經尿道聯合灌注SCL和Cx43基因慢病毒對糖尿病膀胱功能的影響

軒留明，馬路平，歐陽松，孫 鵬，譚明輝，張永強，王勤章

糖尿病發展過程中，可導致多系統并發癥，其中泌尿系統常見的是糖尿病膀胱病變(diabetic cystopathy, DCP)，發生率為25%～87%[1]。目前DCP的發病機制仍存在爭議，研究[2]顯示哺乳動物膀胱內有一種Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal, ICC)，并證實ICC可能是膀胱逼尿肌興奮的起搏細胞。有學者在DCP組織中發現ICC數量減少，結構被破壞，并明確ICC損傷是DCP發病原因之一[3]。細胞縫隙鏈接蛋白-43(connexin 43, Cx43)表達下調可促進DCP的發生[4]。前期課題組通過尿道向豚鼠DCP中灌注干細胞白血病(stem cell leukemia, SCL)基因慢病毒，恢復ICC的數量及功能，但膀胱功能恢復欠佳[5]。筆者推測在DCP中，ICC及Cx43都有一定的損害，僅僅恢復ICC的數量及結構時，細胞間信息傳遞功能尚未恢復，其膀胱功能恢復欠佳。該研究通過制作豚鼠糖尿病膀胱模型，向膀胱內聯合灌注SCL和Cx43基因重組慢病毒，通過尿流動力學檢查和激光共聚焦顯微鏡評估膀胱功能及ICC和Cx43變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物普通級荷蘭種健康雄性豚鼠90只，2～3月齡，購于新疆醫科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(新)2020-0003，體質量(345±7) g。飼養條件：室溫21～24℃，相對濕度50%～80%。

1.2 試劑與儀器SCL基因重組慢病毒、Cx43基因重組慢病毒(上海吉凱公司)，鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)(貨號：S0130，美國Sigma 公司)，C-kit一抗(貨號：SNBP1-43359，美國NOVUS公司)，Cx43一抗(貨號：ab235585，美國 Abcam公司)，FITC標記抗小鼠和TRITC標記抗兔免疫熒光染色二抗(貨號：ZF-0311，北京中杉金橋生物技術有限公司)。尿流動力學檢查儀(型號：PRC 026632，加拿大Laborie公司)，激光共聚焦顯微鏡(型號：LSM510，德國Carl Zeiss 公司)。

1.3 方法

1.3.1豚鼠DCP模型的制備 90只健康豚鼠正常飼養1周后禁食8 h，根據體質量，一次性腹腔注射STZ(200 mg/kg)制作糖尿病膀胱模型。6 周后檢測隨機血糖，連續監測4周，以隨機血糖≥16.7 mmol/L為界線篩選出糖尿病豚鼠[6]。將符合標準的豚鼠分籠繼續正常飼養2周。有研究[7]顯示2周后糖尿病豚鼠出現尿頻、尿急、尿潴留等糖尿病膀胱的相應表現，行尿流動力學檢查，豚鼠出現逼尿肌收縮無力、借助腹壓排尿等特點，認為豚鼠DCP模型建立成功。

1.3.2經尿道灌注SCL、Cx43基因重組慢病毒 從糖尿病豚鼠中隨機挑選40只豚鼠，隨機分成4組：糖尿病組、SCL組、Cx43組、SCL+Cx43組，禁食8 h，使用七氟烷吸入麻醉，將麻醉好的豚鼠取仰臥位，使用一次性導尿包，將特制導尿管插入膀胱，在豚鼠恥骨聯合上方膀胱區輕輕按壓促使排出殘余尿液或將其緩慢抽出，使用無菌生理用水沖洗膀胱3次后灌注病毒。前期課題組研究[8]顯示SCL和Cx43慢病毒的最佳感染復數(multiplicities of infection, MOI)為2×107TU/0.2 ml。SCL組和Cx43組灌注慢病毒液0.2 ml，SCL+Cx43慢病毒組灌注SCL和Cx43基因慢病毒液各0.2 ml，糖尿病組灌注空病毒液0.2 ml。灌注完畢后，使用特制陰莖夾，夾住豚鼠陰莖2 h后將其繼續放回籠中飼養。

