0+0.086 7（相關系數為0.999 5），計算最終酶活性。研究表明，非釀酒酵母在發酵前期能夠產生較多的胞外水解酶，提高最終產品的感官特性，但具有很強的菌株依賴性。以商業346為對照，對供試菌株糖苷酶粗提取液中--葡萄糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--木糖苷酶活性進行測定。如圖4所示，菌株C-X-4-1（49.669 mU/mL）、X-M-8-1（20.067 mU/mL）、C-X-6-3（19.091 mU/mL）、C-X-4-7（20.278 mU/mL）、X-X-15-1（17.889 mU/mL）、X-X-4-5（18.473 mU/mL）產--葡萄糖苷酶活性較高；高產--木糖苷酶菌株有C-X-4-1（28.450 mU/mL）、C-X-2-4（23.383 mU/mL）、X-X-15-1（30.884 mU/mL）、X-X-4-5（28.850 mU/mL）、C-X-6-3（38.953 mU/mL）、X-M-8-1（32.048 mU/mL）、C-X-4-7（26.366 mU/mL）、X-M-2-6（32.048 mU/mL）、X-M-2-4（26.366 mU/mL）。少數菌株對所有底物都具有高活性，這一事實證明了菌株選擇的重要性，如菌株C-X-4-1、X-M-8-1、C-X-4-7、C-X-6-3、X-M-2-6、X-M-2-4等產--木糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶活性均表現出較高水平。綜合考慮酵母菌株4 種糖苷酶活性，篩選出菌株C-X-4-1、X-M-8-1、X-M-2-6、X-M-2-4、C-X-6-3、C-X-4-7，且這6 株菌株產--葡萄糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--木糖苷酶活性均高于對照菌株。將這6 株菌株用于后續實驗。

圖4 本土酵母菌株粗酶液糖苷酶活性熱圖聚類分析Fig.4 Cluster analysis of glycosidase activity in crude enzyme solutions of native yeast strains

2.4 酵母菌株的分子生物學鑒定

通過對上述篩選的6 株非釀酒酵母進行DNA提取及26S rDNA基因PCR擴增，將純化后的PCR產物進行上機檢測，測序結果進行對比分析。在GenBank數據庫中與已發表的26S rDNA的D1/D2區域序列進行同源性比較，構建系統發育樹。如圖5所示，包括3 個屬的4 個種，分別為（X-M-8-1）、（X-M-2-6）、（C-X-4-1、C-X-6-3、X-M-2-4）、（C-X-4-7）。

圖5 基于26S rDNA序列的酵母菌株的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on 26S rDNA sequences of the yeast strains

2.5 模擬葡萄汁發酵過程中發酵動力學與糖苷酶活性分析

2.5.1 模擬葡萄汁發酵過程中發酵動力學分析

選擇6 株非釀酒酵母分離菌株，分別為、、3 株、，以商業346為對照，在模擬葡萄汁中進行純菌種發酵。發酵過程中質量損失如圖6所示，菌株CO質量損失最大，即發酵能力最強；其次，-2和-3也表現出較好的發酵能力；但所有菌株幾乎均在17 d出現發酵停滯。

圖6 模擬葡萄汁乙醇發酵過程中CO2質量損失Fig.6 CO2 loss in synthetic grape must during alcoholic fermentation

2.5.2 模擬葡萄汁發酵過程中糖苷酶活性分析

為了在乙醇發酵過程中利用非釀酒酵母的糖苷酶活性，需了解在真實葡萄酒條件下這些酶活性的動態變化。由圖7可知，不同非釀酒酵母發酵時，糖苷酶活性變化趨勢大致相同；在發酵8～11 d酶活性達到最大值，隨后逐漸下降，直至發酵結束。但不同菌株處理間，酶活性水平表現出一定差異。在葡萄糖質量濃度240 g/L、SO質量濃度50 mg/L、pH 3.2、發酵溫度20 ℃條件下，供試菌株的--葡萄糖苷酶和雙糖苷酶（--木糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶）活性分別在10（16.512 mU/mL）、9（9.574 mU/mL）、11（14.366 mU/mL）、9 d（11.735 mU/mL）達到最大，且明顯高于其他菌株。對照菌株346的糖苷酶活性相對較低，尤其是--葡萄糖苷酶、--木糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶。

圖7 模擬葡萄汁乙醇發酵過程中糖苷酶活性變化Fig.7 Evolution of glycosidase activity in synthetic grape must during alcoholic fermentation

供試非釀酒酵母菌株--葡萄糖苷酶、--木糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶累積酶活性如圖8所示。、、1、2、3、、346菌株發酵過程中糖苷酶的總累積活性之間具有顯著差異（＜0.05），分別為419.353、326.945、246.144、256.668、216.20、213.88、224.48 mU/mL，且、、1、2這4 株菌株的總累積活性顯著高于對照（224.48 mU/mL）（＜0.05）。7 個非釀酒酵母菌株處理中，--葡萄糖苷酶累積活性（127.70 mU/mL）＞（101.44 mU/mL）＞（78.76 mU/mL）＞346（72.51 mU/mL）＞3（70.15 mU/mL）＞1（69.23 mU/mL）＞2（62.06 mU/mL）；--阿拉伯糖苷酶累積活性（99.04 mU/mL）＞（81.48 mU/mL）＞（71.28 mU/mL）＞3（62.72 mU/mL）＞2（55.36 mU/mL）＞346（55.31 mU/mL）＞1（54.32 mU/mL）；不同菌株--木糖苷酶和--鼠李糖苷酶累積活性與--阿拉伯糖苷酶變化趨勢相同。

