基臺表面抗菌涂層PDMS-CHXG的構建及抗菌性能的研究

李趁趁，夏 榮，龐詩夢，余金蘭

種植義齒因良好的遠期穩定性成為牙缺失的常規修復方式，而預防種植體周圍疾病的發生是其長期存留的關鍵。Lee et al[1]研究表明種植體周圍疾病的發病率約為47%，種植體周圍黏膜炎和周圍炎分別約為29.48%和9.25%。種植體周圍炎的發生與牙周炎相似菌斑生物膜為始動因子，牙齦卟啉單胞菌是致病菌[2]。兩段式種植體中，種植體-基臺連接處的微間隙會成為細菌儲存庫[3-4]，賦予基臺一定的抗菌能力會有助于種植體周圍炎的預防。葡萄糖酸氯己定(chlorhexidine gluconate，CHXG)是臨床常用的抗菌劑之一，聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)含有硅氧硅(Si-O-Si)結構，可與鈦表面的羥基官能團結合，聚硅氧烷單元上的烷基鏈可通過范德華作用力捕獲CHXG[5-7]。該研究通過浸漬提拉法使PDMS與光滑的鈦表面結合，然后浸泡在CHXG溶液中，實現鈦表面抗菌涂層PDMS-CHXG的構建并探究不同濃度CHXG的抗菌性能。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器醫用鈦片(TA1)(寶雞泰宇鑫金屬材料有限公司)；Sylgard 184(聚二甲基硅氧烷，美國Dow corning公司)；20%葡萄糖酸氯己定溶液(美國Sigma-Aldrich公司)；牙齦卟啉單胞菌(北京百歐博偉生物技術有限公司)；腦心浸液培養基(brain heart infusion，BHI)、瓊脂粉、無菌脫纖維山羊血(上海索萊寶生物科技有限公司)；結晶紫溶液、抗熒光淬滅劑、氯化血紅素(上海碧云天生物技術有限公司)；維生素K1注射液(安徽長江藥業有限公司)； DMAO/EthD-Ⅲ活/死細菌染色試劑盒[翌圣生物科技(上海)有限公司]；HITACHI SU8220冷場發射掃描電子顯微鏡、LSM880激光掃描共聚焦顯微鏡(德國卡爾·蔡司股份公司)；麥氏比濁儀(上海梅里埃診斷產品有限公司)；多功能微孔板酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2 試件制備將直徑12 mm、厚1 mm的60枚鈦片用砂紙逐級拋光至7 000目達到基臺光滑度，分別用丙酮、無水乙醇及超純水各超聲蕩洗30 min，以去除雜質獲取更多-OH，堿化處理，烘干、備用。

1.3 實驗分組與涂層制備將Sylgard 184以10 ∶1混合于正庚烷溶液中，恒溫磁力加熱攪拌器室溫下攪拌30 min，然后將上述試件放置于溶液中，在超聲震蕩條件下浸泡30 min后均勻提拉取出，超純水超聲波清洗3 min，在60 ℃環境中烘干。隨機分為5組，空白對照組為光滑鈦片；實驗組按CHXG濃度0、0.4、0.8、1.6 mg/ml分為4組，分別記為C、T0、T1、T2、T3。取20%CHXG溶液加入去離子水中，混勻后得到上述濃度的CHXG溶液，將試件浸泡于CHXG溶液24 h后均勻提拉取出，超純水超聲波清洗3 min，烘干，環氧乙烷滅菌后備用。

1.4 牙齦卟啉單胞菌懸液制備將牙齦卟啉單胞菌菌株劃線接種在BHI瓊脂平板上，在37 ℃厭氧環境(80% N2、10% CO2、10% H2)培養72 h，挑取單菌落接種于BHI血清培養基中，制備成1.5×108CFU/ml的細菌懸液。

1.5 抗菌涂層表征在各組中隨機選取3枚樣品使用CFESEM觀察表面結構的變化，并用X射線能譜對樣品表面的元素組成進行半定量分析。

1.6 抗菌性能檢測

1.6.1抑菌環實驗 取100 μl上述細菌懸液滴在BHI血瓊脂平板上，用涂布棒均勻涂布至菌液被血瓊脂平板完全吸收，每組隨機選取3枚樣品將正面輕輕放置于平板表面，使其與瓊脂平板完全接觸，37 ℃厭氧培養72 h后觀察實驗結果并記錄。

