FAM83B對肝癌細胞的作用及機制研究*

李鮮麗，范晶華，晁春梅，遲曉偉，楊春霞，陳昕婷，韋嘉

[1.昆明醫科大學第一附屬醫院 感染與肝病科，云南 昆明，650032；2.昆明醫科大學第四附屬醫院（云南省第二人民醫院）肝臟疾病研究中心，云南 昆明 650021]

肝細胞癌是全球第6 大最常見的癌癥，具有生存率低、復發率高等特點，嚴重威脅患者生命[1-2]。肝細胞癌通常是由基礎疾病引起，例如乙型肝炎，丙型肝炎和肝纖維化[3-4]。目前仍然沒有有效的治療方法。自噬是一種常見的細胞內自降解過程，其中細胞蛋白或細胞器被雙膜自噬體包裹，并最終與溶酶體融合[5-6]。在腫瘤的發病機制中，自噬具有雙重作用[7-8]：早期可抑制腫瘤的形成，在腫瘤的發展階段可促進腫瘤細胞生長。自噬相關蛋白微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ并定位在自噬膜上，這是目前使用最廣泛的自噬標志物，因此LC3-Ⅱ的數量反映了自噬體和自噬相關結構的數量[6-7]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素哺乳動物靶蛋白（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/Akt/mTOR）通路是調節細胞轉錄、遷移、代謝、增殖和存活的關鍵信號通路[9]，對乳腺癌、結腸癌、卵巢癌等的發生、發展起關鍵作用[10]。因此，筆者推測PI3K/Akt/mTOR 通路和腫瘤細胞自噬作用在肝癌的發生中同樣起著至關重要的作用。

具有序列相似性的家族83 成員B（family with sequence similarity 83 member B,FAM83B）是FAM83蛋白家族的成員，FAM83B 被證實通過EGFR/RAS/MAPK 通路參與乳腺癌的發生、發展[11]。此外，FAM83B 可以激活腫瘤細胞PI3K/Akt/mTOR 通路，促進乳腺癌細胞的增殖、非貼壁生長，提高致瘤性[11]。越來越多的證據表明，FAM83B 在多種腫瘤中高表達，包括肺鱗狀細胞癌和胰腺癌[12-13]。然而，FAM83B 在肝癌中的作用仍然未知。

1 材料與方法

1.1 組織標本與細胞

組織標本源于2017年3月—2019年3月在昆明醫科大學第一附屬醫院行肝癌切除的62 例患者的肝癌組織和癌旁正常組織，所有組織標本經病理檢查和免疫組織化學法確診。所有新鮮標本通過液氮和甲醛分別保存，本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。人類肝癌細胞系（HepG2、Hep3B）和正常人類肝細胞系（LO2）購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM）、10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（美國Hyclone 公司），Lipofectamine 2000 Reagent 試劑盒、TRIzol 試劑盒（美國Invitrogen Life Technologies 公司），FAM83B的siRNA（si-FAM83B）和無序siRNA（si-NC）慢病毒載體（上海吉瑪制藥技術有限公司），PrimeScript RT試劑盒、SYBR Premix ExTaq Ⅱ試劑盒（日本TaKaRa公司），CCK-8 試劑盒（日本Dojindo Laboratories 公司），免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），細胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。

1.2.2 主要儀器7500 型實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀（美國Applied Biosystems 公司），酶標儀（美國Bio-Tek 公司），流式細胞儀、Transwell 室（美國BD Biosciences 公司），光學顯微鏡（日本Olympus株式會社）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養將HepG2、Hep3B、LO2 細胞置于DMEM 中，補充10%FBS、100 μg/mL 鏈霉素、100 u/mL青霉素，然后于37℃和5%二氧化碳細胞培養箱中培養。

