弓形蟲Chinese 1基因型蟲株感染對小鼠海馬體細胞超微結構的影響

王 崇，蔡亦紅

剛地弓形蟲是一種頂復門胞內寄生原蟲，具有廣泛的中間宿主(包括人類)，其終宿主為貓科動物，在世界各地約有三分之一的人口感染[1]，弓形蟲感染可對宿主腦部功能產生嚴重的不良影響，如神經退行性疾病、弓形蟲腦炎和先天性弓形蟲腦病等[1-3]。海馬體對生命機體至關重要，其功能異常與癲癇發作[4]、精神分裂癥、阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)[5]、帕金森病[6]、抑郁癥[5]等多種疾病相關。小鼠慢性感染ME49蟲株模型初步形態學研究[7]顯示，海馬體中存在弓形蟲包囊，并伴有神經膠質細胞增生和壞死。因此，課題組選擇海馬體作為Chinese 1優勢基因型蟲株導致的弓形蟲腦病伴精神障礙致病機制的研究靶點。該研究利用透射電鏡技術觀察弓形蟲Chinese 1優勢基因型中TgCtwh3和TgCtwh6這兩種不同毒力蟲株對小鼠海馬體細胞超微結構的影響，有助于分析其致病機制，并為弓形蟲急性和慢性階段的腦損傷機制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1蟲株 Chinese 1優勢基因型蟲株(TgCtwh3、TgCtwh6)，前者為強毒株；后者為成囊株。兩種蟲株均在安徽醫科大學病原生物學安徽省重點實驗室中通過小鼠體內保種。

1.1.2實驗動物 18只6周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠(15～17 g，無特定病原體)購于杭州子源實驗動物科技有限公司(生產許可證號：SCXK2019-004)。實驗動物按照安徽醫科大學《研究動物護理和使用指導原則》進行飼養，環境溫度保持在20～25 ℃，相對濕度為40%～70%。所有動物實驗均經動物倫理委員會許可(No. AMU26-081108)。

1.1.3主要試劑和儀器 4%多聚甲醛通用型組織固定液、磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.3)購自Biosharp生物技術有限公司；用PBS配制的2.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定液購自上海麥克林生化科技有限公司；水合三氯乙醛購自上海麥克林生化科技有限公司。Leica EM UC7超薄切片機購自德國Leica公司；120 kV透射電鏡(Talo L120C G2)購自美國賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1蟲體獲取 抽取感染TgCtwh3蟲株的保種小鼠腹水，光鏡下觀察TgCtwh3蟲株速殖子運動活躍，狀態良好；用血細胞計數板在400倍光鏡下計數，再以無菌PBS稀釋腹水直至含蟲密度為2×104個/ml。取TgCtwh6蟲株保種小鼠腦組織，用5 ml PBS通過200目無菌濾網對腦組織進行研磨勻漿，在光鏡下觀察計數，再以無菌PBS稀釋勻漿直至含包囊密度為100個/ml。

1.2.2實驗分組及處理 將18只小鼠隨機均分為3組： 對照組、TgCtwh3感染組和TgCtwh6感染組。對照組：每只小鼠腹腔注射無菌PBS 0.2 ml。TgCtwh3感染組：每只小鼠腹腔注射4 000個速殖子[8]，飼養6 d，小鼠出現畏光、弓背豎毛、體質量下降。TgCtwh6感染組：每只小鼠灌胃20個包囊[7-8]，飼養約1周，小鼠出現畏光、弓背豎毛、體質量下降，繼續飼養5周，小鼠體質量逐漸恢復，毛發恢復順滑。

1.2.3標本的取材、制備和海馬體細胞超微結構觀察 小鼠稱重，腹腔注射10%水合氯醛溶液0.1 ml/20 g進行麻醉；開胸暴露心臟，經左心室插入靜脈輸液針(0.45 mm×16RW SB)，然后剪開右心房，快速灌注PBS至心臟、肝臟等褪去血色，改灌注4%多聚甲醛通用型組織固定液，固定至小鼠全身僵直，取出腦組織，用PBS配制的2.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定液在4 ℃條件下預固定；于冰上鈍性剝離右側海馬體并置于載玻片上，在海馬體上滴加用PBS配制的2.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定液，取海馬體組織1 mm3，將海馬體置于含有1.3 ml PBS配制的2.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定液的1.5 ml EP管中，在4 ℃避光條件下繼續固定。按透射電鏡標本要求常規制備樣品，Leica EM UC7超薄切片機切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在120 kV透射電鏡下觀察海馬體細胞超微結構變化并拍照。