1.6.2活/死細菌染色實驗 利用DMAO/EthD-Ⅲ活/死細菌染色試劑盒鑒別樣品表面活/死細菌。將DMAO ∶EthD-Ⅲ ∶0.85% NaCl溶液按1.25 μl ∶2.5 μl ∶1 ml的比例配制成熒光染液，避光備用。在超凈工作臺內放入24孔板，每組隨機選取3枚樣品將受試面朝上置于孔板內，取上述細菌懸液，每個樣品表面接種100 μl，每孔加入1.5 ml BHI血清培養基，37 ℃厭氧培養72 h，棄去舊培養基。用0.85% NaCl溶液清洗5 min，去除未牢固黏附的細菌，重復3次。吸取200 μl熒光染液滴于樣品表面，室溫避光孵育15 min，然后用0.85% NaCl溶液清洗并滴加抗熒光淬滅劑，將樣品倒置于載玻片上，激光共聚焦顯微鏡(×40oil)下觀察。

1.6.3結晶紫染色實驗 每組隨機選取3枚樣品將受試面朝上置于孔板內，接種菌種，37 ℃厭氧培養72 h。將樣品置于另一24孔板內，PBS清洗去除懸浮細菌，2.5%戊二醛固定30 min，棄去固定液，并用PBS清洗，加入1 ml 1%結晶紫溶液振搖20 min，用PBS將游離燃料徹底清洗干凈，加入1 ml 33%醋酸溶液溶解樣品表面結晶紫染液，充分震蕩后吸取200 μl液體于96孔板中，每個樣品設3個復孔。用酶標儀測定590 nm處的吸光度(optical density，OD)值，評估樣品表面抑制細菌生物膜形成的能力。

2 結果

2.1 CFESEM下觀察樣品表征C組鈦片表面相對光滑，除了方向一致的細小劃痕外無其他特殊形貌；實驗組隨著CHXG濃度的增加，樣品表面出現了致密均一的薄膜，表明抗菌涂層使用該方法可在鈦片表面成功構建。見圖1。

圖1 CFESEM下各組樣品表面形貌變化 ×500

X線能譜進行半定量分析，結果見圖2，T0組樣品表面的元素組成主要為C、Si、O，從PDMS的化學結構式(C2H6OSi)n中可以看出C、Si、O為PDMS涂層的主要組成元素，表明PDMS與鈦片表面的成功結合；與T0組比較，其他實驗組的結果出現了Cl元素，且隨著CHXG濃度的增加所占比例也增加，該分析結果也表明抗菌涂層PDMS-CHXG在鈦片表面的成功構建。

圖2 X射線能譜表面元素半定量分析

2.2 抗菌性能評價

2.2.1抑菌環實驗結果 C、T0組樣品周圍未觀察到抑菌環；T1-T3組樣品周圍抑菌環明顯，且抑菌環直徑隨著CHXG濃度的增大而增大，當CHXG的濃度達到0.8 mg/ml時表現出良好的抗菌性能。見圖3。

圖3 各組樣品抑菌環實驗結果

2.2.2活/死細菌染色結果 C組和T0組樣品表面含有大量綠色熒光(活菌)，熒光信號較強表明細菌出現了成團的黏附生長；T1-T3組隨著CHXG濃度增大可以觀察到紅色熒光(死菌)的出現且熒光信號明顯變弱，在T2、T3組幾乎觀察不到綠色熒光，表明隨著CHXG濃度的增大細菌黏附聚集生長現象減少且幾乎無活菌出現。見圖4。

圖4 各組樣品表面活/死細菌染色免疫熒光結果 ×40oil

2.2.3樣品表面細菌數量 C、T0組的OD值基本一致，隨著CHXG濃度的增大，T1-T3組OD值逐漸減小。ANOVA結果表明各組間差異有統計學意義(F=5 886.13，P<0.01)。SNK檢驗結果顯示C組與T0組間差異無統計學意義(P>0.05)；T2組與T3組間差異無統計學意義(P>0.05)；T1-T3組與C和T0組間差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 結晶紫染色實驗檢測樣品表面的細菌數量組間比較： *P<0.05；與C和T0組比較：#P<0.05