1.3.2 慢病毒的包裝和轉染采用靶向siRNA 敲低HepG2 細胞系中FAM83B 作為si-FAM83B 組，HepG2 細胞轉染si-NC 慢病毒載體作為si-NC 組。分別用PBS、40 ng/mL 胰島素樣生長因子1（insulinlike growthfactor-1,IGF-1）處理si-FAM83B 組細胞48 h，并將細胞分為si-FAM83B+PBS 組和si-FAM83B+IGF-1 組。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測FAM38B mRNA 的表達用TRIzol 試劑提取總RNA，用Prime Script RT 試劑盒將其逆轉錄為cDNA。使用SYBR Premix ExTaq Ⅱ試劑盒在7500 型qRTPCR 儀上進行qRT-PCR，反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30 個循環。qRT-PCR 引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算FAM38B mRNA 相對表達量，所有實驗重復2 次。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 Western blotting 檢測FAM38B 蛋白的表達用RIPA 裂解液裂解組織和細胞，提取總蛋白，BCA測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液100℃水浴煮沸5 min。SDS-PAGE 電泳分離后，用濕轉法轉PVDF 膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜后加入二抗孵育1 h，TBST 洗滌后，加入發光液，采用凝膠電泳成像系統進行分析，實驗重復3 次。GAPDH 作為內參蛋白，將目的蛋白灰度值與GAPDH 蛋白灰度值的比值作為蛋白相對表達量。

1.3.5 免疫組織化學法檢測FAM83B 蛋白的表達肝癌組織及癌旁正常組織經4%甲醛固定，石蠟包埋，切4 μm 厚的切片。脫蠟、水化、3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，檸檬酸抗原修復，封閉液封閉非特異性結合位點，一抗FAM83B 4℃封閉孵育過夜，加入二抗和辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，DAB 染色，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹脂封片。

1.3.6 CCK-8 法檢測細胞增殖用含10% FBS 的培養液制備單細胞懸液，將細胞按5×103個/孔的密度接種在96 孔板中。用酶標儀在450 nm 波長處檢測每個孔的光密度（optical density,OD）值。

1.3.7 流式細胞儀檢測細胞周期采用細胞周期檢測試劑盒分析細胞周期。按1×106個/mL 的密度收集細胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）洗滌2 次，在500 μL 70%乙醇、25℃條件下固定2 h。細胞PBS 洗滌2 次，在400 μL 碘化丙啶（propidium iodide,PI）、100 μL RNase、37℃黑暗條件下孵育30 min。采用流式細胞儀檢測PI 信號，所有實驗重復3 遍。

1.3.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡采用Annexin VFITC 細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。按1×106個/mL 的密度收集細胞，PBS 洗滌2 次，重懸于500 μL 結合緩沖液中，5 μL 膜聯蛋白V-FITC、5 μL PI 在37℃黑暗條件下孵育15 min。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，所有實驗重復3 遍。

1.3.9 Transwell實驗檢測細胞侵襲采用BD 24 孔Transwell 室進行細胞侵襲實驗。按1×105個/mL的密度收集細胞，置于基底膠包被的Transwell上室中，并添加無血清培養基。下室添加含10%FBS 的完全培養基。37℃、5%二氧化碳培養箱孵育48 h 后，將侵襲到下室的細胞用甲醇固定30 min，然后結晶紫染色15 min。在光學顯微鏡下，隨機選擇3 個高倍視野測量細胞數，所有實驗重復3 次。

1.4 統計學方法

數據分析采用Graphpad 5.0 和SPSS 19.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FAM83B在肝癌組織中高表達

肝癌組織與癌旁正常組織FAM83B mRNA 和蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異均有統計學意義（P＜0.05），肝癌組織高于癌旁正常組織。見表2和圖1。

表2 癌旁正常組織與肝癌組織FAM38B mRNA和蛋白相對表達量比較 （±s）

表2 癌旁正常組織與肝癌組織FAM38B mRNA和蛋白相對表達量比較 （±s）

組織癌旁正常組織肝癌組織t 值P 值FAM38B mRNA 1.000±0.530 2.254±1.195 7.553 0.000 FAM38B蛋白1.000±0.230 2.675±0.562 21.719 0.000

