原發性肝癌組織中溴結構域蛋白4的表達及與臨床病理特征和預后的關系*

戴婷麗，張夢嵐，高紅玲，劉顯妮，陳海雯，李筱玥，郭燕

（青海省人民醫院 病理科，青海 西寧 810000）

肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一[1]，手術切除仍是目前根治原發性肝癌（primary hepatic carcinoma,PHC）的首選方法[2]。隨著醫療技術不斷發展，越來越多的PHC 患者被早期發現，行手術治療的患者不斷增多，但術后高復發率仍是困擾臨床醫師的棘手問題[3]。近期研究顯示，溴結構域蛋白4（bromodomain-containing protein 4,BRD4）等因子參與肝癌[4]、宮頸癌[5]、卵巢癌[6]等多種癌癥的發生、發展，與腫瘤細胞的生長、遷移、浸潤關系密切。目前國內回顧性研究顯示，抑制BRD4 表達可抑制肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡[7]。但是關于PHC 癌組織中BRD4 蛋白表達與PHC 患者臨床病理特征、預后的關系，以及關系驗證的前瞻性研究尚未見報道。因此，本研究將83 例PHC 患者納入研究，通過前瞻性研究探討上述問題，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7月—2018年7月青海省人民醫院收治的PHC 患者83 例作為研究對象。其中，男性49 例，女性34 例；年齡22～75 歲，平均（53.26±6.97）歲。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 納入、排除及剔除標準

1.2.1 納入標準①符合《原發性肝癌的分層篩查與監測指南（2020 版）》[8]PHC 診斷標準；②首次行PHC 根治術；③既往未接受任何形式治療；④Child-Pugh 肝功 能 分 級為A 級、B 級；⑤年齡＞18 歲。

1.2.2 排除標準①合并其他部位惡性腫瘤；②重要臟器嚴重功能障礙；③伴有免疫缺陷性疾病、傳染性疾病、血液系統疾病、全身系統性疾病；④伴有精神性疾病、認知功能障礙；⑤根治性手術前發現遠處轉移；⑥有藥物濫用史、吸毒史及妊娠或哺乳期女性；⑥伴有代謝性腦病、顱內器質性病變、嚴重心腦血管疾病；⑦有手術禁忌證。

1.2.3 剔除標準①治療過程中死亡；②自行終止治療；③依從性差；④自然失訪。

1.3 方法

1.3.1 取材方法患者均行PHC 根治手術切取病灶，取距腫瘤組織5～9 mm 的組織作為癌旁組織，并行術中快速病理檢查，確保每位患者切除組織包含癌組織和癌旁組織。

1.3.2 PHC 手術切除標準①完整切除肉眼可見的肝靜脈、門靜脈、膽管、下腔靜脈癌栓；②無門靜脈主干及一級分支、肝靜脈主干及鄰近臟器侵犯，無肝門淋巴結、肝外轉移；③切除腫瘤的邊界距離肝臟＞1 cm，肝斷面組織學檢查無腫瘤細胞殘留（切緣陰性）；④PHC 根治手術后2 個月行超聲、CT、MRI（≥2 項檢查）檢查未見腫瘤殘留病灶，術前甲胎蛋白（alpha-fetal protein,AFP）升高者術后2 個月內AFP 降至正常范圍[9]。

1.3.3 免疫組織化學法檢測BRD4 的表達取癌組織和癌旁組織標本用石蠟包埋、切片，滅活、微波抗原修復、洗滌，添加BRD4 一抗（美國Abcam公司），4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）沖洗，分別滴入二抗、二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine,DAB）顯色液（四川海諾威科技有限公司），蘇木精復染、脫水、封片。染色程度為無色、淡棕色、棕色、棕褐色，染色范圍＜5%、5%～＜25%、25%～＜75%、≥75%，分別計為0 分、1 分、2 分、3 分，計算染色程度與染 色 范圍評分的乘積，結果0 分為陰性表達，否則為陽性表達。

