大米和玉米比例對鲊廣椒品質及細菌類群的影響

席啦，熊英梅，王玉榮，侯強川，王婷，楊瑩，郭壯*

1(湖北文理學院,湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽，441053)2(湖北文理學院,乳酸菌生物技術與工程襄陽市重點 實驗室，湖北 襄陽，441053)3(襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北 襄陽，441001)

作為我國地方特色發酵食品，鲊廣椒主要以二荊條辣椒和大米粉或玉米粉為原料，經剁碎和攪拌均勻后裝壇密封發酵而成[1]，因其特殊的發酵原料、酸辣的口感和特殊的香味受到廣大消費者的歡迎[2]。在我國貴州等少數民族聚集區的居民食用的鲊廣椒常以玉米為原料進行發酵[3-4]，而在湖北荊州等地區常使用大米作為發酵基質進行鲊廣椒的制作。本研究團隊對鲊廣椒中微生物多樣性進行了解析[5]，發現真菌含量過高不利于鲊廣椒滋味品質的形成[6]，但乳酸菌對于鲊廣椒風味和滋味品質的塑造具有重要的作用[7]；崔夢君等[8]亦發現不同的發酵工藝和辣椒會影響莽椒的品質和發酵菌群。因此，不同的原料不僅可以賦予鲊廣椒不同的風味，還可能對其微生物多樣性產生影響[4]，探究不同原料對鲊廣椒品質和菌群的影響是十分必要的。

感官品鑒被廣泛地應用于食品品質的評價，但其太過于依賴品鑒人員的專業技能，且容易受到主觀因素的影響[9]。隨著仿生設備的發展，電子舌和電子鼻等仿生學設備被廣泛的應用于傳統發酵食品滋味和風味的評價[10-11]，兩者對于食品的品質具有整體選擇性，在食品品質評價方面具有較大的優勢[12-13]。研究人員對發酵食品中微生物進行解析的目的之一是探討微生物對食品品質的影響，進而尋求提升發酵食品品質的途徑。而隨著高通量技術的迅速發展，以Illumina為代表的第二代測序技術在解析傳統發酵食品中扮演著重要的角色，這也為本研究探究鲊廣椒中微生物多樣性提供了有效的手段。

本研究分別以不同配比的大米和玉米為原料進行了鲊廣椒制備，同時使用電子舌和電子鼻技術對不同鲊廣椒的品質進行了評價，并結合高通量測序技術對其蘊含微生物群落結構進行了解析，以此探究添加玉米對鲊廣椒整體品質的影響，以期對鲊廣椒制作工藝的改良提供一些理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米，湖北京和米業有限公司；玉米，贛州市九鯉湖食品有限公司；二荊條辣椒及各種調味料，市售；食鹽，滄州鹽業集團銀山食鹽有限公司。

陽離子溶液、陰離子溶液、預處理溶液、參比溶液、內部溶液，日本INSENT公司；引物338F/806R，武漢天一輝遠生物科技有限公司合成；10×PCR buffer、FastPfu Fly DNA聚合酶和dNTPs Mix，北京全式金生物技術有限公司；DNA基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設備

LRH-70F生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；CR21 N高速冷凍離心機，日本HITACHI公司；SA 402B電子舌，日本Insent公司；PEN3電子鼻，德國Airsense公司；vetiri梯度基因擴增儀，美國AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度計，美國Nano Drop公司；Fluor Chem FC3型化學發光凝膠成像系統，美國ProteinSimple公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺，美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鲊廣椒的制備

設置5個試驗組，其中A1組均為大米粉，A5組均為玉米粉，A2、A3和A4組大米粉和玉米粉的質量比分別為3∶1、1∶1和1∶3，每組大米粉和玉米粉的總質量均為800 g。稱取40 g食鹽、3.20 g白胡椒、3.20 g花椒和225 g剁碎后的二荊條辣椒各5份，分別添加至A1～A5中攪拌均勻后裝入壇中進行密封發酵，并在壇口噴灑白酒進行殺菌，封口后置于30 ℃恒溫發酵30 d。

