牛乳來源神經保護肽的研究進展

吳秀英，賴孟瑄，姜云蕓，劉紅霞，馬海然*

1(內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司，內蒙古 呼和浩特，011500)2(蒙牛高科乳制品(北京)有限責任公司，北京, 100107)

神經退行性疾病是一種隨時間推移而惡化的疾病，因神經元和(或)其髓鞘的喪失導致功能障礙，其主要臨床癥狀為認知損傷/障礙[1-2]。認知是通過思考、經歷和感受來獲得知識和理解的心理活動或過程，涉及大腦高級功能的眾多方面，例如記憶、語言、注意力、決策判斷、感知理解和視覺空間能力等[3]。因此，認知損傷/障礙嚴重影響患者的生存質量。

引起老年人認知能力下降、癡呆的主要原因包括阿爾茨海默癥(Alzheimer′s disease,AD)和帕金森病(Parkinson′s disease,PD)[4]。美國神經病學會調查顯示AD總體發病率為1.82%～3.04%，預計2050 年全球AD 患者可突破1 億人，其中生活不能自理者將超過40%[5]。PD是繼AD后的第二大影響大腦功能的神經退行性疾病，最初表現為運動障礙，隨疾病發展表現出認知及其他行為問題[6]。流行病學調查顯示，中國55歲以上人群中PD患病率為1%，65歲以上人群為1.7%[7]。

神經退行性疾病的發展不僅受年齡的影響，還受飲食、代謝狀態、整體生活質量、生活經歷等的影響[8]。截至2020年11月第七次人口普查數據表明，60歲以上中國老年人占總人口比例的18.70%。老年性疾病如神經退行性疾病、心血管疾病、糖尿病、癌癥等，嚴重影響人民健康，同時極大的增加了社會負擔[9]。目前市場上關于AD的治療藥物主要有他克林、卡巴拉汀等，但基本都有嚴重副作用，如肝毒性、惡心、嘔吐等[10]。人們越來越關注天然無副作用的生物活性物質，如多酚、多不飽和脂肪酸、肽和氨基酸等，作為功能食品和膳食補充劑來抵御或緩解神經問題[2, 11-13]。人們對于蛋白質來源的生物活性物質作為功能食品的興趣日益濃厚，蛋白質來源的活性物質在營養上和功能上的優勢，使得具有影響認知和記憶作用的神經保護肽得到了廣泛的關注。

神經保護肽的來源一般分為4種：(1)天然未加工的食品；(2)微生物、動物或植物蛋白的酶水解物；(3)微生物、動物或植物蛋白的微生物發酵物；(4)體外直接合成，包括化學法和酶法[2]。當前已從天然產物中發現超過200種與認知和記憶力調控相關的生物活性肽[14]。酶解法是當前制備神經保護肽最為廣泛的方法，其優點包括：水解特異性高、反應條件溫和可控、產品純度高、能量需求低等[15]。神經保護肽目前研究主要集中在功效驗證，這些活性肽如何在人體中發揮功效還有待進一步的揭示。研究發現部分神經保護肽經人體攝入后，一部分作為生物活性成分的前體物質，一部分則直接吸收入血后作用于機體，達到提升腦健康、緩解神經退行性疾病癥狀的功效[2]。本文綜述了近年來牛乳來源的神經保護肽在神經保護方面的功能、組成、結構特點以及作用機理，為神經保護功能乳源肽的開發和應用提供參考。

1 牛乳來源的神經保護肽功能

1.1 牛乳及牛乳制品維護認知健康

近年來，臨床研究證明了牛乳制品攝入對于維護認知健康的積極作用(表1)。SU等[16]研究分析了4種不同食物模式與認知損傷風險的相關性，結果表明，含有牛奶及相關制品的食物模式1(Food Patterm 1,FP1)與患癡呆風險的相關性最低，且參與者有更良好的方向感、記憶力與語言功能。HUANG等[17]利用半定量食物頻率問卷評估了飲食習慣與認知健康的關聯。結果進一步證實，乳制品攝入量與患認知功能障礙的幾率呈負相關。從食物模式角度出發，確認了“蛋和奶制品偏好”模式下的受試者患輕度功能認知障礙的概率更低[17]。TESSIER等[18]針對加拿大老年群體的調研發現，總乳制品、奶酪和低脂乳制品的攝入量與執行功能(指有機體對思想和行動進行有意識控制的心理過程)呈正相關。同時，酸奶攝入量與記憶力和語言流利程度呈正相關。

奶酪、酸奶等經酶解或發酵處理的乳制品，是乳源生物活性肽的主要來源。生物活性肽與記憶、認知相關功能的研究主要集中在細胞與動物實驗，近年來研究較為成熟的神經保護肽逐步轉向臨床研究(表1)。乳源神經保護肽的功能主要包括緩解神經炎癥損傷、改善記憶功能、提升腦部血氧等。

