靶向間皮素的CAR-NK-92對卵巢癌的作用研究

葛 瑤，劉 琦，王春燕，劉淑鵬，程忠平

卵巢癌是婦科惡性腫瘤里致死率最高的腫瘤，大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)處于疾病晚期(III-IV期)[1]。目前中晚期卵巢癌患者的治療原則是以手術(shù)治療為主，輔以紫杉醇和鉑類藥物的化療，但對于晚期復(fù)發(fā)難治的卵巢癌患者療效有限，仍然需要尋求更有效的治療方法[2]。近年來，免疫細(xì)胞療法的出現(xiàn)為腫瘤治療帶來了新的方向，而嵌合抗原受體修飾自然殺傷(chimeric antigen receptor engineered-natural killer, CAR-NK)細(xì)胞是免疫細(xì)胞療法的新突破。這種特異性的基因改造使得NK細(xì)胞獲得了特異靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。理想情況下，CAR靶點(diǎn)一般為腫瘤細(xì)胞表面特異性高表達(dá)而正常細(xì)胞表面低表達(dá)的蛋白。間皮素作為一種膜表面糖蛋白，在卵巢癌中高表達(dá)，而在正常間皮組織中表達(dá)較低[3]。該研究構(gòu)建了以間皮素為靶點(diǎn)的CAR-NK-92細(xì)胞，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分別驗(yàn)證CAR-NK-92細(xì)胞對卵巢癌的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 組織樣本來源和細(xì)胞系2例正常卵巢組織樣本和21例卵巢腫瘤組織樣本均來自同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。4～6 周齡雌性SPF級NCG 小鼠，16～18 g，共計(jì)12只，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，許可證號：SYXK(滬)2021-0012，合格證編號：NO.202144322。所有方案均經(jīng)同濟(jì)大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。人卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3及NK-92細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，保存于同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科。OVCAR3-LUC細(xì)胞是由熒光素酶慢病毒pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE轉(zhuǎn)染OVCAR3細(xì)胞獲得。

1.2 主要試劑和儀器馬血清(horse serum, HS)(貨號：16050-122)和胎牛血清(foetal bovine serum, FBS)(貨號：10099-141)購自美國Gibco公司；重組人纖維蛋白(貨號：GMP-CH38)購自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；PE anti-DYKDDDDK Tag 抗體購自美國Biolegend公司；抗間皮素(mesothelin, MSLN)抗體(貨號：A14099)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒(貨號：C20301)購自美國英杰生命技術(shù)有限公司；干擾素γ (interferon-γ, IFN-γ)檢測試劑盒(貨號：DIF50C)和腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor, TNF-α)檢測試劑盒(貨號：DTA00D) ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司；D-熒光素鉀鹽(貨號：40902ES02)購自中國翌圣生物科技股份有限公司。FACSCanto II 流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)SKOV3、OVCAR3培養(yǎng)于含10% FBS的1640培養(yǎng)基，NK-92培養(yǎng)于添加0.2 mmol/L 肌醇、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、0.02 mmol/L葉酸、200 U/ml白細(xì)胞介素-2(interleukin-2, IL-2)、12.5%HS、12.5% FBS和1%青霉素鏈霉素溶液的MEMα培養(yǎng)基中。

1.4 方法

1.4.1CAR載體的構(gòu)建 anti-MSLN的序列來自GenBank: AF035617.1，CAR的結(jié)構(gòu)包含了胞內(nèi)CD137和CD3ζ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，中間段CD8的跨膜區(qū)，胞外部分CD8鉸鏈區(qū)、Anti-MSLN scFv和Flag結(jié)構(gòu)。與此同時(shí)，構(gòu)建含有GFP熒光蛋白的空載體作為對照。