1.3.2 鲊廣椒滋味品質的測定

準確稱取鲊廣椒50 g和量取150 mL蒸餾水，混合攪拌均勻后進行抽濾，取上清液10 000 r/min離心8 min后裝入燒杯中置于4 ℃冰箱中靜置24 h，吸取上清液儲存于測試杯中備用。參照楊成聰等[14]關于蘇打水滋味指標的測試參數進行設置，使用電子舌對鲊廣椒的酸、苦、澀、咸和鮮等5個基本味和后味A、后味B和豐度等3個基本味回味進行數字化測定，每份鲊廣椒平行測定4次，取后3次作為本實驗測試數據進行后續分析。

1.3.3 鲊廣椒風味品質的測定

準確稱取20 g鲊廣椒置于電子鼻專用樣品瓶中蓋上蓋帽進行密封。將樣品瓶置于50 ℃水浴鍋中保溫30 min后于室溫靜置30 min，進行鲊廣椒風味品質的數字化測定。參照張逸舒等[15]的方法進行測試參數設置，對鲊廣椒的10個特征型風味物質進行測定，每個樣本平行測定3次，每次測試時間為90 s，所有樣本在50 s后均達到平臺期，本研究選取59、60、61 s時響應值的平均值作為樣本的測試數據用于后續分析。

1.3.4 鲊廣椒微生物宏基因組DNA提取及測序

稱取1.0 g左右的鲊廣椒，使用試劑盒進行微生物宏基因組DNA的提取。參照崔夢君等[8]的方法進行PCR擴增參數的設置，并對檢驗合格的DNA進行擴增。使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳對擴增DNA產物的濃度和純度進行檢驗，并將檢驗合格的DNA產物送至上海美吉生物醫藥有限公司進行測序。

1.3.5 生物信息學分析

依照崔夢君等[8]參數進行序列的質量控制，并根據Barcode標簽信息對下機序列進行分配，將序列歸并到不同的樣本中。本研究以QIIME v1.70平臺為依托，并結合個性化分析流程對鲊廣椒中細菌構成和多樣性進行解析，具體分析流程參照YANG等[16]對奶酪中細菌多樣性的研究。

1.3.6 多元統計學分析

本研究基于多元統計學分析對鲊廣椒中風味指標的變異系數進行計算；基于R軟件采用斯皮爾曼相關性分析對品質指標和優勢菌屬與原料之間的相關性進行了分析；基于R軟件進行了冗余分析。使用R和Origin 2017b進行數據的可視化。

2 結果與分析

2.1 基于電子舌和電子鼻不同原料配比鲊廣椒品質的分析

本研究首先使用電子舌和電子鼻對不同原料配比鲊廣椒的滋味和風味品質進行數字化評價，并對數據矩陣進行了統計分析。不同原料配比鲊廣椒中各滋味指標相對強度的變化趨勢如圖1所示。

a-酸、苦、咸、鮮味指標；b-澀味、后味A、后味B、豐度指標圖1 不同鲊廣椒中滋味指標的相對強度Fig.1 The relative intensity of the taste indexes in different Zha-Chili注：A1、A2、A3、A4和A5分別代表大米、m(大米)∶m(玉米)=3∶1、 m(大米)∶m(玉米)=1∶1、m(大米)∶m(玉米)=1∶3和玉米制作 的鲊廣椒(下同)

由圖1可知，在鲊廣椒制作中添加不同比例的玉米作為原材料會對鲊廣椒的滋味品質造成較大的影響，其中酸味、苦味和咸味等受到的影響較大(相對強度的極差值均>1)，且以酸味受到的影響最大(相對強度的極差值為3.25)。值得注意的是，隨著發酵基質中玉米的比例的提高，鲊廣椒酸味的強度不斷增加，而苦味和咸味則沒有這樣的趨勢。相關報道顯示，當滋味指標的相對強度>1時，消費者便可以通過感官予以識別。由此說明，在發酵基質中添加一定比例的玉米時，會直接影響消費者在食用鲊廣椒時的口感。進一步對鲊廣椒的風味品質進行分析，鲊廣椒風味指標的相對強度如表1所示。

