羧甲基多孔淀粉表征及其對槲皮素吸附研究

王宇霞，馬云翔，茍麗娜，李敏，張盛貴

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

馬鈴薯淀粉(native starch，NS)是主要的淀粉資源，原淀粉易老化、穩定性差、溶解性差等缺點限制了其商業應用，可通過氧化、酯化、醚化等化學方法改性[1]，拓展其性質，以滿足特定的應用需求。羧甲基淀粉(carboxymethyl starch，CMS)可溶于冷水，有良好的凍融穩定性和透明度，隨著取代度(degree of substitution，DS)增加，其溶解性和凍融穩定性均顯著提高，在工業上引起了極大的關注，被廣泛應用于食品、制藥、紡織和造紙等行業[2]。槲皮素是一種黃酮類化合物，其具有抗炎、抗病毒和抗氧化等多種生理和藥理活性，在食品及醫藥領域應用廣泛[3]。槲皮素的低水溶性限制了其在人體內的吸收，導致生物利用度降低[4]。有研究表明，淀粉可以作為槲皮素的有效傳遞載體，使槲皮素分布均勻并能提高其水溶性和生物利用度[5]，其中淀粉的溶解性和裝載量是關鍵性指標，成為功能性載體改性淀粉的研究熱點。

原淀粉天然較差的孔隙結構(總孔隙面積和孔隙率較低)限制了其在吸附方面的應用。多孔淀粉(porous starch，PS)作為一種擁有大量孔洞的新型改性淀粉，增加了淀粉顆粒的比表面積，提高了其吸附性能[6]。JU等[7]采用玉米多孔淀粉對香精油進行微膠囊化(porous starch microcapsules-essential oils，PSM-EOs)，使其具有優異的緩釋抗菌效果。WANG等[8]制備多孔玉米淀粉對葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins，GSPs)進行吸附，結果表明這種淀粉可以作為一種理想的吸附劑來提高GSPs的利用率并保持其抗氧化活性。HU等[9]制備交聯多孔淀粉(cross-linked porous starch，CPS)吸附制革廢水中的六價鉻，實驗顯示CPS對重金屬離子鉻和鉛表現出優越的吸附性能。因此，與原淀粉相比，PS作為反應主體，不僅使反應客體與淀粉的接觸面積增加，還能使比表面積進一步擴大，獲得更高的DS和更大的負載量。

羧甲基化制備變性淀粉的報道較多，但淀粉多孔結構對羧甲基反應、樣品性質的影響，以及應用效果的研究鮮見報道。本研究以馬鈴薯多孔淀粉為材料，通過羧甲基化改性，以獲得更高取代度、溶解性和裝載能力的材料，為載體淀粉材料的應用提供新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯原淀粉(BR)上海源葉試劑公司;氯乙酸鈉(AR)上海麥克林生化科技有限公司;槲皮素(97%，質量分數)上海麥克林生化科技有限公司；D2O(純度≥99.9%)劍橋同位素實驗室；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HCJ-4D恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州市瑞華儀器制造有限公司；JSM-6701F冷場發射型掃描電子顯微鏡，日本電子光學公司；NEXUS-670傅立葉紅外光譜儀，美國Thermo公司；AVance NEO 600MHz寬腔固體超導核磁共振波譜儀，布魯克公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 馬鈴薯多孔淀粉的制備

參照BUDARIN等[10]的方法稍做修改：將15 g馬鈴薯原淀粉加入100 mL蒸餾水中，先于40 ℃水浴鍋中攪拌(100 r/min)20 min，再升溫至90 ℃繼續攪拌1 h，然后4 ℃貯存72 h以獲得淀粉凝膠。將切成方塊(約1 cm×1 cm×1 cm)的凝膠浸入無水乙醇，重復5次，每次約1 h。將沉淀物于50 ℃干燥4 h，研磨過100目篩后備用。