1.3.4 預后隨訪所有患者術后采用門診復查、電話等方式隨訪3年，術后第1年，每3 個月復查1 次；自預防性經導管動脈栓塞化療（transcatheter arterial chemoembolization,TACE）術后第2年起，每6 個月復查1 次。診斷為復發的患者根據個體情況選擇TACE（無遠處轉移、見肝內復發轉移者，微血管侵犯，切緣復發肝動脈末梢增多且呈團塊狀或串珠狀腫瘤染色）、保守治療等治療方式（≥2 種影像學檢查手段發現肝癌典型“快進快出”特征為復發）。統計隨訪期間無病生存率、總生存率，出現癌因死亡者則終止隨訪。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以構成比或率表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗；影響因素的分析用Cox 比例風險模型。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者癌組織、癌旁組織中BRD4的表達

83 例PHC 患者中，癌組織中BRD4 陽性表達52 例（62.65%），癌旁組織中BRD4 陽性表達9 例（10.84%），經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=47.921，P=0.000）。

2.2 癌組織中BRD4蛋白陽性表達與PHC患者臨床病理特征的關系

不同性別、年齡、總膽紅素、腫瘤數目、病理類型、乙型肝炎病毒感染、AFP、肝硬化、Child-Pugh 肝功能分級、腫瘤直徑患者癌組織中BRD4 蛋白陽性表達率比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）。不同微血管侵犯、腫瘤包膜、臨床分期、分化程度患者癌組織中BRD4 蛋白陽性表達率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），有微血管侵犯、腫瘤包膜不完整、臨床分期Ⅲ期、低分化患者癌組織中BRD4 蛋白陽性表達率較高。見表1。

表1 不同因素PHC患者BRD4蛋白陽性表達率比較 例（%）

續表1

2.3 影響PHC患者預后的因素

83 例PHC 患者截止隨訪結束共8 例失訪，其中52 例BRD4 蛋白陽性表達患者失訪7 例，31 例陰性患者失訪1 例。剩余75 例患者中36 例（48.00%）無病生存，51 例（68.00%）生存。

單因素Cox 回歸分析結果顯示，微血管侵犯、腫瘤包膜、臨床分期、分化程度、BRD4 蛋白表達是PHC 患者復發的影響因素（P＜0.05）（見表2）。多因素Cox 回歸分析結果顯示，微血管侵犯[=5.379（95% CI：3.487，13.005）]、腫瘤包膜[=5.614（95% CI：3.986，16.115）]、臨床分期[=5.312（95% CI：3.307，12.413）]、分化程度[=4.187（95% CI：2.893，10.006）]、BRD4 蛋白表達[=5.799（95% CI：4.156，17.235）]是PHC 患者復發的獨立影響因素（P＜0.05）（見表3）。

表2 PHC患者復發的單因素Cox回歸分析參數

表3 PHC患者復發的多因素Cox回歸分析參數

單因素Cox 回歸分析結果顯示，微血管侵犯、腫瘤包膜、臨床分期、分化程度、BRD4蛋白表達是PHC 患者生存的影響因素（P＜0.05）（見表4）。多因素Cox 回歸分析結果顯示，腫瘤包膜[=3.152（95% CI：2.150，8.795）]、臨床分期[=4.998（95% CI：2.695，11.003）]、分化程度[=5.650 （95% CI：3.803，17.001）]、BRD4 蛋白表達[=5.987（95% CI：4.384，18.828）]是PHC 患者生存的獨立影響因素（P＜0.05）（見表5）。