表1 不同鲊廣椒中風味指標的相對強度表Table 1 The relative intensity table of different flavor indexes in Zha-Chili

由表1可知，在鲊廣椒的發酵基質中添加一定比例的玉米亦會直接影響其風味品質，其中W1C、W5S、W1S和W2S等風味指標在組內存在較大的差異(變異系數>20%)。且玉米的添加能明顯增加鲊廣椒中芳香類風味物質的含量，并降低鲊廣椒中氮氧化合物、甲烷和乙醇的含量。

2.2 鲊廣椒中序列豐富度和多樣性分析

在使用仿生設備對鲊廣椒的品質進行評價的基礎上，進一步使用高通量測序技術對鲊廣椒中微生物多樣性進行了解析，從而探究添加玉米對鲊廣椒菌群結構的影響。本研究以測序量為自變量，以發現物種數和香農指數為因變量進行稀疏曲線和香農曲線的繪制，結果如圖2所示。

由圖2可知，隨著測序量的增加，發現物種數呈現上升趨勢但并沒有達到平臺期，而香農曲線已基本達到平衡狀態，說明隨著測序量的增加可能會有少量新的物種被發現，但在此測序量下，鲊廣椒中的微生物多樣性已得到充分的解析，說明本研究的測序水平能夠滿足后續分析分子生物學分析的要求。進一步對添加玉米的比例和菌群多樣性的關系進行了分析，α多樣性指數隨玉米添加量變化的曲線如圖3所示。

a-稀疏曲線；b-香農曲線圖2 稀疏曲線和香農曲線Fig.2 Sparse curve and Shannon curve

圖3 不同鲊廣椒中微生物的α多樣性指數Fig.3 Alpha diversity index of microbes in different Zha-Chili

由圖3可知，4種α多樣性指數隨著發酵基質中玉米比例的增加均呈現規律性的變化。超1指數和發現物種數隨著玉米添加量的增加而不斷增大，盡管在剛開始有略微的降低，但整體上呈現明顯的上升趨勢；而香農指數和辛普森指數則隨著玉米含量的增加而呈現出不斷下降的趨勢。超1指數和發現物種數常用來估算樣本中微生物的豐度，而香農指數和辛普森指數常用來估算樣本中微生物的多樣性。由此可見，隨著發酵基質中玉米比例的增加，鲊廣椒樣本中微生物的多樣性不斷降低，而微生物的豐度不斷上升。鲊廣椒中優勢細菌門和屬相對含量的比較分析，如圖4所示。

圖4 鲊廣椒中優勢細菌門和屬的比較分析Fig.4 Comparative analysis of dominant Phylum and genus in Zha-Chili

由圖4可知，鲊廣椒中優勢細菌門(平均相對含量>0.10%)有4個，分別為Firmicutes(硬壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Actinobacteria(放線菌門)和Cyanobacteria(藍菌門)，其平均相對含量分別為97.99%、1.18%、0.37%和0.36%；而優勢菌屬(平均相對含量>0.10%)亦有4個，分別為Lactobacillus(乳桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Thermoleophilum(棲熱嗜獅菌屬)和Acinetobacter(不動桿菌屬)，平均相對含量分別為97.90%、0.47%、0.36%和0.16%。值得注意的是，高通量測序結果顯示在發酵基質中添加玉米并沒有改變鲊廣椒中優勢細菌屬的種類，且其優勢菌屬與以往研究所報道的相一致[5]。