表1 牛乳及制品影響認知健康臨床研究Table 1 Studies on bovine milk-related cognitive health clinical trials

1.2 神經保護肽緩解神經炎癥損傷

研究發現神經保護肽可以緩解炎癥導致的AD病情惡化。HANDTTU等[24]與MIN等[25]的研究發現，患AD的小鼠通過口服牛乳來源的神經保護肽，下調血液中以及海馬體等部位炎癥因子的含量、抑制β-淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)沉積，從而緩解神經炎癥導致的認知損傷。ANO等[26]的實驗進一步證實，小鼠口服酪蛋白來源的二肽，經吸收入血進入大腦，抑制小膠質細胞的炎癥，下調認知衰退的程度。流行病學和臨床研究發現，AD患者腦中活化的小膠質細胞會釋放多種促炎因子，導致疾病過程惡化及神經元凋亡[27]。

1.3 神經保護肽改善記憶功能

乳源神經保護肽具有改善記憶損傷的功能。OHINATA等[28]在一項健康雄性小鼠的研究中發現，口服β-乳球蛋白來源的β-乳緊張素可以激活神經遞質多巴胺的受體，從而改善和鞏固記憶。OHSAWA等[29]的研究證明，口服發酵牛乳來源的酪蛋白衍生肽緩解了東茛菪堿誘導小鼠的記憶損傷。ANO等[30]的研究進一步證明，健忘癥小鼠服用神經保護肽，提升了額葉皮層中的多巴胺和去甲腎上腺素水平，抑制了小鼠認知能力的進一步衰減。

牛乳來源的生物活性肽表現出的神經保護作用也在臨床上得到了進一步的證實(表1)。KITA等[23]發現，50～75歲的健康受試者服用12周牛乳來源的β-乳清肽，可以調節單胺系統，從而改善了受試者的記憶力和注意力。神經心理學測試與近紅外檢測腦部血流情況發現，乳清肽增強了額葉皮層活動，改善了與視覺空間和結構相關的認知能力[23]。SASAI等[31]的研究結果表明，服用地衣芽孢桿菌酶解產生的內酯十肽(LNDP)可提升30～59歲的健康中年男性受試者的復合記憶和言語記憶能力，同時增強了處理速度、執行能力和認知靈活性。

1.4 神經保護肽調節神經細胞代謝

NAGAI等[32]的研究發現，短期高脂飲食(high-fat diet,HFD)會導致認知損傷，HFD小鼠口服乳源三肽(YLG)，改善了HFD引起的神經干細胞的增殖減少，增加了海馬體中的神經生長因子，緩解了高脂飲食攝入引起的認知能力下降。ICHINOSE等[33]圍繞2個二肽YY，YW開展的動物實驗發現，這2個二肽可以通過上調與酪氨酸和色氨酸相關的代謝基因，增強相關代謝物如兒茶酚胺的合成和代謝，來提高腦部記憶功能。

1.5 神經保護肽改善腦部血氧

近年來的臨床實驗證實乳源神經保護肽通過提升腦部血氧量進而緩解認知損傷。乳三肽很早就在牛乳中被發現，且被證實在血壓調控、炎癥緩解、骨骼健康等諸多領域存在潛在功能價值[21,34-35]。AKAZAWA等[20]臨床研究證實乳三肽通過舒張血管，增加了受試中老年人的腦血流速度，一定程度上降低患腦血管病及認知健康受損的風險。HUANG等[17]的人群實驗以是否有運動干預為變量之一，研究當前較為成熟的乳三肽VPP、IPP對神經保護的作用,結果發現，8 周的乳三肽攝入提升了腦部前額葉皮質層的含氧量，從而激活和改善中老年人的認知功能。HAMASAKI等[21]圍繞76名中老年人的臨床試驗觀察發現，服用乳三肽6周后，受試者的復合記憶和言語記憶明顯改，證明了乳三肽在神經保護方面發揮的作用。

2 牛乳來源神經保護肽的構效關系

在以往的研究中，對食物來源的神經保護作用肽的氨基酸組成、序列均進行了報道[36-39]。這些研究也證明神經保護作用肽在結構組成上的特點與其功效實現存在著密切的關系。乳源發揮神經保護作用的多肽由2～20個氨基酸組成，主要來源于牛乳中的酪蛋白，部分來源于牛乳中的乳清蛋白(表2)。大部分牛乳來源的神經保護肽經酶解產生，一些氨基酸組成序列完整、明確的多肽則通過化學合成制備。