1.4.2MSLN-CAR-NK-92的構(gòu)建 使用包裝MSLN-CAR載體的慢病毒轉(zhuǎn)染NK-92細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 d，使用人纖維蛋白液包板24孔板，4 ℃冰箱過夜。轉(zhuǎn)染當(dāng)天用生理鹽水將包板洗2次，再向板內(nèi)加入感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)70的慢病毒懸液、NK-92細(xì)胞及MEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，放置培養(yǎng)箱5～6 h后補(bǔ)加含有IL-2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；第2天1 000 r/min離心5 min，換液后繼續(xù)培養(yǎng)，第4天檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4.3流式細(xì)胞術(shù)檢測CAR-NK-92細(xì)胞的構(gòu)建效率 將CAR-NK-92和NK-92細(xì)胞離心棄上清液，使用3%牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)重懸后，孵育20 min。使用PE anti-DYKDDDDK Tag流式抗體試劑進(jìn)行細(xì)胞表面染色，孵育30 min，再用PBS洗2次，上機(jī)檢測。所有樣本在FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀上進(jìn)行操作，使用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.4.4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 把CAR-NK-92、control-GFP(GFP空載慢病毒轉(zhuǎn)染的NK-92)與OVCAR3及SKOV3按照效應(yīng)細(xì)胞 ∶靶細(xì)胞為2 ∶1和1 ∶1時(shí)共培養(yǎng)4 h，檢測上清液中LDH活性(反映細(xì)胞毒性)。陽性對照組為加入10 μl裂解液的卵巢癌細(xì)胞組，靶細(xì)胞對照組為不做處理的卵巢癌細(xì)胞組，使用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度判斷各組中LDH的活性。NK細(xì)胞的毒性計(jì)算公式為：裂解率(%)=(實(shí)驗(yàn)組吸光度-靶細(xì)胞對照組吸光度)/(靶細(xì)胞最大裂解吸光度-靶細(xì)胞對照組吸光度)×100%。

1.4.5TNF-α及IFN-γ的檢測 將CAR-NK-92、control-GFP(GFP空載慢病毒轉(zhuǎn)染的NK-92)與OVCAR3及SKOV3按照效應(yīng)細(xì)胞 ∶靶細(xì)胞為10 ∶1共培養(yǎng)4 h，使用ELISA法檢測上清液中TNF-α及IFN-γ的表達(dá)。

1.4.6免疫組化分析 將組織放入液體石蠟中，冷凍包埋切片。加山羊血清37 ℃溫箱中封閉40 min。再加入抗MSLN抗體(1 ∶1 000)孵育，4 ℃冰箱過夜。將石蠟切片放入PBS中洗滌后，孵育二抗(1 ∶10 000)，37 ℃溫箱中放置1 h。將石蠟切片放入PBS洗滌后，加SABC和顯色劑，蘇木精復(fù)染，使用正置顯微鏡觀察。使用ImageJ軟件對免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4.7免疫熒光實(shí)驗(yàn) 為了檢測卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3和SKOV3上MSLN的表達(dá)，依次使用4% PFA和0.5% PBST對OVCAR3和SKOV3進(jìn)行固定和通透，使用3%BSA封閉30 min，再使用anti-MSLN抗體孵育，放置4 ℃冰箱過夜，第2天使用紅色熒光Cy3二抗和DAPI試劑避光染色。使用激光共聚焦顯微鏡觀察OVCAR3和SKOV3上MSLN的表達(dá)。

1.4.8體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 小鼠飼養(yǎng)在無菌環(huán)境中，每天觀察小鼠飲食及健康狀況，每周記錄一次小鼠體質(zhì)量。在第0天時(shí)，將熒光素酶基因標(biāo)記的OVCAR3細(xì)胞消化并用PBS重懸成每毫升懸液中含2×106個(gè)細(xì)胞，在NCG小鼠腹腔內(nèi)注射細(xì)胞懸液100 μl。在第4天和第11天，分別向小鼠腹腔注射1×107個(gè)CAR-NK-92細(xì)胞或者NK-92細(xì)胞。在此期間，使用活體成像儀觀察小鼠腹腔內(nèi)腫瘤生長情況。活體成像時(shí)，將小鼠放入麻醉箱中，使用異氟烷麻醉3 min，腹腔注射配置好的100 μl D-熒光素鉀鹽，底物注射10 min后進(jìn)行活體成像檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Prism 8.0軟件和Excel對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)性卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞系MSLN的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示(圖1A)，MSLN在正常卵巢組織中呈低表達(dá)或者不表達(dá)，而在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。為了更好地評估MSLN在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，從每個(gè)樣本隨機(jī)選取一個(gè)視野，按照MSLN陽性和陰性區(qū)域所占百分比的高低繪制成柱狀圖(圖1B)，發(fā)現(xiàn)MSLN陽性率平均占(63±18.6)%，MSLN陰性率平均占(37±18.6)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.389，P<0.001)。這說明在原發(fā)性卵巢癌組織中，MSLN表達(dá)量較高。免疫熒光染色法檢測SKOV3和OVCAR3兩種卵巢癌細(xì)胞系上MSLN的表達(dá)情況，使用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)(圖1C)，MSLN在SKOV3和OVCAR3兩種細(xì)胞系表面呈現(xiàn)高表達(dá)。