1.3.2 羧甲基淀粉和羧甲基多孔淀粉(carboxymethyl porous starch，CMPS)的制備

參照ZHANG等[11]的方法并做適當修改：將2.0 g NS或PS分別分散在20 mL 90%異丙醇中，攪拌20 min以形成懸浮液。溫度保持在30 ℃，加入0.98 g NaOH攪拌1 h，升溫至40 ℃后加入一定量的氯乙酸鈉(sodium chloroacetate，SMCA)，反應3 h后離心得淀粉漿，然后懸浮在80%乙醇中，再用10%乙酸溶液將pH調至7.0，離心混合物用80%乙醇洗滌至濾液硝酸銀氯化物測試為陰性。置于恒溫干燥箱50 ℃干燥6 h，過100目篩制得CMS或CMPS備用。

1.3.3 取代度的測定

參照陳慶[12]的方法適當修改：稱取一定量樣品于核磁管中，加入D2O，超聲30 s充分溶解并去除溶解氧對實驗的影響，使用核磁共振波譜儀TXISz探針在25 ℃下掃描測定。

核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance，1H NMR)圖譜(圖3)中，5.69處峰為脫水葡萄糖單元(anhydro glucose unit， AGU)中H-1質子信號，3.85處為CMS接枝鏈—CH2COOH上的亞甲基質子信號峰(H-7)。由3.85處質子峰面積與5.69處質子峰面積關系計算樣品DS，如公式(1)所示：

(1)

式中：Asignal為樣品在3.85處的峰面積，Nsignal為樣品在3.85處的質子數；AAGU為樣品在5.69處的峰面積，NAGU為樣品在5.69處的質子數。

1.3.4 掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)分析

用導電膠將少量樣品粉末粘在樣品座上，將樣品座置于離子濺射儀中鍍金60 s后，用掃描電鏡在不同放大倍數下觀察樣品粉末的形態特征。

1.3.5 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)分析

樣品的紅外光譜測定采用溴化鉀壓片法。將適量溴化鉀與1 mg干燥樣品粉末混合均勻，碾磨至無顆粒感后壓片處理，掃描波長為4 000～500 cm-1。

1.3.6 液態核磁分析(1H NMR)

用德國Bruker公司的型號為Ascend 600MHz/AVance NEO的核磁共振光譜儀進行表征，以D2O為溶劑。

制樣方法：稱取5～10 mg的待測樣品置于核磁管中，然后加入D2O，溶解后測試。

1.3.7 X射線衍射分析(phase analysis of xray diffraction，XRD)

采用X射線衍射儀在5°～30°的掃描范圍內測定樣品的結晶結構。

1.3.8 N2-吸/脫附分析

利用Micromeritics ASAP 2020 M系統測得樣品的N2-吸脫附等溫線。利用非定域密度泛函理論得到孔徑的尺寸分布曲線。依據Brunauer-Emmett-Teller(BET)多層吸附理論計算比表面積。

1.3.9 熱重分析(thermogravimetric analysis，TGA)和微商熱重分析(derivative thermogravimetry，DTG)

采用熱重分析儀研究樣品的熱特性。氮氣，升溫速率10 ℃/min，溫度為50～600 ℃。

1.3.10 吸附性能分析

1.3.10.1 復合物羧甲基淀粉吸附槲皮素(carboxymethyl starch@quercetin，CMS@Q)和羧甲基多孔淀粉吸附槲皮素(carboxymethyl porous starch@quercetin，CMPS@Q)的制備

以CMS吸附槲皮素評價其吸附性能，參照AHMAD等[13]的方法并做適當修改制備復合物(CMS@Q)：槲皮素以10 mg/mL的質量濃度溶解在無水乙醇中，以V(溶解液)∶V(羧甲基淀粉)=1∶10滴加到羧甲基淀粉中，超聲處理5 min使其體系分布均勻，在40 ℃下磁力攪拌1 h，樣品真空凍干后在-20 ℃保存備用。

CMPS@Q的制備參照CMS@Q的制備。

1.3.10.2 標準曲線的繪制

參考劉維信等[14]的方法并做適當修改，準確稱取槲皮素25.0 mg于250 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，得到100 mg/L的儲備液。用儲備液分別配制1～5 mg/L槲皮素標準溶液, 以無水乙醇為參比液分別測定其在360 nm處的吸光度，繪制質量濃度(C，mg/L)- 吸光度(A)標準曲線。