圖8 模擬葡萄汁乙醇發酵過程中糖苷酶累積活性Fig.8 Evolution of glycosidase accumulation in synthetic grape must during alcoholic fermentation

3 討論

在葡萄汁中接種釀酒酵母進行乙醇發酵是世界各地釀酒企業的普遍做法。然而越來越多的研究發現釀酒葡萄表面的一些特定種屬的非釀酒酵母菌株，可以合成和分泌胞外糖苷酶，是提高葡萄酒復雜性和區域特色的良好助劑。同時，胞外糖苷酶的活性因酵母種類的不同而差異顯著，有些菌株可能根本不產生這種酶。因此，分離篩選高產糖苷酶的非釀酒酵母菌株是提高葡萄酒感官復雜性的重要手段。Escribano等采用API-ZYM半定量測試系統，篩選了酵母菌株酯酶、酯酶-脂肪酶、脂肪酶--葡萄糖苷酶活性。Hong Mengnan等分別以熊果苷和木聚糖為底物，對分離自冰葡萄汁的酵母菌株的--葡萄糖苷和--木糖苷酶進行定性分析，共鑒定出11 株產香性能優的非釀酒酵母。本研究采用七葉苷培養基96 孔板半定量顯色法初步篩選高產--葡萄糖苷酶的非釀酒酵母，獲得了6 株高產--葡萄糖苷酶及雙糖苷酶的酵母菌株，為葡萄酒的增香釀造奠定了基礎。

在葡萄酒中，一些次級代謝產物以游離或結合態存在，后者可在酵母菌分泌酶的作用下被水解。糖苷酶，特別是--葡萄糖苷酶和--木糖苷酶、--鼠李糖苷酶和--阿拉伯糖苷酶等，參與單萜前體物質的水解釋放。雖然一些釀酒酵母菌株產生--葡萄糖苷酶，但一些非釀酒酵母菌株分泌的糖苷酶活性更高。前人研究發現，、、、和的菌株能分泌--葡萄糖苷酶。本研究也發現，、、、等菌株均表現出較高的--葡萄糖苷酶活性。酵母菌株糖苷酶活性分布情況不僅在釀酒酵母與非釀酒酵母之間存在差異，而且不同非釀酒酵母之間也存在多樣性。Escribano等在對97 株非釀酒酵母菌株酶活性的分析中發現，具有-葡萄糖苷酶活性的菌株比例最高（63%），其次是sp（60%），其他多數酵母則沒有或僅有極少比例的菌株具有該酶活性。Bokulich等研究發現葡萄酒酵母產生--木糖苷酶的能力非常罕見，目前僅在、、、和中發現。Manzanares和Zott等研究發現和具有較高水平的--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶活性。Cordero-Bueso等研究發現，表現出--木糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶活性。本研究中，、和表現出較高--木糖苷酶活性，而346則表現出相對較低的活性。同時，的--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶活性與其他菌株也具有差異顯著性（＜0.05）。

研究釀酒過程中酶活性的演替變化對葡萄酒香氣品質調控非常重要，因為它們的水平在整個過程中不一定是恒定的。本實驗發現糖苷酶活性與乙醇發酵過程酵母菌的生長密切相關，在8～12 d，CO質量損失的變化量達到最大，而不同菌株糖苷酶活性也分別在此發酵階段達到最大值，這與發酵動力學結果一致。Maturano等研究發現，酶活性的最高水平與生物量有關，并在生物量下降之前檢測到最大值。接種時，模擬葡萄汁pH 3.2，葡萄糖質量濃度240 mg/L、SO質量濃度50 mg/L，20 ℃恒溫發酵，大部分菌株均能正常生長，且表現出較好的糖苷酶活性水平。López等研究發現非釀酒酵母分泌的一些胞外酶，可以耐受葡萄酒的釀造條件，如低pH值、低溫、高糖或乙醇。有研究發現大部分菌株能產生--葡萄糖苷酶、-鼠李糖苷酶和--阿拉伯糖苷酶，其中以--葡萄糖苷酶活性最高，其次為木糖苷酶和--阿拉伯糖苷，只有一部分具有--鼠李糖苷酶活性。本研究發現，相比于對照菌株，供試菌株均表現出較高水平的糖苷酶活性。不同菌株間酶活性具有一定差異，且同一菌株間不同糖苷酶也表現出一定差異，從發酵過程中累積糖苷酶活性整體結果可知，--葡萄糖苷酶＞--阿拉伯糖苷酶＞--木糖苷酶＞--鼠李糖苷酶。

4 結論

利用WL培養基和七葉苷篩選培養基對自然發酵液中高產糖苷酶菌株進行篩選，并對初步篩選出菌株的糖苷酶活性進行定量測定，共篩選出6 株高產糖苷酶的本土非釀酒酵母菌株。在模擬汁發酵過程中，6 株優選本土非釀酒酵母菌株均能正常生長，且表現出相對較高的酶活性；尤其是菌株表現出良好的發酵能力、最高的--葡萄糖苷酶和雙糖苷酶累積活性；其次，菌株的--木糖苷酶和--阿拉伯糖苷酶累積活性顯著高于對照菌株，菌株與3表現出較高的--木糖苷酶和--阿拉伯糖苷酶活性。綜合分析，菌株、、3、具有與釀酒酵母進行混合發酵，提高葡萄酒的風味復雜性和區域特色的應用潛力。