2.2 CAR-NK-92的制備及體外作用研究CAR結(jié)構(gòu)(圖2A)包含了Flag蛋白、anti-MSLN、CD8 hinge、跨膜域及細(xì)胞內(nèi)信號域CD137和CD3ζ序列，其中Flag蛋白作為標(biāo)簽蛋白用來鑒定CAR的表達(dá)效率。使用CAR慢病毒和GFP空載慢病毒分別轉(zhuǎn)染NK-92細(xì)胞，構(gòu)建CAR-NK-92 (CAR)和control-GFP。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Flag陽性的CAR-NK-92細(xì)胞占比70%左右(圖2B)，說明采用的CAR NK轉(zhuǎn)染體系可以達(dá)到較高的轉(zhuǎn)染效率，獲得純度較高的CAR-NK-92細(xì)胞。

體外殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CAR-NK-92、control-GFP與卵巢癌細(xì)胞SKOV3和OVCAR3按照不同的效靶比共培養(yǎng)時(shí)，CAR-NK-92細(xì)胞對靶細(xì)胞的裂解率明顯強(qiáng)于control-GFP細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(效靶比2 ∶1：t=16.52，P<0.001)(效靶比1 ∶1：t=32.06，P<0.001)(圖2C)，說明CAR-NK-92細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞起到較強(qiáng)的殺傷作用。

圖2 CAR-NK-92的構(gòu)建及體外作用分析A: MSLN-CAR結(jié)構(gòu)示意圖；B: 流式細(xì)胞術(shù)檢測CAR-NK-92細(xì)胞所占的百分比；C: CAR-NK-92細(xì)胞在效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例為2 ∶1和1 ∶1時(shí)對卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(n=3)；D: CAR-NK-92細(xì)胞與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)后上清液中IFN-γ、TNF-α的含量(n=3)；與Control-GFP組比較：*P<0.05，***P<0.001

細(xì)胞因子分泌結(jié)果顯示，CAR組分泌的IFN-γ平均值高于control-GFP組分泌的平均值，在靶細(xì)胞為SKOV3時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.318,P<0.05)。同樣，CAR組分泌的TNF-α平均值也高于control-GFP組分泌的平均值，在靶細(xì)胞為OVCAR3時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.6,P<0.05)(圖2D)，說明CAR NK細(xì)胞可以分泌更多的細(xì)胞因子來發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.3 CAR-NK-92的體內(nèi)抗腫瘤特性小鼠生物熒光成像結(jié)果顯示，與腫瘤組小鼠和NK-92組小鼠相比，CAR-NK-92組小鼠腫瘤生長較緩慢(圖3A)。同時(shí)對生物發(fā)光成像(bioluminescence imaging, BLI)的數(shù)值統(tǒng)計(jì)顯示，與NK-92組相比，CAR-NK-92組小鼠腫瘤生長速度較緩慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.547,P<0.001)(圖3B)，說明CAR-NK-92具有較好的抗腫瘤作用。對小鼠的體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示，在腫瘤注射的第21天后，腫瘤組小鼠和NK-92組小鼠出現(xiàn)了體質(zhì)量增長緩慢的趨勢，而CAR-NK-92組小鼠依然保持較穩(wěn)定的體質(zhì)量增長速度(圖3C)，說明CAR-NK-92有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，可以很好地維持小鼠的狀態(tài)。

