阿司匹林調節miR-340-5p/HMGB1/TLR4 通路對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響

陳興華，張繼倬，韓 露（1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院心臟外科，北京 100038；.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學研究中心，北京 10000）

心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是臨床常見疾病。有學者認為，I/R損傷在冠狀動脈血流、心肌缺血恢復和心肌梗死面積縮小等過程中難以避免[1]。近年來，隨著各種心臟介入治療技術的廣泛應用，心血管疾病患者的治愈率雖有較大提高，但由此產生的I/R損傷也日益增多[2]。

有研究指出，微RNA（microRNA，miRNA）可作用于心肌I/R損傷，已成為相關研究的重要靶點，如通過提高miRNA-340-5p（miR-340-5p）表達來改善小鼠心功能和心肌病變，抑制心肌酶活性、炎癥反應和氧化應激，減少細胞凋亡，進而緩解I/R 損傷[3]。結合上述研究，本課題組借助生物學分析發現，高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）可 能 是miR-340-5p 的 靶點[4]。既往研究表明，HMGB1是一種普遍存在且含量豐富的核蛋白，在多種心血管疾病中均有關鍵作用[5]；此外，HMGB1 被鑒定為內源性Toll 樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）的配體，下調HMGB1/TLR4 信號通路可有效減輕I/R 誘導的心肌細胞損傷[6]。由此本課題組推測，miR-340-5p 緩解I/R 損傷可能與下調HMGB1/TLR4信號通路有關。

阿司匹林（aspirin，Asp）是心血管疾病二級預防的主要藥物，可參與調控HMGB1、TLR4等蛋白的表達，并可通過減輕心肌I/R 損傷來發揮心臟保護作用[7-9]。然而，Asp在心肌I/R損傷中的調控機制尚不明確，其干預作用是否與miR-340-5p/HMGB1/TLR4信號通路有關仍不清楚。為此，本研究通過構建大鼠I/R 模型來深入探究Asp 對心肌I/R 損傷的保護作用及相關機制，以期為臨床心肌I/R損傷的治療提供新的參考依據。

1 材料

1.1 主要儀器

ALC-V8S 型動物呼吸機購自上海奧爾科特生物科技有限公司；MedLab-U/4C501H型生物信號采集處理系統購自南京美易科技有限公司；Multiskan FC型酶標儀、BB15 型CO2細胞培養箱均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；7500 型定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcriptase-mediated PCR，qRT-PCR）儀購自美國ABI 公司；Quantity One 型凝膠成像系統、1658033 型凝膠電泳系統均購自美國Bio-Rad 公司；CKX53型光學顯微鏡購自日本Olympus公司；ZHS1220型相機購自日本Cannon 公司；DU800 型紫外分光光度計購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 主要藥品與試劑

Asp對照品（批號A1189，純度≥98.0%）購自北京康瑞納生物科技有限公司；miR-340-5p 抑制物（in-miR-340-5p）、過表達HMGB1、過表達miR-340-5p 及其陰性對照（miR-NC）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；腺病毒表達載體pacAd5 CMV-GFP購自北京華越洋生物科技有限公司；熒光素酶pmirGLO 載體（批號GN1439）購自上海蓋寧生物科技公司；Lipofectamine 2000 轉染試劑（批號11668019）購自美國Invitrogen 公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號RL008）、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）ELISA試劑盒（批號RC044）均購自上海歌凡生物科技有限公司；心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ）ELISA試劑盒（批號orb158935）購自英國Biobyt 公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（比色法，批號AO44-1-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（WST-1 法，批號A001-3-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（比色法，批號A005-1-1）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（TBA法，批號A003-1-1）均購自南京建成生物工程研究所；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號AG1120）、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（批號AT2190）均購自上海吉至生化科技有限公司；TTC 染液（批號YT8072）、Triton X-100試劑（批號SY5134）均購自北京伊塔生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒（批號YST0010）購自桂林金優勝特貿易有限公司；SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（批號DRR041A）購自日本TAKARA 公司；高效RIPA 組織/細胞快速裂解液（批號R0010）、Trizol 試劑盒（批號15596-018）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號D0010）均購自北京索萊寶科技有限公司；兔HMGB1 多克隆抗體（批號ab18256）、兔TLR4 多克隆抗體（批號ab218987）、兔β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號ab5694）、兔辣根過氧化物酶標記的IgG 二抗（批號ab205718）均購自英國Abcam 公司；ECL 化學發光試劑盒（批號P0018S）購自上海碧云天生物技術公司；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 實驗動物與細胞