2 結果

2.1 光鏡下觀察小鼠腦組織中的弓形蟲蟲體取TgCtwh3感染組和TgCtwh6感染組小鼠腦組織，勻漿后涂片，TgCtwh3感染組用吉姆薩染色后在光鏡下觀察(圖1A)，TgCtwh6感染組直接用光鏡觀察(圖1B)，可見兩組均可從小鼠腦組織中分離出蟲體。

圖1 TgCtwh3感染組和TgCtwh6感染組腦組織蟲體分離A：TgCtwh3感染組小鼠腦組織勻漿涂片光鏡圖 ×1 000；B：TgCtwh6感染組小鼠腦組織勻漿涂片光鏡圖 ×400；黑色三角箭頭：弓形蟲蟲體

2.2 對照組海馬體細胞超微結構觀察對照組小鼠腦組織進行電鏡標本制備和觀察，結果顯示正常神經元細胞的細胞膜和核膜完整，可見雙層膜，核呈卵圓形，核液中散在分布有常染色質和異染色質，密度較為均一，可見核仁(圖2A、2C)。核旁可見線粒體、內質網、核糖體基本正常；線粒體嵴清晰可見，雙層膜結構完整(圖2B、2D)。

圖2 對照組的海馬體細胞超微結構A、C：對照組正常神經細胞電鏡圖；B：圖A中的局部放大；D：圖C中的局部放大；N：細胞核；ER：內質網；Mi：線粒體；藍色雙箭頭：細胞膜；黑色單箭頭：脂褐素

2.3 TgCtwh3感染組海馬體細胞超微結構TgCtwh3感染組小鼠腦組織進行電鏡標本制備和觀察，細胞發生核皺縮壞死(圖3A、3D)。圖3A中細胞核居中，核呈不規則狀，核膜不完整，細胞質中的細胞器少，細胞邊界不清楚，樹突和胞質空泡化。圖3B中細胞外出現淺亮空泡。圖3C可見軸索斷裂。圖3D中細胞的核質比小于1/4，核皺縮，核雙層膜結構模糊不清；胞質腫脹且電子密度低，大量細胞器消失，僅可見一些線粒體結構。

圖3 TgCtwh3感染組的海馬體細胞超微結構A-D：TgCtwh3感染組海馬體細胞電鏡圖；N：細胞核；黑色雙箭頭：細胞核異常；橙色單箭頭：胞質腫脹；藍色單箭頭：髓鞘斷裂

2.4 TgCtwh6感染組海馬體細胞超微結構圖4A中細胞核呈卵圓形，核仁大而明顯，位置居中，核膜完整，細胞核基本正常；細胞器豐富，胞質中可見溶酶體、線粒體、內質網、高爾基體等；胞質中有多處脂褐素沉積；部分線粒體出現嵴斷裂消失；高爾基體出現輕微擴張。圖4C中線粒體出現嵴斷裂消失；高爾基體出現輕微擴張；胞質中顆粒物較多。圖4D可見胞質中顆粒物較多；線粒體出現腫脹，嵴斷裂消失，線粒體膜破裂；胞外出現空泡。圖4E中細胞核結構完整；胞質中可見髓樣小體、脂褐素、線粒體；線粒體出現嵴斷裂消失和膜破裂。圖4F中線粒體嵴消失，可見自噬小體(標尺:1 μm)

圖4 TgCtwh6感染組的海馬體細胞超微結構A-F：TgCtwh6感染組海馬體細胞電鏡圖；B：圖A的局部放大；N：細胞核；Ly：溶酶體；白色單箭頭：線粒體損傷；白色雙箭頭：高爾基體擴張；橙色單箭頭：胞質腫脹；黑色單箭頭：脂褐素；紅色單箭頭：自噬小體；紅色雙箭頭：髓樣小體

2.5 三組海馬體細胞超微結構表型匯總如表1所示：與TgCtwh6感染組相比，TgCtwh3感染組海馬體細胞形態改變更加嚴重，如核皺縮、細胞器消失、樹突和胞質空泡化、細胞壞死等，這些病理改變多為不可恢復的。而TgCtwh6感染組更多的出現線粒體嵴斷裂溶解、高爾基體輕微擴張等可逆轉的病理改變，以及溶酶體殘體沉積等累積性的形態學變化。

表1 三組海馬體細胞超微結構改變匯總(例，n=6)