1.3.10.3 負載率的測定

根據AHMAD等[13]的方法適當修改：分別稱取0.22 g CMS@Q和CMPS@Q加入10 mL蒸餾水中制成懸浮液，離心(3 000 r/min，5 min) 棄上清液，沉淀物重新懸浮在10 mL水中并超聲30 min以從復合物中提取負載的槲皮素。懸浮液離心(5 000 r/min，10 min)后收集上清液。用紫外分光光度計測定上清液在360 nm處的吸光度，根據標準曲線確定槲皮素含量。

1.3.10.4 水溶性分析

將樣品配成20 g/L的溶液，在沸水浴中持續攪拌30 min后迅速冷卻至室溫。離心(3 000 r/min，20 min)后取上清液于105 ℃干燥4 h，得到水溶物質的質量。溶解度計算如公式(2)所示：

(2)

1.3.11 統計分析

每組實驗重復3次，數據用Origin 8及SPSS 25進行統計分析，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 羧甲基淀粉和羧甲基多孔淀粉取代度

在淀粉羧甲基化過程中NaOH為反應體系提供堿性環境，并活化淀粉使其變成具有反應活性的鈉鹽，促使醚化劑擴散滲透到淀粉顆粒結構中，加快反應速度[15]。PS結構中孔徑和孔深度的增加提供了更大的比表面積[16]，與醚化劑(SMCA)有更多的反應位點，能賦予醚化產物更大的取代度。本實驗在淀粉質量濃度為100 g/L，醚化溫度為40 ℃，醚化時間為3 h條件下分析不同SMCA水平處理的改性淀粉DS(表1)。當SMCA添加量為0.006 mol時，CMS的DS為0.19，相同制備條件下CMPS的DS為0.25。隨著SMCA的增加，CMPS的DS也隨之增加，SMCA添加量增加3倍時DS增加5.8倍，表明多孔處理能增加反應位點，促使反應更易發生，在SMCA改性葛根淀粉中也觀察到相似的結果[17]。

2.2 SEM分析

NS、PS、CMPS及CMS的SEM顯示在圖1中。NS表面平滑規整，顆粒呈圓形或卵圓形，且沒有可見的孔。多孔淀粉破壞了原淀粉的原有結構，表面出現豐富且均勻的孔，可提供更大的比表面積，釋放更多的羥基基團與SMCA發生反應[18]。在醚化反應后，CMS表面粗糙顆粒破碎，出現向內塌陷的洞，CMPS顆粒表面凹凸不平，這表明在羧甲基化過程中，由于強堿作用，導致淀粉顆粒溶脹變形[15]，多孔結構坍塌。SEM結果表明，醚化反應破壞了多孔淀粉顆粒的形態結構。

表1 羧甲基淀粉和羧甲基多孔淀粉的DSTable 1 Degree of substitution of CMS and CMPS

a-馬鈴薯原淀粉；b-多孔淀粉；c-羧甲基淀粉；d-羧甲基多孔淀粉圖1 馬鈴薯原淀粉、多孔淀粉、羧甲基淀粉及羧甲基多孔淀粉的SEM(×5 000)圖Fig.1 SEM(×5 000) images of NS、PS、CMS and CMPS

2.3 FT-IR分析

馬鈴薯原淀粉、多孔淀粉、羧甲基淀粉和羧甲基多孔淀粉的FT-IR光譜如圖2所示。由圖2可以看出NS與PS出峰位置一致，是因為多孔化改性會影響氫鍵的位置和數量，但不會引入新的官能團[19]。與PS相比，CMPS觀察到在3 428 cm-1處出現淀粉羥基的伸縮振動峰，在1 605、1 422、1 324 cm-1處出現羧酸鹽的拉伸振動峰，說明淀粉分子上引入了羧甲基基團。這與LIU等[20]先前的研究一致，且3個峰的強度也隨DS的增加而增加。由圖2可以看出CMS與CMPS出峰位置一致，說明NS與SMCA間也成功形成了醚鍵。