SPF 級雄性SD 大鼠100 只，體質量為200～250 g，由中國科學院上海藥物研究所提供，動物生產許可證號為SCXK（滬）2020-0005。大鼠心肌細胞H9C2購自美國ATCC公司，批號為ZB031。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

所有大鼠均被飼養于（25±1）℃、12 h/12 h 光照/黑暗交替的恒溫空調房內，自由進食，飲水。1 周后，將大鼠分為假手術（Sham）組、I/R 組、Asp 預處理（I/R+Asp）組、I/R+Asp+in-miR-340-5p 組 和I/R+Asp+HMGB1 組，每組20 只。Sham 組大鼠開胸后不結扎冠狀動脈，其余各組大鼠按下法建立模型：經2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后以仰臥位固定，插入氣管導管并連接呼吸機；分離大鼠右頸動脈，插入動脈插管并連接到生物信號采集處理系統；切開大鼠胸部，沿胸骨左側切開，分離心包，暴露心臟，用5/0絲線于左冠狀動脈前降支底部結扎，結扎時放入特制線栓，以左室前壁發紺和ST 段抬高為缺血成功的標志；缺血30 min后拔去線栓再灌注2 h，若上述變化消失，說明再灌注成功[10]。Sham組、I/R組和I/R+Asp 組大鼠在缺血前48 h 分別灌胃生理鹽水；I/R+Asp+in-miR-340-5p 組和I/R+Asp+HMGB1 組大鼠在缺血前48 h 分別轉染in-miR-340-5p 或過表達HMGB1（即分別尾靜脈注射含有in-miR-340-5p 或過表達HMGB1 的腺病毒，以miR-340-5p 或HMGB1 的表達情況判定是否轉染成功）。各藥物組大鼠在造模前7 d 灌胃Asp 200 mg/（kg·d）[以生理鹽水為溶劑，分2 次，連續7 d]，Sham組、I/R 組平行灌胃等體積生理鹽水[8-9]。上述過程均經過首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院動物實驗倫理委員會批準，嚴格參照相關規范要求操作[11]。

2.2 血液和心肌組織標本采集

再灌注2 h 后，以2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，從心臟采集血液樣本并分離血清。隨后，斷頸處死大鼠，剖取心臟，用濾紙吸干，稱定質量，沿左心室長軸采集心肌組織，每組隨機選取5只大鼠的心肌組織用10%中性甲醛溶液固定，用于病理觀察和細胞凋亡檢測；其余15只大鼠的心肌組織于-80 ℃凍存，用于炎癥及氧化應激指標（5 只）、心肌梗死面積（5 只）和miR-340-5p、HMGB1、TLR4表達（5只）的檢測。

2.3 血清心肌損傷指標檢測

取“2.2”項下各組大鼠血清樣本適量，采用ELISA法以酶標儀檢測其血清LDH、CK-MB、cTnⅠ水平，嚴格按照各試劑盒說明書操作。

2.4 心肌組織中炎癥和氧化應激指標檢測

取“2.2”項下凍存的各組大鼠心肌組織適量，經勻漿、離心后，取上清液，按試劑盒方法以酶標儀檢測心肌組織中MPO、SOD、GSH-Px、MDA 水平，嚴格按照各試劑盒說明書操作。

2.5 心肌組織病理觀察

取“2.2”項下固定的各組大鼠心肌組織適量，用石蠟包埋后切片（厚度5μm），經脫蠟、水化后，行HE染色并置于光學顯微鏡下觀察其病理改變。

2.6 心肌梗死面積檢測

取“2.2”項下凍存的各組大鼠心肌組織適量，切成5個切片（厚度3 mm），放入培養皿中，在37 ℃培養箱中溫育10～15 min 后用1%TTC 試劑染色（缺血性心肌組織可被染成紅色，而梗死區域仍為灰白色）。用相機拍照并采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算心肌梗死面積：心肌梗死面積＝5 個切片梗死面積之和/整個心臟面積×100%。

