沉默肌動蛋白樣6A對胰腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響

林振宇，董慶泰，張建新，鐘 彬，張 濤，尚作宏，殷 微，李中虎，馬丹丹，金煒東,

胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，發病率和病死率逐年上升，其5年生存率小于8%[1]。2020年統計數據顯示，在185個國家36種惡性腫瘤中，胰腺癌是腫瘤導致死亡的主要原因之一，排名第7位[2]。其具有早期診斷率低，中晚期時常伴隨著病灶轉移，療效欠佳且預后差等特點。因此提高胰腺癌的早期診斷率，尋找新的腫瘤基因治療靶點迫在眉睫。

ACTL6A 基因編碼肌動蛋白相關蛋白家族成員，并且與傳統的肌動蛋白具有顯著的氨基酸序列同源性。ACTL6A是ATP依賴性SWI/SNF樣BRG1/BRM相關因子復合體的重要組成部分，參與人體內多種生理過程，包括囊泡運輸、調控基因轉錄、紡錘體定向、核遷移和染色質重塑[3]。ACTL6A與前列腺癌[4]、肝癌[5]、膠質瘤[6]、膽管癌[7]等多種腫瘤的發生發展密切相關。但目前其在胰腺癌中的表達和作用尚不明確，該研究主要通過探討沉默ACTL6A對胰腺癌細胞增殖、侵襲、轉移及凋亡的影響，分析ACTL6A在胰腺癌中的細胞生物學功能。

1 材料與方法

1.1 基因表達差異分析利用Oncomine數據庫檢索ACTL6A在胰腺癌組織及正常胰腺組織中的基因表達差異。在Oncomine數據庫篩選“ACTL6A”基因，設定條件為：“normalvscancer”、“pancreatic cancer”、“mRNA”，獲得各個研究中胰腺癌組織與正常胰腺組織中的表達情況，并行薈萃分析。

1.2細胞培養及轉染① SW1990細胞系培養于DMEM培養基(含10%的胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。② 取對數生長期細胞接種于6孔培養板，待貼壁后，使用陽離子脂質載體Lipofectamine 2000將沉默ACTL6A質粒及siRNA陰性對照質粒分別轉染SW1990細胞作為siRNA-ACTL6A組與siRNA-NC組。

1.3 CCK-8實驗取對數生長期siRNA-ACTL6A組與siRNA-NC組細胞接種于96孔板，每組設置3個復孔。分別于培養24、48 h后加入10% CCK-8試劑，每孔10 μl，放入37 ℃培養箱孵育2 h。最后進行檢測(酶標儀波長450 nm)，記錄吸光度(absorbance, A)值。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡用胰酶消化siRNA-ACTL6A組與siRNA-NC組細胞，5 000 r/min離心5 min，重懸后制成細胞懸浮液，調整細胞懸液濃度為1.0×105/ml，接種于96孔板中，每孔中加入細胞懸液0.2 ml，培養48 h后，PBS清洗2次；低溫下加入Binding Buffer重懸細胞。室溫避光條件下取100 μl細胞懸液加入5 μl的AnnexinV-FITC和Propidium Iodide，靜置10 min。最后加入400 μl Binding Buffer混勻，流式細胞儀檢測細胞凋亡。每組設置3個復孔。

1.5 Transwell實驗用胰酶消化siRNA-ACTL6A組與siRNA-NC組細胞，1 000 r/min離心5 min，取沉淀用DMEM重懸，形成單細胞懸液，調整細胞密度為1.0×106/ml。每孔取100 μl細胞懸液并接種到含有無血清培養基的Transwell小室上層中。下室內加入500 μl有血清的DMEM高糖培養基。置入配養箱中培育24 h后，在室溫下每孔加入1 ml 4%多聚甲醛固定15 min，用PBS洗去甲醛，棉簽擦去上室未遷移細胞，0.5%結晶紫染液染色15 min，自然風干后在顯微鏡下以200倍放大觀察染色細胞。每組設置3個復孔。