圖2 馬鈴薯原淀粉、多孔淀粉、羧甲基淀粉和 羧甲基多孔淀粉的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of NS、PS、CMS and CMPS

2.4 液態核磁分析

對多孔淀粉、氯乙酸鈉、羧甲基淀粉和羧甲基多孔淀粉進行1H NMR分析，4.7處出現的峰是溶劑峰(D2O)。如圖3中的a所示，根據文獻給出了多孔淀粉分子中氫原子的對應信號[21]。圖3中的b中3.9處出現的峰是SMCA中亞甲基的質子峰(H-8)。由圖3中可以看出CMS(圖3中的c)與CMPS的出峰位置一致，圖3中的d、e、f中3.85處出現的峰是CMPS中的質子峰(H-7)，且峰強度隨DS的增加而增加。結果表明，通過醚化反應成功形成了SMCA與PS之間的骨架連接。

圖3 多孔淀粉、氯乙酸鈉、羧甲基淀粉和羧甲基 多孔淀粉的1H NMR譜圖Fig.3 1H NMR spectra of PS、SMCA、CMS and CMPS

2.5 XRD分析

NS、PS、CMS和CMPS的X射線衍射圖如圖4所示。NS顯示出典型的B型衍射峰，分別在5.7°、15.2°、16.8°、22.8°處有其特征衍射峰。PS在制備過程中經過高溫(90 ℃)糊化，使淀粉粒分子間的氫鍵斷開，導致晶體結構消失，呈無定形物質的分散性寬峰[19]。羧甲基化過程使淀粉羥基內的分子間氫鍵斷裂，導致結構的變化，CMS沒有結晶形態，表明其具有無定形特征[22]。PS和CMPS之間的峰形幾乎沒有差異，CMS的峰形為彌散峰，未發生重結晶現象，這表明羧甲基化反應主要發生在淀粉的無定形區域，該結果與HE等[23]的研究一致。

圖4 馬鈴薯原淀粉、多孔淀粉、羧甲基淀粉和 羧甲基多孔淀粉的X射線衍射圖譜Fig.4 XRD profile of NS、PS、CMS and CMPS

2.6 N2-吸/脫附分析

國際純粹與應用化學聯合會根據孔徑大小將孔隙分為三大類：微孔(<2 nm)、介孔(2～50 nm)、大孔(>50 nm)[24]。NS、PS、CMS和CMPS的BET表面積及孔徑分布圖如圖5所示。利用BET模型計算出NS的比表面積僅為0.02 m2/g，而PS的比表面積高達42.88 m2/g，PS的平均孔徑為16.94 nm，屬于介孔材料。醚化反應制備的CMS的比表面積為0.87 m2/g，平均孔徑為7.36 nm，CMPS的比表面積為12.06 m2/g，相較于PS降低了71.88%，但相較于CMS提高了88.81%，平均孔徑為8.82 nm，較PS縮小了47.93%，較CMS提高了16.55%。CMPS比表面積較PS大幅降低，可能是由于在羧甲基化反應過程中，淀粉溶脹變形，部分孔洞坍塌造成[15]，但較CMS有較高比表面積。CMPS平均孔徑較PS更小，有文獻表明適當減小孔徑可以增強毛細作用力有助于更高的負載[25]。

2.7 熱重分析

淀粉熱特性TGA和DTG曲線如圖6所示。如圖6-a所示，所有樣品的TGA曲線中觀察到3個階段的重量損失。第一階段發生在120 ℃以下，由水蒸發引起的重量損失約7%；第二階段發生在300 ℃以下，由于羥基縮合形成的水發生分解引起主要的重量損失；當溫度達到500 ℃時，會導致碳化和灰分形成并釋放CO2。在羧甲基化過程中會生成其他無機成分，所以羧甲基化樣品的剩余質量高于PS[26]。此外，由圖6-b可知，PS，CMS的最大熱分解溫度分別為338、295 ℃，3個樣品的CMPS最大熱分解溫度分別為300、304、306 ℃，隨DS增加，最大熱分解溫度升高。實驗表明，CMPS的熱穩定性隨著DS的增加而增加，但羧甲基化降低了熱降解的初始溫度以及淀粉的熱穩定性。