2.7 心肌細胞凋亡情況檢測

采用TUNEL 法進行檢測。取“2.5”項下切片，依次置于二甲苯中脫蠟、乙醇中水合，通過0.1%Triton X-100試劑滲透后，再使用3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性。將切片置于TUNEL 反應混合物50μL 中，于37 ℃下孵育1 h，以DAB法顯色后，使用Image J 1.8.0軟件計算細胞凋亡指數：細胞凋亡指數＝凋亡陽性細胞（呈棕色）/細胞總數（呈藍色）×100%。

2.8 心肌組織中miR-340-5p表達情況檢測

采用qRT-PCR 法進行檢測。取“2.2”項下凍存的各組大鼠心肌組織適量，勻漿，用Trizol 試劑盒提取總RNA。檢測總RNA純度、濃度和完整度后，參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒以U6作為內參進行PCR擴增。反應體系（共20μL）包括：上、下游引物各0.4μL，2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，cDNA 模板1 μL，用ddH2O 補足20μL。反應程序如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性20 s，57 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共37 個循環。使用2-ΔΔCt法計算待測基因的相對表達量（以Sham 組為參照）。miR-340-5p上游引物為5′-GCGGTTATAAAGCAATGAGA-3′，下游引物為5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′；內參上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3′。

2.9 心肌組織中HMGB1、TLR4蛋白表達情況檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.2”項下凍存的各組大鼠心肌組織適量，經裂解液500μL 裂解后，于冰浴中勻漿，離心取上清液。將所獲蛋白與上樣緩沖液混合，于95 ℃下煮沸15 min變性。取變性蛋白，行電泳分離并轉移到PVDF 膜上，以5%脫脂牛奶封閉，加入HMGB1、TLR4、β-actin 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃下孵育過夜；洗膜，加入相應二抗（稀釋比例為1∶5 000），37 ℃下孵育1 h，經ECL 顯影后，使用凝膠成像系統成像并計算待測蛋白的相對表達量：待測蛋白的相對表達量＝待測蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

2.10 miR-340-5p與HMGB1靶向關系的驗證

體外常規培養H9C2心肌細胞用于驗證miR-340-5p與HMGB1 之間的靶向關系。采用Targetscan 軟件預測miR-340-5p 與HMGB1 的結合位點，隨后將含有預測結合位點的HMGB1 野生型（HMGB1 WT）或突變型（HMGB1 MUT）的3′-非 翻 譯 區（3′-untranslated regions，3′-UTR）片段克隆在熒光素酶pmirGLO 載體上，經DNA 測序驗證后，按照Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書操作，將HMGB1 WT 或HMGB1 MUT 與miR-340-5p（miR-340-5p 組）或miR-NC（miR-NC 組）共同轉染至H9C2心肌細胞，培養48 h后取出，使用酶標儀對熒光素酶活性進行測定，并采用Western blot 法檢測單獨轉染過表達miR-340-5p或miR-NC后H9C2心肌細胞中HMGB1蛋白的相對表達量（具體操作同“2.9”項），實驗重復5次。

2.11 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。數據均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；成對比較采用t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 Asp 對I/R 模型大鼠心肌損傷、炎癥和氧化應激指標的影響

與Sham 組比較，I/R 組大鼠血清中LDH、CK-MB、cTnⅠ水平和心肌組織中MPO、MDA 水平均顯著升高，心肌組織中SOD、GSH-Px 水平均顯著降低（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Asp組大鼠上述指標均顯著改善（P＜0.05）。與I/R+Asp 組比較，I/R+Asp+in-miR-340-5p 組、I/R+Asp+HMGB1組大鼠血清中LDH、CK-MB、cTnⅠ水平和心肌組織中MPO、MDA水平均顯著升高，而心肌組織中SOD、GSH-Px水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表1、表2。

表1 各組大鼠血清心肌損傷指標的檢測結果（±s，n＝20）

表1 各組大鼠血清心肌損傷指標的檢測結果（±s，n＝20）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與I/R組比較，P＜0.05；c：與I/R+Asp組比較，P＜0.05

組別Sham組I/R組I/R+Asp組I/R+Asp+in-miR-340-5p組I/R+Asp+HMGB1組LDH/（U/L）215.36±18.56 854.16±76.32a 368.29±24.33b 489.36±30.08c 518.69±32.55c CK-MB/（U/L）114.35±10.54 325.69±23.25a 186.65±12.36b 247.33±15.20c 268.39±18.30c cTnⅠ/（ng/mL）1.25±0.18 5.29±0.59a 2.45±0.22b 3.12±0.32c 3.45±0.35c