圖3 小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CAR-NK-92對卵巢癌的作用A: 小鼠活體成像圖；B: 小鼠BLI數(shù)值統(tǒng)計(jì)圖(n=4)；與腫瘤組比較：*P<0.05；與NK-92組比較：###P<0.001 ；C: 小鼠體質(zhì)量變化圖(n=4)

3 討論

卵巢癌是一種惡性侵襲性腫瘤，致死率較高，因此探索新的卵巢癌治療策略具有重要的臨床意義[4]。MSLN作為一種膜表面蛋白，在卵巢癌中特異性高表達(dá)，因此可以成為卵巢癌免疫治療的理想靶點(diǎn)[5]。在本研究中，卵巢癌組織中都檢測出了MSLN陽性，而在正常卵巢組織中幾乎沒有MSLN的表達(dá)，同時(shí)在兩種卵巢癌細(xì)胞系上也檢測出了MSLN陽性，與之前的研究[6]一致。本研究以間皮素為靶點(diǎn)，使用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建了CAR-NK-92細(xì)胞，具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。其中，CAR結(jié)構(gòu)中包含的CD137和CD3ζ作為NK細(xì)胞上的重要分子，對激活NK細(xì)胞起著重要的作用[7]；同時(shí)高效率的轉(zhuǎn)染提高了CAR-NK-92細(xì)胞的純度，也進(jìn)一步提高了CAR-NK-92細(xì)胞的殺傷作用[8]。此外，在本研究中，CAR介導(dǎo)的殺傷作用伴隨著更高水平的IFN-γ和TNF-α的分泌，也進(jìn)一步證實(shí)了CAR能夠介導(dǎo)更強(qiáng)大的殺傷作用。而在荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)中，CAR組小鼠表現(xiàn)出了較緩慢的腫瘤生長速度，說明CAR-NK-92細(xì)胞在小鼠體內(nèi)能夠發(fā)揮較強(qiáng)的抗腫瘤作用。

NK細(xì)胞是一群先天毒性淋巴細(xì)胞，與T細(xì)胞相比具有較低的免疫原性。因此CAR NK被認(rèn)為更有希望應(yīng)用于腫瘤的臨床治療。當(dāng)前CAR NK研究中較常使用的NK細(xì)胞有外周血源NK細(xì)胞、臍帶血源NK細(xì)胞和NK細(xì)胞系。本研究選用NK-92細(xì)胞系作為研究對象，因?yàn)镹K-92細(xì)胞在體外IL-2刺激下，能夠大量擴(kuò)增，并且在表型特征上不會(huì)發(fā)生較大的改變[9]；與此同時(shí)，NK-92細(xì)胞容易受慢病毒轉(zhuǎn)染，可以得到高純度的CAR-NK-92細(xì)胞[8]。因此，CAR-NK-92細(xì)胞在腫瘤治療領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。當(dāng)前已經(jīng)有很多國家正在積極開展CAR-NK-92研究，并且已經(jīng)取得不錯(cuò)的治療效果[10]。但是NK-92細(xì)胞來源特殊，在體內(nèi)不能持續(xù)增殖，因而發(fā)揮的抗腫瘤作用有限[11]。為了解決CAR NK細(xì)胞在體內(nèi)不能持續(xù)增殖的問題，Teng et al[12]研究發(fā)現(xiàn)在CAR序列中添加編碼IL15序列可以顯著提高PSCA-CAR-NK細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的存活時(shí)間，這項(xiàng)研究為CAR NK細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用提供了新的研究思路。

在本研究中，MSLN-CAR-NK-92細(xì)胞表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗卵巢癌作用，可以為卵巢癌患者提供較好的治療策略。但本實(shí)驗(yàn)仍然存在不足之處，包括對小鼠生存期周期的觀察時(shí)間不足及缺少CAR-NK-92細(xì)胞在小鼠體內(nèi)存活時(shí)間的研究。因此在后續(xù)的研究中，將進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案，真正建立卵巢癌患者臨床可用的、安全有效的CAR NK細(xì)胞。