a-馬鈴薯原淀粉BET表面積圖；b-多孔淀粉BET表面積圖；c-羧甲基淀粉BET表面積圖；d-羧甲基多孔淀粉BET表面積圖； e-多孔淀粉孔徑分布圖；f-羧甲基淀粉孔徑分布圖；g-羧甲基多孔淀粉孔徑分布圖圖5 馬鈴薯原淀粉、多孔淀粉、羧甲基淀粉及羧甲基多孔淀粉的BET表面積及孔徑分布圖Fig.5 BET surface area plots and pore diameter distribution of NS、PS、CMS and CMPS

a-TGA曲線；b-DTG曲線圖6 多孔淀粉、羧甲基淀粉和羧甲基多孔淀粉的TGA和DTG曲線Fig.6 TGA and DTG curves of PS、CMS and CMPS

2.8 吸附性結果分析

2.8.1 槲皮素標準曲線

將配制的1～5 mg/L的槲皮素溶液在360 nm處分別測定其吸光度，結果如圖7所示。槲皮素溶液的線性方程為y= 0.046 3x+0.316 1，R2= 0.996 5>0.99，由標準曲線可知，槲皮素在1～5 mg/L具有良好的線性關系。

圖7 槲皮素標準曲線Fig.7 Standard curve of quercetin

2.8.2 負載率的測定

不同樣品的負載率如圖8所示，負載率表達了壁材將生物活性小分子保持在其中空結構內的保留能力。根據槲皮素標準曲線方程算出CMS@Q的負載率為(0.57±0.02)%，CMPS@Q的負載率為(13.71±0.18)%，較CMS@Q提高了95.84%。

圖8 羧甲基淀粉吸附槲皮素和羧甲基多孔淀粉 吸附槲皮素的負載率Fig.8 Load factor of CMS@Q and CMPS@Q注：*表示差異顯著(P<0.05)

2.8.3 水溶性分析

不同樣品的水溶性如圖9所示，NS經過高溫糊化，水溶性略微提升至2.67%，PS由于比表面積提高，親水性基團暴露較多，水溶性得到改善，達到12.67%。CMS的水溶性為46.33%，CMPS的水溶性為67.67%，較CMS提高了46.06%。CMS@Q和CMPS@Q的水溶性分別為23.33%和34.00%，較純槲皮素水溶性均得到了較大的提升，但CMPS@Q的水溶性較CMS@Q提高了45.74%。有研究表明通過提高溶解度可有效提升大多數低溶解度功能性成分的體內生物利用度[27]。本研究結果顯示，CMPS作為可消化降解的載體，有望在食品和醫藥相關領域應用。

圖9 馬鈴薯原淀粉、多孔淀粉、羧甲基淀粉、羧甲基 多孔淀粉、羧甲基淀粉吸附槲皮素和羧甲基多孔淀粉 吸附槲皮素的水溶性Fig.9 Water solubility of NS、PS、CMS、CMPS、 CMS@Q and CMPS@Q注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3 結論

實驗制備的PS屬于介孔材料，與原淀粉相比，其比表面積增加，暴露了更多反應位點，有效提高了與客體分子的接觸，提升了反應效率，且隨著反應客體濃度的增加，DS也隨之增加，表明多孔處理有利于淀粉改性反應的發生。PS顆粒結構強度較弱，羧甲基化反應中受熱溶脹，部分孔洞坍塌，比表面積和孔徑均有所減小，但較原淀粉制備的CMS，比表面積仍然較大。反應中主客體分子間形成了醚鍵但并未形成新的結晶結構，CMPS與PS一樣呈非晶無序狀態，冷水可溶性顯著提升，熱穩定性有所降低。實驗制備的CMPS具有較小的孔徑、較好的比表面積和冷水溶解性，可作為生物活性物質的吸附劑和功能性載體，有望在食品、醫藥等相關領域作為可降解性生物載體材料應用。