表2 各組大鼠心肌組織中炎癥和氧化應激指標的檢測結果（±s，n＝5）

表2 各組大鼠心肌組織中炎癥和氧化應激指標的檢測結果（±s，n＝5）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與I/R組比較，P＜0.05；c：與I/R+Asp組比較，P＜0.05

組別Sham組I/R組I/R+Asp組I/R+Asp+in-miR-340-5p組I/R+Asp+HMGB1組MPO/（U/g）5.26±0.45 19.35±1.58a 9.26±0.87b 12.23±1.05c 14.36±1.10c SOD/（U/mg）162.36±12.65 68.69±7.54a 130.12±10.02b 89.26±7.65c 95.23±8.52c GSH-Px/（U/mg）29.65±2.08 10.02±1.10a 23.63±1.25b 16.26±1.20c 18.32±1.30c MDA/（mmol/mg）4.69±0.37 12.54±1.26a 7.25±0.59b 9.13±0.15c 10.26±1.05c

3.2 Asp 對I/R 模型大鼠心肌病理改變和梗死面積的影響

HE染色結果顯示，Sham組大鼠心肌細胞未見任何病理改變；I/R 組大鼠心肌纖維斷裂，細胞腫脹，細胞核不規則且固縮，并可見大量壞死細胞和炎癥細胞。用Asp 預處理后，I/R+Asp 組大鼠的上述病理改變有所好轉；而在轉染in-miR-340-5p或過表達HMGB1后，Asp對I/R 損傷心肌細胞的上述保護作用被削弱。結果見圖1。

經TTC染色證實，與Sham組[（0.56±0.04）%]比較，I/R 組大鼠心肌梗死面積[（25.69±2.58）%]顯著增大（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Asp組大鼠心肌梗死面積[（9.23±0.86）%]顯著縮小（P＜0.05）；與I/R+Asp 組比較，I/R+Asp+in-miR-340-5p組、I/R+Asp+HMGB1組大鼠心肌梗死面積[（15.69±1.23）%、（17.03±1.36）%]均顯著增大（P＜0.05）。結果見圖2。

圖1 各組大鼠心肌病理改變的顯微圖（HE染色）

圖2 各組大鼠心肌梗死面積的變化情況（TTC染色）

3.3 Asp對I/R模型大鼠心肌組織中細胞凋亡的影響

與Sham 組（3.25±0.32）比較，I/R 組大鼠心肌組織中細胞的凋亡指數（28.36±2.15）顯著增高（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Asp組大鼠心肌組織中細胞的凋亡指數（9.26±0.57）顯著降低（P＜0.05）；與I/R+Asp組比較，I/R+Asp+in-miR-340-5p 組、I/R+Asp+HMGB1 組大鼠心肌組織中細胞的凋亡指數（15.56±1.02、17.21±1.14）均顯著增高（P＜0.05）。結果見圖3。

3.4 Asp 對I/R 模型大鼠心肌組織中miR-340-5p/HMGB1/TLR4信號通路的影響

與Sham組比較，I/R組大鼠心肌組織中miR-340-5p的相對表達量顯著降低，HMGB1、TLR4 蛋白的相對表達量均顯著升高（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Asp組大鼠心肌組織中miR-340-5p 的相對表達量顯著升高，HMGB1、TLR4 蛋白的相對表達量均顯著降低（P＜0.05）；與I/R+Asp 組比較，I/R+Asp+in-miR-340-5p 組、I/R+Asp+HMGB1組大鼠心肌組織中miR-340-5p的相對表達量均顯著降低，HMGB1、TLR4 蛋白的相對表達量均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖4。

圖3 各組大鼠心肌組織中細胞凋亡情況的顯微圖（TUNEL法）

圖4 各組大鼠心肌組織中miR-340-5p 和HMGB1、TLR4蛋白表達的檢測結果（±s，n＝5）

3.5 miR-340-5p與HMGB1的靶向關系

miR-340-5p 與HMGB1 的3′-UTR 區（位 點1364-1371）存在互補配對區，故推測HMGB1可能是miR-340-5p 的靶點。熒光素酶活性檢測結果（圖5A）顯示，在轉染miR-340-5p 后，HMGB1 WT 的相對熒光素酶活性受到顯著抑制（P＜0.05）。此外，HMGB1蛋白表達檢測結果（圖5B）顯示，轉染miR-340-5p可顯著降低HMGB1蛋白的相對表達量（P＜0.05）。