1.3.3膀胱尿流動力學檢查 豚鼠用水合氯醛(300 mg/kg)進行腹腔內注射麻醉，麻醉后將豚鼠固定于操作臺上，使用石蠟油潤滑特制導尿管，順豚鼠陰莖尿道口緩慢插入膀胱，插入膀胱后使用1 ml注射器將膀胱內尿液緩慢抽出，使用三通閥將特制尿道管分別于測壓管及灌注管相連接，使用特制直腸測壓管與尿動力儀腹壓壓力感受器相連接，每根管連接之前排出空氣。將灌注管排出空氣后與微量注射泵連接，灌注液為無菌生理用水，設置灌注泵灌注速度為10 ml/h。開啟所有操作后體內調零，當有尿液尿出后，記錄此時的尿流動力學相關的數值，包括最大膀胱壓(maximum vesical pressure, Pves Max)、膀胱壓(vesical pressure, Pves)、腹壓(abdominal pressure, Pabd)、逼尿肌壓力(detrosur pressure, Pdet)以及曲線變化，連續記錄5個排尿周期。

1.3.4激光共聚焦顯微鏡觀察ICC及Cx43表達 膀胱組織進行冰凍切片，丙酮固定10 min；使用PBS浸洗3次，每次5 min(可放在搖床，調節合適速度，充分浸洗)；PBS浸洗后擦去多余液體，每張切片滴加5% BSA+0.5% Triton X-100封閉1 h(放入濕盒內，避免干片)；同法PBS浸洗后，滴加一抗，確保組織可以被完全覆蓋，4 ℃冰箱孵育過夜； 調節恒溫浴箱溫度為37 ℃，切片浸洗后，滴加二抗放入孵育箱2 h(滴加二抗以后全程避光操作)；切片浸洗，DAPI染核1 min；切片滴加抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片；使用激光共聚焦顯微鏡觀察ICC和Cx43的表達情況。

2 結果

2.1 DCP模型建立按照豚鼠體質量一次性腹腔注射STZ(200 mg/kg) 6周后，有5只豚鼠死亡，考慮與應激或STZ的毒性有關，85只豚鼠存活，均出現“三多一少”等糖尿病臨床表現。在注射6周后，連續監測4周隨機血糖，以隨機血糖≥16.7 mmol/L為條件篩選出糖尿病豚鼠，造模成功率達95.3%。行尿流動力學檢查，此時糖尿病豚鼠出現膀胱容量增加、順應性降低、逼尿肌收縮無力、腹壓排尿等特點，見圖1。

圖1 豚鼠DCP模型造模前后尿動力學檢查對比A：豚鼠DCP造模前；B：豚鼠DCP造模后

2.2 尿流動力學檢查結果SCL+Cx43組與糖尿病組、SCL組、Cx43組比較，Pdet增加明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，SCL+Cx43組與糖尿病組、SCL組、Cx43組比較，腹壓下降明顯，差異有統計學意義(P<0.05), SCL+Cx43組與糖尿病組、SCL組、Cx43組比較，Pves增加明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。糖尿病組、SCL組、Cx43組的Pdet、Pabd、Pves之間的差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、3。

圖2 經尿道灌注基因后四組尿流動力學檢查對比A：糖尿病組；B：SCL組；C：Cx43組；D：SCL+Cx43組

圖3 四組Pdet、Pabd、Pves參數對比A：糖尿病組；B：SCL組；C：Cx43組；D：SCL+Cx43組；與SCL+Cx43組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 激光共聚焦顯微鏡檢查結果糖尿病組可見ICC樣細胞的數量減少并且梭形雙極結構明顯被破壞，沿胞體沿伸的突起消失，出現細胞裂解狀態。Cx43組與SCL組可見ICC樣細胞的梭形雙極結構有所恢復但數量上沒有明顯改變。其中SCL組在細胞形態及細胞突起方面的改善明顯優于Cx43組，Cx43組的細胞結構未呈現明顯的梭形結構，但沿胞體方向沿伸的細胞突起有一定的改善。SCL組的ICC樣細胞有明顯的梭形結構，細胞突起也有明顯的恢復，但ICC樣細胞數量未見明顯增多。SCL+Cx43組的ICC樣細胞呈現明顯的梭形雙極結構，數量明顯增多，ICC樣細胞之間有細胞突起連接，相鄰的ICC樣細胞之間緊密連接，形成ICC二聚體結構。見圖4。

圖4 四組激光共聚焦顯微鏡結果 ×400

3 討論

研究[2]顯示膀胱逼尿肌中ICC細胞與腸道ICC相似，具有類似的形態學和免疫表型，主要分布在膀胱頂部和三角區。有研究發現ICC樣細胞可能是膀胱逼尿肌的起搏細胞[9]，ICC細胞表面存在酪氨酸蛋白激酶受體(C-kit蛋白)，C-kit與其配體—干細胞因子(stem cell factor, SCF) 結合后啟動SCF/C-kit信號通路，對ICC細胞的發育、分化及表型維持至關重要。在C-kit基因調控區上存在SCL結合位點，SCL主要是通過作用于C-kit 基因啟動子調節C-kit 表達來發揮其“生存基因”的功能，既而影響ICC的結構及功能。