表2 牛乳來源的神經保護肽Table 2 Studies on bovine milk-derived neuroprotective peptides

2.1 乳源神經保護肽的氨基酸疏水性

對神經保護肽的氨基酸組成分析發現，疏水性氨基酸占比較高。這可能與提升肽的疏水性，從而使它們能滲透到細胞中并到達和作用于它們的特定目標有關。疏水氨基酸對食物來源神經保護肽的功效發揮有顯著作用，其中芳香族氨基酸與支鏈氨基酸具有突出貢獻[2]。統計近幾年乳源神經保護肽(表2)中均含有疏水氨基酸，且疏水氨基酸的數量均占到了氨基酸總量的66%以上。對鏈長在7及以下的短肽分析發現，70%的短肽都含有至少一個芳香族氨基酸。鏈長在7以上的乳源肽中，疏水氨基酸數量占統計總數的70%。這些乳源肽主要經菌株發酵和酶解產生且神經保護作用突出。色氨酸是疏水氨基酸和芳香族氨基酸，出現在一些乳源神經保護肽的氨基酸組成中，可能發揮潛在認知調控的功效。色氨酸經代謝參與犬尿氨酸的合成，STONE等的研究證據表明犬尿氨酸與神經系統疾病的行為和認知癥狀有關[40-41]。同時，研究發現親水氨基酸中堿性與酸性氨基酸也均對肽段的神經保護作用有影響[2]。谷氨酸是神經保護肽中常見的酸性氨基酸之一，也是中樞神經系統中主要的興奮性神經遞質，通過高親和力轉運系統轉運穿過血腦屏障后可起到神經保護作用[2, 42]。

2.2 乳源神經保護肽的氨基酸序列特點

乳源神經保護肽氨基酸的序列長短與神經保護肽的功效實現方式相關，短肽相對于多肽而言更有可能通過腸屏障直接入血發揮功效[43]。例如短肽VPP、IPP、WY、WM等，可以直接透過小腸上皮細胞進入血液循環[20, 26]。長鏈多肽可能通過消化道中的酶分解或菌群代謝過程實現神經保護作用。然而長鏈的多肽，其構效關系還未被完全揭示。例如KEMPFPKYPVEP這個神經保護九肽降解物中的短肽PVEP也與記憶鞏固存在相關性[30]；來源于發酵牛乳的20肽(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)在消化道被分解后[29]，可能會釋放出乳三肽VPP與IPP。臨床實驗表明乳三肽具有認知保護作用，說明一些長鏈多肽可能通過酶解后釋放出的短肽發揮實際調控作用。同時，研究發現某些長鏈多肽在人體胃腸道中并不能被胃蛋白酶等分解，而被認為以整體的形式發揮作用。來源于擬載蛋白-A的多肽D-4F經人體口服后[24]，在血液中有微量檢出，說明其通過某種方式透過了腸道進入血液。來源于β-酪蛋白的多肽NIPPLTQTPVVVPPFLQPEV(β-酪蛋白73～92)與內脂十肽都被發現無法在體外被消化液酶解[31, 44]。乳源肽的神經保護作用已經獲得了越來越多的關注，這類多肽在人體消化道內的穩定性以及如何到達人腦并發揮作用，還有待進一步研究。

3 牛乳來源神經保護肽的調控機理

神經退行性疾病的發生涉及氧化損傷、線粒體功能障礙、神經炎癥、淀粉樣蛋白斑塊的細胞外沉積等方面[2, 45-47]。目前的研究發現，牛乳來源的神經保護肽涉及到的調控通路主要集中在線粒體、氧化應激和神經炎癥3個方向[24-26, 28, 33, 48]。

3.1 線粒體功能障礙

神經保護肽通過介導線粒體相關的細胞凋亡通路，保護神經細胞免受線粒體功能障礙影響。線粒體功能障礙常見于神經退行性疾病患者的大腦中，當神經細胞的氧化壓力增加時，線粒體就會發生氧化損傷。損傷后的線粒體導致胞內活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的數量上升，從而引發氧化應激與炎癥反應，進而導致神經元細胞凋亡和壞死(圖1)。細胞凋亡與致死因子的激活有關，如線粒體氧化損傷激活腺苷酸激酶(caspases)，進而通過線粒體內膜上的凋亡通路或死亡受體通路激活細胞凋亡[2]。同時，線粒體調控通路的相關基因通過調控胞內蛋白，進而在細胞凋亡的進程中發揮重要作用。Bcl-2 家族就是一類參與密切的主要調節因子，例如抗細胞凋亡的因子Bcl-2、Bcl-xL，促細胞凋亡的因子HRK、BAX等[49]。JIN等[48]的一項研究發現，水解的乳清蛋白肽上調了神經細胞PC12中Bcl-2的表達，抑制了BAX的表達，同時阻斷了胞內62%的Caspase-3激活，證明了牛乳乳清蛋白來源的神經保護肽可以通過調控線粒體關聯的通路，進而抑制神經細胞發生因線粒體損傷導致的細胞凋亡。