1.6 劃痕實驗用胰酶消化siRNA-ACTL6A組與siRNA-NC組細胞，1 000 r/min離心5 min，取沉淀用DMEM重懸，形成單細胞懸液，鋪于6孔板中培養，待細胞鋪滿貼壁，用10 μl消毒槍頭垂直劃痕，PBS洗3次，使用顯微鏡記錄此時的細胞圖像并記錄劃痕寬度，記為0 h；加入無血清DMEM培養基置于培養箱中培養，48 h后再用拍攝顯微鏡記錄此時的細胞圖像并記錄劃痕寬度，放大圖片倍數為200倍。

1.7 GSEA富集分析收集癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數據庫中ACTL6A在胰腺癌中的基因表達數據。以胰腺癌患者ACTL6A mRNA表達水平的中位數為分割點將患者劃分ACTL6A高表達組與ACTL6A低表達組。基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)是基于JAVA語言的一款基因富集分析軟件，本研究利用GESA軟件進行KEGG通路富集分析。每次分析進行1 000次基因組排列。校正P值及錯誤發現率(false discovery rate，FDR)均小于0.05的基因組被認為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 ACTL6A mRNA在胰腺癌組織及正常胰腺組織中的基因表達差異Oncomine數據庫中有4項子研究符合篩選條件。4項子研究分別為BadeaPancreas、Lacobuzio-Donahue Pancreas2、Pei Pancreas及Segara Pancreas，共包含117個胰腺癌組樣本及66個正常胰腺組織樣本。對其進行薈萃分析，結果顯示ACTL6A在胰腺癌組織中的表達水平高于正常胰腺組織(P<0.05)。見圖1。

圖1 ACTL6A在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達差異

2.2 沉默ACTL6A抑制胰腺癌SW1990細胞的增殖CCK-8法實驗表明，與siRNA-NC組相比，siRNA-ACTL6A組胰腺癌SW1990細胞的增殖能力明顯下降，在24、48 h吸光度值差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。表明沉默ACTL6A抑制胰腺癌細胞的增殖。

表1 CCK-8法檢測胰腺癌細胞的增殖

2.3 沉默ACTL6A促進了胰腺癌SW1990細胞的凋亡細胞凋亡實驗結果如圖2所示，siRNA-ACTL6A組的凋亡率明顯高于siRNA-NC組(t=12.192,P<0.001)，表明沉默ACTL6A明顯促進了胰腺癌細胞的凋亡。

圖2 沉默ACTL6A促進SW1990細胞的凋亡與siRNA-NC組比較：***P<0.001；Q1區：機械損傷；Q2區：晚期凋亡或壞死；Q3區：早期凋亡細胞；Q4區：正常存活

2.4 沉默ACTL6A抑制了胰腺癌SW1990細胞的侵襲Transwell實驗結果如圖3所示，siRNA-ACTL6A組侵襲細胞數較siRNA-NC組明顯減少(t=4.464,P<0.05)。表明沉默ACTL6A抑制胰腺癌細胞的侵襲。

圖3 沉默ACTL6A抑制SW1990細胞的侵襲 ×200與siRNA-NC組比較：*P<0.05

2.5 沉默ACTL6A抑制了胰腺癌SW1990細胞的遷移劃痕實驗結果如圖4所示，48 h后siRNA-ACTL6A組愈合率較siRNA-NC組低，差異有統計學意義(t=3.960,P<0.05)。表明沉默ACTL6A抑制胰腺癌細胞的遷移。

圖4 沉默ACTL6A抑制SW1990細胞的遷移 ×200與siRNA-NC組比較：*P<0.05

2.6 GSEA信號通路富集分析GSEA研究結果顯示：ACTL6A mRNA高表達組在細胞周期通路、核苷酸切除修復、堿基切除修復、DNA復制、癌癥信號通路、NOTCH信號通路等相關基因集出現上調(P<0.05)。當ACTL6A基因表達上調時，上述通路被激活。結果如表2和圖5所示。