3 討論

近年來，世界各地人和動物體內分離蟲株的基因分型結果顯示，世界各地弓形蟲具有豐富的遺傳多樣性[9]。本課題組分離到來自我國多個省份的51株貓源性和人源性弓形蟲蟲株，基因分析發現不同于歐美地區原型克隆譜系，結合國內其他學者對動物源蟲株的分析結果，命名為Chinese 1型(即ToxoDB#9)。該基因型包含同一基因型、毒力不同的蟲株[10]。TgCtwh3蟲株(強毒株)對于小鼠的毒力介于Ⅰ型和Ⅱ型之間；TgCtwh6蟲株(弱毒株)毒力與Ⅱ型相仿，能在腦組織中形成包囊，具有與TgCtwh3相似的宿主細胞侵入能力，但復制率低于TgCtwh3蟲株[11]。兩種相同基因型毒力不同的蟲株所造成的機體損傷存在差異，如對于不良妊娠機制的誘導，然而其腦損傷的機制仍不清楚，但是根據TgCtwh3和TgCtwh6的表型特征，推測這兩種蟲株具有迥異的致病機制[11]。弓形蟲對中樞神經系統的影響在超微水平的研究還未見報道，因此，本實驗利用透射電鏡技術觀察TgCtwh3和TgCtwh6這兩種蟲株感染對海馬體細胞超微結構的影響，為兩種蟲株的腦損傷機制研究提供形態學依據。

本研究結果顯示，TgCtwh3和TgCtwh6對小鼠海馬體細胞超微結構的影響不盡相同。TgCtwh3感染組細胞出現核皺縮壞死、軸突空泡化、細胞器消失等一系列不可恢復的病理變化；此外可觀察到明顯的軸索斷裂，由于軸索恢復能力較差，其斷裂將影響細胞的興奮傳遞功能。TgCtwh3蟲株的急性感染使海馬體細胞發生壞死、溶酶體裂解和細胞自溶，因此壞死細胞中大量細胞器消失，軸突和胞質空泡化，同時，壞死細胞內容物的外溢將進一步促進壞死的發生和實質細胞溶解，給海馬體細胞帶來不可逆傷害。海馬體細胞的損傷將對機體的認知能力、學習能力以及情感控制產生不良影響，有利于癲癇和精神分裂癥等疾病的發展[4]。而免疫低下患者的弓形蟲急性發作期間可觀察到意識障礙和癲癇發作，提示海馬體細胞壞死可能是TgCtwh3蟲株急性感染階段的致病機制之一。

相較之下，TgCtwh6感染組對于腦組織海馬體細胞的影響多表現為慢性的累積性損傷。TgCtwh6感染組小鼠海馬體細胞出現了線粒體嵴斷裂、高爾基體輕微擴張等可逆性改變，胞質中存在脂褐素、髓樣小體和自噬溶酶體等，表明細胞在TgCtwh6包囊存在下一直存在慢性損傷和自我修復。TgCtwh6感染組細胞中脂褐素的累積會導致細胞代謝緩慢，活性下降，常常在神經退變以及衰老機體中出現，可造成多種不良影響，如記憶力下降、睡眠質量下降等。比較不同感染組整體細胞結構的超微變化顯示，TgCtwh6感染組對于線粒體超微結構的影響尤為明顯。線粒體是細胞內的關鍵細胞器，是細胞的能量中心，不僅涉及細胞的代謝狀態，還涉及多種細胞功能，如增殖、鈣信號、脂質轉運、活性氧產生和凋亡等[12]。與疾病相關的一般線粒體異常包括線粒體電子傳輸鏈損傷、線粒體形態和動力學的改變、mtDNA突變和鈣平衡異常。在TgCtwh6感染組中，細胞中可觀察到大量的線粒體腫脹，嵴斷裂消失，線粒體膜破裂等線粒體損傷。線粒體膜破裂使得線粒體中的mtDNA 和活性氧泄漏到細胞質中，進入細胞質中的mtDNA可以激活各種炎癥通路[13]，包括cGAS-STING信號、NLRP3 和炎性小體等，導致炎癥激活；此外，線粒體活性氧釋放到胞質中可導致細胞氧化損傷。線粒體腫脹，嵴斷裂消失將影響其功能的發揮，其功能障礙會導致一系列疾病，特別是影響神經系統[14]。同時，在神經退行性疾病又會嚴重影響線粒體動力學，線粒體功能障礙與神經系統疾病相輔相成。綜上，TgCtwh6潛伏感染與一些神經和精神疾病相關的致病原因可能為海馬體細胞的線粒體損傷、脂褐素累積以及慢性炎癥。另外，近年來有研究[15]證明，線粒體功能異常是鐵死亡的主要機制之一，而鐵死亡參與多種神經退行性疾病的進程。這再次印證線粒體功能在退行性疾病中的關鍵作用，也為研究弓形蟲腦病致病機制研究提供新的思路。

本研究利用透射電鏡技術觀察細胞超微結構，探討弓形蟲感染對細胞超微結構的影響及其規律，結果表明我國優勢基因型蟲株TgCtwh3和TgCtwh6對于小鼠海馬體細胞的主要損傷機制不同，為研究TgCtwh3和TgCtwh6蟲株感染所致腦損傷機制奠定基礎，也為急性和慢性弓形蟲感染的腦損傷機制研究提供線索。