圖1 記憶力與認知能力下降涉及的通路間的聯系與關系[2]Fig.1 The connection and relationship between memory and cognitive decline related pathways[2]注：Bcl-2 family表示細胞凋亡因子；NFTs表示神經元纖維纏結， Nrf2表示核因子紅細胞-2相關因子，HO-1表示血紅素加氧酶-1， TrkB表示酪氨酸激酶受體B，CREB表示cAMP反應單元結合蛋白，BDNF 表示腦源性神經營養因子，SYN表示突觸素，PSD-95表示突觸后密度蛋白-95

3.2 氧化應激

神經保護肽通過影響氧化應激導致的胞內蛋白變化，保護神經細胞免受損傷。氧化應激的發生是由于胞內ROS數量超過了人體的天然抗氧化防御能力調控的范圍所導致的[50]。氧化應激導致神經炎癥反應、線粒體損傷，這些現象都與神經退行性疾病的發生和發展存在關聯[2]。氧化應激誘導胞內蛋白的變化，例如AD患者神經細胞中就發現Aβ的聚集沉積[2]。HANDATTU等[24]的一項利用患阿爾茲海默癥小鼠的研究發現，A-1載脂蛋白來源的多肽D-4F的給藥，使得灌胃組相比于與空白飲水組，胞內的Aβ含量有明顯的下降，并且如果與普伐他丁結合使用可顯著下調大腦海馬區覆蓋內Aβ的沉積。MIN等[25]利用牛乳酪蛋白水解物CH-3驗證發現，酪蛋白水解物中的神經保護肽可以通過抑制淀粉樣蛋白β沉積，緩解小鼠的認知衰退、改善大腦的認知功能。

3.3 神經炎癥

神經保護肽可直接調控炎癥因子通路或間接調控氧化應激抑制神經炎癥的發生。氧化應激導致ROS的過度產生與神經炎癥緊密相關，進而誘導AD、PD等神經退行性疾病發生。氧化應激與炎癥反應之間相互關聯相互串擾，神經炎癥的過程會誘導氧化應激，而氧化應激可以通過激活如NF-κB通路在內的多條通路，誘導和增加促炎基因表達，進而引起神經炎癥[51]。ANO等[26]的研究證實，二肽WY有良好的抗氧化作用。通過細胞與小鼠實驗驗證發現，WY二肽可以通過腸道吸收后入血進入腦部，在腦部通過促進脂多糖的產生，抑制小膠質細胞內的炎癥反應，進而抑制淀粉樣蛋白Aβ的沉積從而發揮神經保護作用。HANDATTU等[24]與MIN等[25]在研究淀粉樣蛋白Aβ的調控通路時，均對神經細胞內的炎癥因子進行了分析和檢測結果證明，乳源多肽的施用，抑制了小鼠海馬體中的腫瘤壞死因子和炎癥因子如白細胞介素1β的表達，證明了牛乳來源生物活性肽的抗炎作用對神經保護的貢獻。

3.4 調控機理待深入研究

臨床研究結果提示，乳源神經保護肽在認知與記憶力方面的調控作用與乳源肽在抗氧化、抗炎等功效的調控機制上存在關聯。研究發現，神經保護肽通過抗氧化的相關調控通路，調節炎癥因子如腫瘤壞死因子、白細胞介素-1β等表達，抑制神經膠質細胞等受氧化應激而發生的凋亡等過程，從而達到神經保護作用，緩解AD與PD患病人群的認知與記憶損傷問題[24-25，48]。但目前神經保護肽的調控過程還未被完整揭示，例如D-4F治療發現可以顯著抑制Aβ沉積，但目前仍不清楚這種肽是否通過進入大腦與Aβ沉積引起的氧化應激標志物局部相互作用發揮功效。同時，Aβ沉積是一個逐漸積累的過程，達到一定階段才會出現神經炎癥等問題。神經保護肽如何抑制Aβ沉積的發展從而達到預防神經退行性疾病，還有待更深入的研究。

4 展望

牛乳來源的生物活性肽因其功能廣泛受到諸多關注，盡管越來越多的生物活性肽通過動物和臨床實驗等證實其神經保護作用，但目前對于神經保護肽的研究主要集中在功效評估上。同時，這些多肽在消化道中的穩定性、血腦屏障上的通透性等相關問題的答案仍有待揭示。

近年來的人群實驗進一步證實了乳制品攝入對于緩解神經損傷和保護認知健康的潛在價值。尤其是關于發酵乳和奶酪這兩類在生產過程中需經過酶解和發酵過程的牛乳制品研究。牛乳中一些無法直接在消化道中發揮功效的多肽，可以通過消化液與腸菌的作用轉化為可吸收的活性肽，可能進一步豐富神經保護肽的種類和價值，發揮更有效的調控作用。因此，發酵乳與奶酪等乳制品中的生物活性肽具有良好的研究和應用前景。