圖1 FAM83B蛋白在肝癌組織和癌旁正常組織中的表達

免疫組織化學染色結果顯示，FAM38B 主要表達于細胞核，少量表達于細胞質。陽性染色細胞為褐色或黑色。見圖2。

圖2 肝癌組織和癌旁癌旁正常組織FAM83B的表達（免疫組織化學法×400）

2.2 FAM83B在肝癌細胞系中高表達

LO2、HepG2、Hep3B 細胞FAM83B mRNA 和蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與LO2 細胞比較，HepG2、Hep3B 細胞FAM83B mRNA 和蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見表3和圖3。

圖3 FAM83B蛋白在LO2、HepG2、Hep3B細胞中的表達

表3 3種細胞FAM38B mRNA和蛋白相對表達量比較（±s）

表3 3種細胞FAM38B mRNA和蛋白相對表達量比較（±s）

細胞LO2 Hep3B HepG2 F 值P 值FAM38B mRNA 1.000±0.130 1.933±0.251 2.352±0.306 24.842 0.000 FAM38B蛋白1.000±0.130 2.081±0.271 2.763±0.359 32.446 0.000

2.3 敲低FAM83B 可抑制肝癌細胞增殖、侵襲并促進凋亡

si-NC 組與si-FAM83B 組FAM83B mRNA 和 蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），si-FAM83B 組低于si-NC 組。見表4和圖4。

表4 si-NC組與si-FAM83B組FAM38B mRNA和蛋白相對表達量比較 （±s）

表4 si-NC組與si-FAM83B組FAM38B mRNA和蛋白相對表達量比較 （±s）

組別si-NC組si-FAM83B組t 值P 值FAM38B mRNA 1.000±0.110 0.237±0.019 11.839 0.000 FAM38B蛋白1.000±0.080 0.273±0.022 15.177 0.000

圖4 FAM83B蛋白在si-FAM83B組和si-NC組HepG2細胞中的表達

si-NC 組與si-FAM83B 組24 h、48 h、72 h、96 h的OD 值比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點OD 值有差異（F=773.510，P=0.001）。②si-NC 組與si-FAM83B 組的OD 值有差異（F=516.980，P=0.000），si-FAM83B 組OD 值較低，細胞活力降低。③兩組OD 值變化趨勢有差異（F=820.782，P=0.000）。見表5。

表5 si-NC組與si-FAM83B組不同時間點OD值比較 （±s）

表5 si-NC組與si-FAM83B組不同時間點OD值比較 （±s）

組別si-NC組si-FAM83B組24 h 0.231±0.014 0.201±0.001 48 h 0.378±0.010 0.243±0.010 72 h 0.790±0.069 0.559±0.009 96 h 1.219±0.057 0.727±0.028

si-NC 組與si-FAM83B 組細胞凋亡率、侵襲細胞數比較，經t檢驗，差異均有統計學意義（P＜0.05），si-FAM83B 組細胞凋亡率高于si-NC 組，侵襲細胞數少于si-NC 組。見表6和圖5、6。

圖5 si-NC組與si-FAM83B組HepG2細胞的流式細胞圖

表6 si-NC組與si-FAM83B組的細胞凋亡率、侵襲細胞數比較 （±s）

表6 si-NC組與si-FAM83B組的細胞凋亡率、侵襲細胞數比較 （±s）

組別si-NC組si-FAM83B組t 值P 值細胞凋亡率/%11.010±0.661 29.306±3.517 8.855 0.000侵襲細胞數/（個/HP）80.436±4.826 41.443±4.973 9.746 0.000

2.4 敲低FAM83B可沉默PI3K/Akt/mTOR通路并促進細胞自噬

si-NC 組與 si-FAM83B 組 PI3K、p-Akt、pmTOR、LC3-Ⅱ蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異均有統計學意義（P＜0.05），si-FAM83B 組PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白相對表達量低于si-NC 組，LC3-Ⅱ蛋白相對表達量高于si-NC 組。si-NC 組與si-FAM83B 組Akt、mTOR 蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表7和圖7。