圖5 miR-340-5p和HMGB1的靶向關系（±s，n＝5）

4 討論

臨床研究表明，心肌梗死是患者心血管疾病發生和死亡的主要原因，而恢復心臟的血液供應被認為是心肌梗死最有效的治療手段[12]。然而，再灌注本身會使心肌損傷進一步惡化，這種現象被稱為心肌I/R 損傷[13]。目前，心肌I/R損傷缺乏相應的治療靶點，故尋找有效靶點十分必要。

研究表明，心肌細胞內氧自由基大量產生、細胞黏附分子改變、鈣離子超載、心肌能量代謝障礙、細胞凋亡等都與心肌I/R 損傷相關，這些機制的相互關聯構成了一個復雜的信號網絡，相互制約、平衡[14-15]。Asp屬于非甾體抗炎藥，其導致閉塞性心血管事件發生的風險低于傳統的非甾體抗炎藥，且可通過減輕炎癥反應和線粒體氧化損傷、減少心肌細胞凋亡來改善心肌I/R 損傷[8-9]。為了探索Asp 在心肌I/R 損傷保護中的具體機制，本研究檢測了各組大鼠血清中心肌損傷指標以及心肌組織中炎癥和氧化應激指標水平。結果表明，Asp 能通過抑制LDH、CK-MB、cTnⅠ的表達，減輕炎癥反應，抑制氧化應激反應，從而發揮對I/R損傷的保護作用。此外，本研究發現，Asp 可明顯改善I/R 引起的心肌組織病理損傷，并可縮小心肌梗死面積，抑制心肌組織中的細胞凋亡，與已有研究基本相似[8]。

miR-340-5p 定位于人5 號染色體長臂5q35.3，可通過靶向c-Met、FHL2、ROCK1、SKP2等多種癌基因來參與腫瘤的發生和發展[16]；可通過上調髓細胞性白血病1的表達來減少氧化損傷和細胞凋亡，從而改善糖尿病性心肌功能障礙[17]；除此之外，miR-340-5p 表達的上調還可有效緩解小鼠的心肌I/R 損傷[5]。本研究結果顯示，Asp預處理可顯著上調模型大鼠心肌組織中miR-340-5p的表達，而抑制miR-340-5p的表達則可逆轉Asp對大鼠心肌I/R損傷的保護作用。由此筆者推測，Asp可能通過上調miR-340-5p 的表達來發揮心肌保護作用。有研究指出，成熟的miRNA與其靶mRNA的3′-UTR序列配對結合后，可被整合到RNA誘導的沉默復合體中，從而導致靶mRNA 降解[18]。本課題前期研究證實，HMGB1 編碼基因是miR-340-5p的靶基因，且過表達的miR-340-5p可顯著降低HMGB1 蛋白的表達[4]。結合本研究結果發現，miR-340-5p介導的HMGB1通路在Asp保護心肌I/R損傷中發揮了作用。據報道，HMGB1 已被鑒定為內源性TLR4 配體，可通過與髓樣分化蛋白2 結合來激活TLR4[19]。有研究指出，抑制HMGB1/TLR4 信號通路可抑制心肌細胞凋亡、自噬和炎癥反應等，可見該通路可能與改善缺血性心肌損傷有關[6]。本研究結果顯示，經Asp預處理后，HMGB1、TLR4蛋白的相對表達量均顯著降低，而HMGB1過表達可部分逆轉Asp對心肌I/R損傷的改善作用，提示HMGB1/TLR4 信號通路可能參與了Asp 的I/R 損傷保護機制。miR-340-5p 與HMGB1 的 靶向關系分析結果顯示，miR-340-5p 可靶向負調控HMGB1的表達。

綜上所述，Asp 可通過調節miR-340-5p/HMGB1/TLR4 通路來減輕炎癥反應和氧化應激，減少心肌組織中的細胞凋亡，進而發揮對心肌I/R 損傷的保護作用。然而，Asp 的主要作用靶點為環氧合酶1/2 和前列腺素E2，上述靶點是否與miR-340-5p/HMGB1/TLR4 信號通路關聯尚有待探究；此外，本研究并未單獨設置不受藥物干預的miR-340-5p、HMGB1 過表達組，加之心肌I/R損傷調控機制復雜，故Asp的具體機制和其他途徑仍有待進一步論證。