玉米作為世界上一種重要的糧食作物，其廣泛的分布于中國、美國和巴西等國家，與傳統水稻相比，玉米具有更高的淀粉、糖類和維生素含量，應用前景廣闊[17]。本研究亦發現，隨著玉米添加量的增加，乳桿菌屬的含量不斷下降，但其幅度很小，而其他優勢菌屬呈現小幅度的線性上升。鲊廣椒中乳桿菌屬為鲊廣椒中的絕對優勢菌屬，占比高達98%，說明乳桿菌屬可能對鲊廣椒的品質有著較大的影響，其能發酵碳水化合物產生大量的乳酸和揮發性風味物質影響著鲊廣椒的品質。而相關報道顯示，玉米中富含豐富的淀粉、纖維素和維生素等營養成分[18]，這可能為鲊廣椒中低豐度的優勢菌屬提供了充足的營養成分，最終導致其相對含量的小幅度增加。

2.3 鲊廣椒中菌群與品質的相關性分析

為進一步探究玉米對鲊廣椒品質指標和菌群結構的影響，本研究對鲊廣椒發酵基質中玉米的比例與鲊廣椒品質指標和菌群之間的相關性進行了計算，結果如圖5所示。

圖5 玉米比例與品質指標和菌群結構的相關性分析Fig.5 Correlation analysis of maize proportion with quality index and microbes structure

由圖5可知，玉米含量與酸味、苦味、W1C、乳桿菌屬、假單胞菌屬、棲熱嗜獅菌屬和不動桿菌屬之間呈顯著相關性，其中玉米含量與酸味、假單胞菌屬、棲熱嗜獅菌屬和不動桿菌屬呈顯著正相關，而與苦味和乳桿菌屬呈顯著負相關。值得注意的是，玉米含量與全部優勢菌屬之間均存在顯著相關關系。本研究使用冗余分析，進一步探討了菌群與品質之間的聯系，其結果如圖6所示。

圖6 冗余分析Fig.6 Redundancy analysis

由圖6可知，A3、A4和A5號樣品與酸味和W1C有著良好的賦值相關，而A1號樣品與苦味、咸味、W1S、W2S和W5S之間有著良好的賦值相關，因而上述指標是導致不同鲊廣椒樣本品質總體結構的顯著差異的關鍵指標。且乳桿菌屬與苦味和咸味具有較強的一致性，而假單胞菌屬、棲熱嗜獅菌屬和不動桿菌屬與酸味和W1C之間具有較強的一致性。

玉米因其自身的影響特性亦賦予了鲊廣椒不同滋味品質，盡管隨著玉米含量的增加導致鲊廣椒中乳桿菌屬的相對含量出現了小幅度的下降，但其酸味和芳香味強度卻明顯加強，這可能是因為玉米自身的糖含量較高[19]，更容易被微生物所利用，并在食鹽的催化下強化了其口感而起到提味的作用。相關報道表明，乳桿菌屬能代謝發酵基質中糖的糖類物質而改善發酵制品的風味特性[20]，這也解釋了為什么鲊廣椒中乳桿菌屬的相對含量降低了，而酸味和芳香味反而進一步提升。

3 結論

本研究分別以大米和玉米為原料制作了鲊廣椒，同時采用電子舌和電子鼻技術對鲊廣椒的品質進行了數字化評價，并結合高通量測序技術對鲊廣椒中細菌多樣性進行了解析。研究表明，在鲊廣椒的發酵基質中添加玉米能明顯增加鲊廣椒樣品的酸味和芳香味，而降低苦味、咸味、氮氧化合物、甲烷和乙醇的強度；鲊廣椒中主要以乳桿菌屬、假單胞菌屬、棲熱嗜獅菌屬和不動桿菌屬為主，而鲊廣椒中玉米的添加比例與優勢菌屬和微生物多樣性之間有著顯著的相關性。綜合分析表明，在鲊廣椒的發酵基質中添加一定比例的玉米能夠使乳桿菌屬的相對含量下降，同時可以降低鲊廣椒的苦味和咸味，而增加其酸味和芳香味。