表7 si-NC組與si-FAM83B組PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、LC3-Ⅱ蛋白相對表達量比較 （±s）

表7 si-NC組與si-FAM83B組PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、LC3-Ⅱ蛋白相對表達量比較 （±s）

組別si-NC組si-FAM83B組t 值P 值PI3K蛋白1.00±0.05 0.42±0.02 19.855 0.000 p-Akt蛋白1.00±0.05 0.33±0.02 20.509 0.000 Akt蛋白1.00±0.07 0.97±0.07 0.475 0.659 p-mTOR蛋白1.00±0.07 0.15±0.01 20.419 0.000 mTOR蛋白1.00±0.05 0.94±0.05 1.329 0.255 LC3-Ⅱ蛋白1.00±0.05 8.65±0.41 32.402 0.000

si-FAM83B+PBS 組與 si-FAM83B+IGF-1 組PI3K、p-Akt、p-mTOR、LC3-Ⅱ蛋白相對表達量的比較，經t檢驗，差異均有統計學意義（P＜0.05），si-FAM83B+IGF-1 組PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白相對表達量高于si-FAM83B+PBS 組，LC3-Ⅱ低于si-FAM83B+PBS 組。si-FAM83B+PBS 組與si-FAM83B+IGF-1組Akt、mTOR 蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表8和圖7。

表8 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、LC3-Ⅱ蛋白相對表達量比較 （±s）

表8 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、LC3-Ⅱ蛋白相對表達量比較 （±s）

組別si-FAM83B+PBS組si-FAM83B+IGF-1組t 值P 值PI3K蛋白1.00±0.06 4.77±0.22 28.856 0.000 p-Akt蛋白1.00±0.05 5.37±0.29 25.682 0.000 Akt蛋白1.00±0.06 1.07±0.07 1.221 0.289 p-mTOR蛋白1.00±0.08 3.07±0.22 15.538 0.000 mTOR蛋白1.00±0.06 1.06±0.06 1.203 0.295 LC3-Ⅱ蛋白1.00±0.05 0.29±0.01 24.834 0.000

圖6 si-NC組與si-FAM83B組HepG2細胞侵襲能力（×400）

圖7 各組細胞PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR和LC3-Ⅱ蛋白的表達

2.5 激活PI3K/Akt/mTOR通路可逆轉FAM83B敲低誘導的細胞自噬

si-FAM83B+PBS 組與si-FAM83B+IGF-1 組24 h、48 h、72 h、96 h 的OD 值比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點OD 值有差異（F=5211.626，P=0.000）。②si-FAM83B+PBS 組與si-FAM83B+IGF-1 組OD 值有差異（F=453.499，P=0.000），si-FAM83B+IGF-1 組OD 值較高，細胞活力升高。③兩組OD 值變化趨勢有差異（F=384.347，P=0.000）。見表9。

表9 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組不同時間點的OD值比較 （±s）

表9 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組不同時間點的OD值比較 （±s）

組別si-FAM83B+PBS組si-FAM83B+IGF-1組24 h 0.227±0.020 0.243±0.006 48 h 0.241±0.007 0.396±0.007 72 h 0.552±0.049 0.810±0.031 96 h 0.688±0.049 1.254±0.071

si-FAM83B+PBS 組與si-FAM83B+IGF-1 組細胞凋亡率、侵襲細胞數比較，經t檢驗，差異均有統計學意義（P＜0.05），si-FAM83B+ IGF-1 組細胞凋亡率低于si-FAM83B+ PBS 組，侵襲細胞數高于si-FAM83B+PBS 組（P＜0.05）。見表10 和圖8、9。