圖5 基因集GSEA的富集圖

表2 高表達ACTL6A的GSEA富集結果

3 討論

胰腺癌因其高侵襲性和轉移性，目前治療該疾病仍然面臨諸多困難。隨著基因治療技術的發展，分子靶向治療已成為胰腺癌診療的熱點。由于缺乏胰腺癌特異的分子靶點，不利于胰腺癌的早期診斷、治療及預后的評估。因此深入探索胰腺癌發病潛在的分子靶點對于疾病的診療至關重要。

研究表明，ACTL6A在多種癌癥中高度表達，Jin et al[4]發現，同正常前列腺組織相比，ACTL6A 在前列腺癌組織中的表達顯著升高，并且與雄激素受體的表達密切相關。Xiao et al[5]同樣發現，ACTL6A 于人肝細胞癌組織及細胞系中高表達。在膠質瘤組織中的ACTL6A表達水平高于正常腦組織且ACTL6A的高表達與不良預后相關[6]。本研究中，Oncomine數據庫分析結果顯示ACTL6A在胰腺癌組織中的表達水平高于正常胰腺組織。與相關文獻[4-6]報道一致，均有力證實ACTL6A在胰腺癌中高表達。

本研究中，體外細胞學實驗結果表明沉默ACTL6A抑制胰腺癌細胞增殖、侵襲及遷移，并促進其凋亡。研究[8]顯示ACTL6A在卵巢癌中過表達，并且ACTL6A過表達與預后不良相關。體外沉默ACTL6A可抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并降低葡萄糖利用、乳酸生成和丙酮酸水平。Shrestha et al[9]發現ACTL6A可促進鱗狀細胞癌細胞增殖、侵襲和遷移，并且ACTL6A基因敲除可顯著抑制其細胞生物學功能。在膽管癌組織中，ACTL6A呈現異常表達，沉默ACTL6A基因后，人膽管癌QBC939細胞的增殖、遷移和侵襲能力受到明顯抑制[7]。Jian et al[10]研究發現ACTL6A的過表達促進了乳腺癌細胞增殖和腫瘤生長，而沉默ACTL6A則抑制了乳腺癌細胞增殖和腫瘤生長。本研究結果證實ACTL6A在胰腺癌中表現為癌基因特性，可能具備作為胰腺癌新治療靶點的潛力。

近年來研究發現胰腺癌相關基因突變多集中于DNA損傷修復、細胞周期調控、TGF-β信號通路、染色質調節、軸突導向通路等[11]。Zhong et al[12]研究發現在急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)患者中ACTL6A的表達異常升高，其體外實驗證實沉默ACTL6A基因能夠促進NB4和HL-60細胞的分化，表明ACTL6A在APL分化中具有重要作用，進一步機制研究發現，ACTL6A是通過SOX2和Notch1信號傳導途徑來促進細胞的分化。Xiao et al[5]研究表明ACTL6A通過激活NOTCH信號通路促進肝細胞癌轉移和上皮-間質轉化，ACTL6A不僅通過SOX2激活NOTCH1信號通路，而且還通過SOX2影響肝癌細胞的生物學行為。Zhang et al[8]發現在卵巢癌組織中，ACTL6A和PGK1的表達呈正相關，ACTL6A過表達增加PGK1表達，而敲低ACTL6A則相反。ACTL6A表達改變通過下調PGK1抑制卵巢癌細胞體內致瘤性。在喉鱗癌細胞中，ACTL6A的敲除抑制了Yes相關蛋白(YAP)介導的信號通路的激活，而YAP的重新激活顯著逆轉了ACTL6A沉默介導的喉鱗癌細胞增殖和侵襲的抑制[13]。Li et al[14]研究發現ACTL6A的表達可能通過S6K1/pS6通路促進食管鱗狀細胞癌細胞周期的再分配來影響細胞的增殖和DNA合成。本研究中，利用GSEA富集分析預測ACTL6A在胰腺癌中發揮功能的可能信號通路，結果顯示ACTL6A在胰腺癌中發揮功能的可能信號通路有細胞周期通路、NOTCH信號通路等，與文獻[5,14]報道一致。除此之外，還有核苷酸切除修復信號通路、堿基切除修復信號通路、DNA復制信號通路、癌癥信號通路等，可為ACTL6A在胰腺癌中的機制研究提供更多線索和思路。