表4 PHC患者生存的單因素Cox回歸分析參數

表5 PHC患者生存的多因素Cox回歸分析參數

2.4 癌組織中BRD4蛋白表達與PHC患者預后的關系

截止隨訪結束，75 例患者中36 例（48.00%）無病生存，其中45 例BRD4 蛋白陽性表達患者無病生存14 例，30 例BRD4 蛋白陰性表達患者無病生存22 例；45 例BRD4 蛋白陽性患者存活24 例，30 例BRD4 蛋白陰性表達患者存活27 例；BRD4 蛋白陽性表達患者與陰性表達患者的無病生存率、總生存率比較，差異均有統計學意義（χ2=11.858 和10.914，均P=0.001），BRD4 蛋白陰性表達患者的無病生存率、總生存率高于BRD4 蛋白陽性表達患者。見圖1、2。

圖1 PHC組織中BRD4蛋白陰性表達和陽性表達患者的無病生存曲線

圖2 PHC組織中BRD4蛋白陰性表達和陽性表達患者的總生存曲線

3 討論

腫瘤細胞增殖情況可有效反映腫瘤生物學特性，與PHC手術療效密切相關。BRD4是溴結構域及末端蛋白家族的成員，參與調控DNA復制、染色質重塑、轉錄等多個生物學過程[10-11]。BRD4 可抑制超級增強子與目標啟動子之間的作用，對癌基因及細胞凋亡有特異性抑制作用。BRD4的表達變化可有效反映正常組織、癌組織增殖活性，對腫瘤復發、轉移有重要作用[12-13]。

本研究結果表明，癌組織中BRD4 蛋白陽性表達率高于癌旁組織，有微血管侵犯、腫瘤包膜不完整、臨床分期Ⅲ期、低分化患者癌組織BRD4 蛋白陽性表達率較高，提示PHC 患者癌組織中BRD4 蛋白陽性率較高，BRD4與PHC患者臨床病理特征有關。BRD是一組含有110 個氨基酸的蛋白模塊，可通過不尋常的左手四螺旋束結構來識別組蛋白乙酰化賴氨酸。BRD4屬于轉錄及表觀遺傳調節因子之一，在癌癥進展過程中發揮關鍵作用。BRD4具有2個串聯溴結構域，可選擇性識別組蛋白中乙酰化賴氨酸的保守蛋白結構域，與染色質中的乙酰化賴氨酸結合，使染色質重塑因子、轉錄因子等相關蛋白募集到特定基因轉錄位點，從而調控下游靶基因的表達，參與細胞惡化及癌細胞增殖、分化、侵襲、轉移等生理過程[14-15]。BRD4可與性轉錄延伸因子b 復合體等蛋白質復合體相互作用，并刺激RNA聚合酶Ⅱ型轉錄。在有絲分裂過程中，BRD4 與染色體結合，活化或抑制細胞靶基因，抑制BRD4活性可抑制腫瘤細胞生長、增殖等過程。筆者認為BRD4 還可招募其他轉錄因子至染色體，促使癌基因激活，抑制抑癌基因表達，促進PHC發生、腫瘤細胞增殖等，但相關具體的抑癌基因尚不清楚，下一步研究將重點探討。

本研究中多因素Cox 回歸分析結果顯示，微血管侵犯、腫瘤包膜、臨床分期、分化程度、BRD4蛋白表達是PHC 患者復發的獨立影響因素；腫瘤包膜、臨床分期、分化程度、BRD4蛋白表達是PHC患者生存的獨立影響因素，再次提示PHC 組織中BRD4 蛋白表達是患者預后的影響因素。癌組織中BRD4蛋白陰性表達患者的無病生存率、總生存率高于BRD4 蛋白陽性表達者，再次印證PHC 組織中BRD4 蛋白表達與患者預后有關，PHC 患者癌組織中BRD4 蛋白陽性表達可增大術后復發風險，減少總生存獲益。

綜上所述，PHC 患者癌組織中BRD4 蛋白表達與臨床病理特征及預后有關，BRD4 蛋白陽性表達者預后不良風險高。本研究仍存在不足之處，樣本量較小，未進一步統計BRD4 蛋白陽性率高、低表達者臨床病理特征及預后情況，后期將針對不足之處開展多中心、大樣本量實驗進一步完善研究。