表10 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組的細胞凋亡率、侵襲細胞數比較 （±s）

表10 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組的細胞凋亡率、侵襲細胞數比較 （±s）

組別si-FAM83B+PBS組si-FAM83B+IGF-1組t 值P 值細胞凋亡率/%30.005±1.800 10.906±1.309 14.863 0.000侵襲細胞數/（個/HP）38.570±2.314 76.459±9.175 6.936 0.002

圖8 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組HepG2細胞的流式細胞圖

圖9 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組HepG2細胞侵襲能力（×400）

3 討論

目前關于FAM83B 參與腫瘤細胞增殖、侵襲的機制依然存在爭議，多項研究證實FAM83B 在多種腫瘤組織中高表達，并且是潛在的癌基因[12-14]。例如，FAM83B 在肺鱗狀細胞癌中表達上調，可作為肺鱗狀細胞癌潛在診斷和預后生物標志物[12]；還有研究發現胃癌組織中FAM83B 表達水平高于癌旁正常組織[14]，與本研究結果一致。FAM83B 的致癌機制可能與其結構中一個功能未知的高度保守域DUF1669有關，這一保守域在FAM83B 蛋白介導的致瘤轉化中具有至關重要的作用，并且該功能域可激活多種信號通路，參與腫瘤的發生[15]。

多種腫瘤的發生與PI3K/Akt/mTOR 通路激活有關。有研究證實，FAM83B 蛋白結合PI3K 蛋白后直接激活PI3K/Akt/mTOR 通路，導致乳腺癌的發生[11]。FAM83B 蛋白可與p85α、p110α、Akt 結合，其中p85α和p110α 是PI3K 的重要亞單位，從而促進p110α 和Akt 的膜定位，由此激活下游的PI3K/Akt 信號通路[16]。此外，FAM83B 還可與表皮生長因子受體結合，促進表皮生長因子的磷酸化和磷脂酶D 形成[17]，磷脂酶D 可以促進卵磷脂水解為磷脂酸，而磷脂酸是mTOR 信號通路中重要的組成部分。筆者進一步研究了FAM83B 介導肝癌細胞增殖、侵襲的相關信號通路。Western blotting 檢測結果表明，敲低FAM83B 降低了HepG2 細胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達，表明敲低FAM83B 可以沉默肝癌細胞中PI3K/Akt/mTOR 通路，進一步證實上述研究結論。自噬是由多個復雜的信號級聯觸發的，其中包括PI3K/Akt/mTOR 通路[18]。自噬過程中，LC3-Ⅱ是重要的自噬相關蛋白，參與自噬體的形成[19]。本研究結果表明，敲低肝癌細胞中FAM83B 可以抑制LC3-Ⅱ的表達，敲低FAM83B 可以抑制PI3K/Akt/mTOR 通路并促進肝癌細胞的自噬。眾所周知，IGF-1 與IGF-1受體結合后可激活PI3K/Akt 信號通路。為進一步證實PI3K/Akt/mTOR 通路在敲低FAM83B 誘導的自噬過程中的作用，本實驗用IGF-1 處理si-FAM83B 轉染的HepG2 細胞，結果顯示，經IGF-1 處理后，si-FAM83B 轉染的HepG2 細胞PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白相對表達量升高。此外，與PBS 處理的細胞比較，用IGF-1 處理后，si-FAM83B 轉 染 的HepG2 細胞中LC3-Ⅱ表達降低。本研究結果進一步表明，激活PI3K/Akt/mTOR 通路可以逆轉敲低FAM83B 介導的自噬作用，促進腫瘤細胞凋亡，抑制其增殖和侵襲。

綜上所述，本研究首次證明了FAM83B 在肝癌組織中表達上調，而敲低FAM83B 可以通過沉默PI3K/Akt/mTOR 通路抑制肝癌細胞增殖、侵襲，從而促進肝癌細胞的自噬。這些發現有助于更好地了解FAM83B 在肝癌中的作用，并且FAM83B 也可能成為肝癌治療的潛在靶標。