在糖尿病長期發展引起的膀胱病變中，ICC樣細胞的結構被破壞，數量減少，從而引起ICC樣細胞相關功能減弱，出現DCP。前期課題組成員通過建立豚鼠DCP模型和體外高糖環境下培養ICC等方式，結果顯示體內及體外高糖環境下ICC樣細胞的結構被破壞，膀胱功能出現障礙[10]。前期課題組成員通過尿道向膀胱灌注SCL基因重組慢病毒并成功轉染膀胱，發現SCL基因可以在Cajal樣細胞中表達[11]，使ICC樣細胞的數量及結構有一定程度恢復，但對膀胱功能只起到部分改善作用，課題組成員推測在DCP中，受損的不僅僅是ICC樣細胞，其信號通路也有一定的損害。ICC細胞與各細胞之間以及其他細胞間依靠豐富的細胞連接進行信號分子、離子及物質交換，有研究[12]表明Cx43是其主要成分，當細胞之間的連接方式被破壞，蛋白表達異常，則細胞之間進行信息、物質傳遞的功能出現障礙，這是導致糖尿病相關并發癥的主要病因之一。Cx43在膀胱逼尿肌中也有分布，在DCP中，ICC及Cx43的數量減少，細胞形態及電生理功能等出現一定程度的損害，最終影響膀胱的生理功能。研究[13]表明，在DCP膀胱中，Cx43的結構被破壞，其細胞間通訊功能降低，電信號傳輸異常，動作電位無法正常傳導。

通過上述研究的結果，筆者對DCP的發病機制有了全新的認識并且有了新的推測，在DCP中，ICC樣細胞和Cx43都出現了損害，當單獨恢復ICC或者Cx43的功能時，細胞起搏信號以及信號傳導通路都不能恢復正常，為了驗證上述推論，課題組進行了初步研究。

通過一次性腹腔注射1%STZ制作豚鼠糖尿病模型，12周后使用尿流動力學檢查篩選出符合DCP標準的糖尿病模型，豚鼠出現逼尿肌收縮無力、腹壓排尿、殘余尿量增加、膀胱順應性下降等糖尿病膀胱特點，與前期研究[14]結果相符。通過吸入麻醉方式麻醉豚鼠，豚鼠糖尿病膀胱模型成功后，豚鼠機體應激能力降低，采用吸入麻醉可減小對豚鼠的刺激，保證存活率。麻醉成功后使用特制尿管插入豚鼠膀胱進行慢病毒灌注，通過尿道灌注可貼近臨床實際情況，避免不必要的損傷。前期課題組實驗結果提示病毒灌注最佳MOI濃度為2×107TU/0.2 ml，可滿足大多數轉染實驗需求[8]。另外，前期實驗發現在灌注14 d后行qRT-PCR和Western blot檢測顯示C- kit在mRNA和蛋白水平上的轉染效果較轉染2、7、28 d更好[15]，這也提示最佳藥物半衰期可能為14 d左右。

通過灌注慢病毒14 d后行尿流動力學檢查，SCL+Cx43組與糖尿病組、SCL組、Cx43組相比，在Pdet、Pves、Pabd方面的差異有統計學意義(P<0.05)，提示在DCP膀胱中，SCL聯合Cx43可改善ICC細胞的結構及數量，并且使細胞間的信號通路也有改善，使ICC細胞產生的起搏信號電位變化傳導至效應器，最終使膀胱收縮功能有一定程度的改善。SCL組、Cx43組、糖尿病組之間Pves、Pdet、Pabd差異無統計學意義(P>0.05)，筆者考慮單一灌注SCL或Cx43，膀胱收縮信號傳導通路功能恢復不完全，動作電位產生不夠或者下傳受阻，最終導致膀胱功能改善欠佳。激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，SCL+Cx43組的ICC樣細胞結構恢復其梭形雙極結構，數量也有增多，沿細胞胞體方向沿伸的細胞突起將ICC樣細胞連接在一起形成ICC二聚體結構，有研究[16]通過膜片鉗技術檢測顯示膀胱ICC二聚體的內向電流明顯高于單體ICC細胞，ICC二聚體之間有廣泛的細胞突起相互連接，提示ICC二聚體是膀胱收縮主要的起搏細胞，說明SCL聯合Cx43可使ICC樣細胞的結構及數量有所恢復，并且在功能上也有改善，為膀胱發揮功能提供基礎。當單一灌注SCL或Cx43時，ICC樣細胞結構或細胞突起及細胞間連接改善不明顯，可能導致膀胱功能恢復欠佳。