3 討論

種植義齒具有與天然牙極其相似的良好生物特性，成為修復牙缺失的理想修復方式。種植體與基臺的分離設計保證了種植體植入牙槽骨發生骨結合的過程中被完全封閉在牙槽骨內，避免了其與口腔內微生物的接觸，從而保證形成良好的骨結合[8]，種植體周圍軟組織封閉的形成也會阻止外界物理和生物刺激的侵入。種植體形成穩定的骨結合后會行二期手術而暴露在口腔環境中，研究[2, 9]表明，早期炎癥在種植體暴露于口腔內約3周的時間就可發生，軟組織封閉形成的時間約為基臺安裝完成后6～8周。二期手術到終修復體完成之前，基臺會被斷開、重新連接多次使種植體穿齦部位的軟組織封閉被破環，新的結合在短期內不能形成，口腔內的微生物及其代謝產物、食物殘渣等便會入侵，基臺重新連接的過程中也易將細菌和其他污染物帶入種植體-基臺連接處，從而引起種植體周圍炎癥的發生，導致種植義齒修復失敗。因此，增強種植體穿齦部位的抗菌性能及在軟組織封閉形成之前降低感染風險是需要考慮的關鍵因素。

目前，主要研究的抗菌涂層包括銀離子、銅離子等金屬離子，抗菌肽及廣譜抗生素等，金屬離子可以通過陽極氧化法、微弧氧化法或離子注入法與種植體緊密結合[10-11]，但抗菌離子容易釋放不足?？咕目咕V廣且具有特異性受體，但其合成費用較高，在臨床難以推廣應用[12]?？股鼐哂休^強的抗菌性能，可抑制微生物的細胞壁和蛋白質的合成、干擾DNA轉錄和翻譯，但會增加機體耐藥的風險[13]。Wu et al[14]對N-鹵胺聚合物涂層持久性和抗菌性能研究結果表明涂層的抗菌功效可持續存在12～16周，且具有可重復構建性。Lauritano et al[5]和Carinci et al[6]使用1%CHXG醇溶液作為種植體抗菌內涂層評價了其抗菌性能，結果表明涂層能夠滅活通過種植體-基臺連接處滲透到種植體內部的微生物，Carinci et al[6]通過臨床實驗對6個月時連接處微間隙內的細菌數量進行了聚合酶鏈式反應分析，結果表明實驗組微間隙內的微生物數量減少。CHXG作為一種廣譜抗菌劑，具有較強的殺菌和抑菌作用，且不易產生耐藥性，臨床應用前景較好，是目前研究的熱點，但與鈦片的結合涉及復雜的灌注程序，在臨床難以推廣[15]。

PDMS是應用最廣泛的有機聚合物，具有惰性、無毒、良好的生物相容性等特點。本實驗選擇PDMS作為中間層與含有Cl這一鹵族元素的CHXG結合，通過簡單的浸漬提拉法在光滑鈦片表面形成抗菌涂層，制備方法簡便高效，以期用于臨床基臺抗菌性能的研究。然而本研究存在一定的局限性，選擇單一菌種進行研究不能代表口腔內復雜的微生態環境；種植體周圍軟組織封閉的形成在種植體周圍炎的預防中也至關重要，涂層對生物學寬度內半橋粒的影響將在后續的動物實驗中加以完善；基臺是臨床上重復使用的重要配件，因此，涂層構建成功后的無損清除也值得研究。

CFESEM結果表明抗菌涂層構建成功，為了評價抗菌能力，進行了抑菌環、活/死細菌染色及結晶紫染色實驗，表明涂層具有良好的抗菌性能，本課題組細胞相容性實驗用牙齦成纖維細胞驗證了其生物相容性良好。種植義齒修復過程二期手術、印模制取、臨時冠試戴、預定個性化基臺、終修復完成等涉及基臺的斷開、連接的操作均可在連接之前涂覆該抗菌涂層，增強其抗菌性能。