右美托咪定對鐵超載誘導的小鼠海馬神經元損傷的保護作用

丁 慧，王京燕，黃 艷，鐘薇薇，魯顯福，李元海,

鐵死亡[1]是依賴鐵的脂質過氧化物積累到毒性水平導致細胞死亡的非凋亡的程序性死亡，鐵是否過量是鐵死亡發生的關鍵[2]。腦中鐵沉積足以引發腦出血[3]，免疫組化檢測顯示腦內的鐵沉積隨年齡增加[4]。腦鐵水平過高會引起脂質氧化水平升高造成神經中毒[5]。mTOR(mammalian target of rapamycin)可以調節轉鐵蛋白受體1 (transferrin receptor1，TFR1)的穩定性，維持細胞內鐵的平衡狀態[6]。在腦出血疾病的發病機制中發現mTOR介導的鐵代謝的證據，缺失會引起鐵代謝紊亂，引起氧化應激，產生細胞毒性。

右美托咪定(dexmedetomidine, Dex)作為高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，能改善神經退行性疾病和腦外傷中的氧化應激水平的異常增高[7]。小鼠海馬神經元(hippocampal neurons, HT22)作為中樞神經執行認知功能的神經元易受到應激刺激—尤其是鐵離子刺激，誘發氧化應激引起鐵死亡，導致神經系統疾病的發生[8]。該研究擬探討Dex對鐵超載造成的HT22細胞損傷的保護作用及其機制，為麻醉藥物治療神經系統疾病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑小鼠海馬神經元細胞系、HT22專用完全培養基購自中國武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司；0.25%胰酶消化液購自Gibco公司；右美托咪定購自揚子江藥業(集團)有限公司；DHE熒光探針購自yeasen公司；丙二醛 (malondialdehyde，MDA)試劑盒購自碧云天生物技術研究所；Mito-FerroOrange亞鐵離子探針購自日本Dojindo分子技術有限公司；兔抗長鏈酯酰輔酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4)、兔抗TFR1、兔抗mTOR購自美國Abcam公司。兔抗p-mTOR、抗β-actin和抗前列腺素內過氧化物合酶2 (prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)抗體、山羊抗兔免疫球蛋白(IgG)辣根過氧化物酶(HRP)二抗購自中國武漢愛博泰克(Abclonal)生物科技有限公司。mTOR、TFR1、ACSL4、PTGS2 和 GAPDH 引物由中國安徽通用生物科技公司合成。

1.2 儀器熒光倒置顯微鏡(德國Zeiss公司)；Centrifuge 5424 R冷凍離心機(德國eppendorf公司)；Synergy2酶標儀(美國BioTek儀器公司)；Bioshine ChemiQ化學發光成像系統、CFX Connect 實時定量 PCR 儀(美國Bio-Rad公司)； Talos L120C G2透射電子顯微鏡(美國Thermoscientific公司)。

1.3 方法

1.3.1細胞分組 HT22細胞隨機分為4組：① 對照組(Ctrl組)：HT22細胞使用HT22細胞專用培養基進行培養；② FAC處理組(FAC組)：使用終濃度為125 μmol/L的FAC處理HT22細胞后培養24 h；③ Dex處理組(Dex組)：使用終濃度為5 μmol/L Dex預處理HT22細胞2 h后，使用終濃度為125 μmol/L FAC處理HT22細胞后培養24 h；④ 鐵死亡抑制劑Fer-1處理組(Fer-1組)：使用終濃度為1 μmol/L Fer-1預處理HT22細胞2 h后，使用終濃度為125 μmol/L FAC處理HT22細胞后培養24 h。

1.3.2CCK-8法檢測HT22細胞活力 選取對數生長期的HT22細胞，以1×104個/孔接種于96孔板上，培養12 h后，加入不同濃度Dex (0.2、1、5、25 μmol/L)，此外設置對照組(Ctrl組)和空白組(等量細胞培養基和CCK-8試劑)，每孔再設置4個復孔。置于細胞培養箱中孵育12 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑(每孔內加入100 μl培養基)，于培養箱中孵育2 h后使用酶標儀在450 nm處測量吸光度(absorbance, A)值，以此計算各孔的細胞相對存活率。相對存活率=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)，實驗重復3次。

1.3.3Western blot法檢測蛋白表達 HT22細胞以1×105個/孔接種于6孔板，培養12 h后，按照上述實驗分組方法加入藥物處理。制取樣品，經PBS沖洗2次，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解30 min，細胞刮刮下細胞，置于1.5 ml EP管中，12 000 r/min離心30 min。取上清液，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按1 ∶4體積混合，100 ℃煮沸10 min變性，使溫度降至室溫。以每孔10 μl的蛋白樣品量進行蛋白電泳，將蛋白轉至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，每次10 min。PTGS2、ACSL4、p-mTOR、mTOR、TFR1抗體按1 ∶1 000稀釋，置于4 ℃過夜后，使用TBST洗滌3次，每次10 min。加入1 ∶10 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，使用ECL發光試劑盒顯影。

1.3.4qPCR檢測PTGS2和ACSL4表達水平 HT22細胞以1×105個/孔接種于6孔板，培養12 h后，按照上述實驗分組方法加入藥物處理。制取樣品，加入RNA裂解液裂解30 min，吹下細胞轉至無酶EP管中，加入氯仿萃取，12 000 r/min離心30 min。取上清液加入等量異丙醇，置于-20 ℃助沉2 h。隨后12 000 r/min離心15 min得到RNA沉淀，洗滌干燥后定量，隨后加入Mix進行逆轉錄合成cDNA。根據儀器的操作說明，利用特異性引物對單個細胞樣本的cDNA進行qPCR擴增。以β-actin作為內參，比較分析各組mRNA的表達，見表1。采用最優稀釋和熔化曲線，以確保每一套引物擴增產物的特異性。所有表達式均使用2-ΔΔCt方法計算。數據分析使用qBase+ (Version 3.0, Bio Gazelle, Gent, Belgium)。

表1 引物序列

1.3.5MDA試劑盒測定脂質過氧化產物 將HT22細胞以1×105/孔接種在6孔板上，培養12 h后, 按照上述實驗分組方法加入藥物處理，置于37 ℃、5%CO2細胞孵育箱內孵育24 h，收集細胞至EP管中，1 200 r/min離心10 min，取上清液于冰上待測，吸取300 μl上清液于96孔板，使用酶標儀在532 nm處檢測細胞的吸光度，根據標準曲線計算MDA濃度。

1.3.6DHE免疫熒光染色檢測ROS生成 將HT22細胞以1×105/孔接種在6孔板上，培養12 h后，按照上述細胞分組方法加入藥物處理，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中孵育24 h后，使用PBS洗2次，將終濃度為10 μmol/L的DHE熒光染料加到PBS中，放入細胞培養箱中孵育30 min后用倒置熒光顯微鏡進行觀察并拍照。選擇Image J軟件進行熒光半定量分析，實驗重復3次，對結果進行統計學分析。

1.3.7Mito-FerroOrange熒光探針檢測細胞內Fe2+的變化 以1×105/孔接種在6孔板上，培養12 h后, 按照上述細胞分組方法加入藥物處理。使用DMSO將Mito-FerroOrange熒光探針溶解為1 μmol/L的儲存液，于6孔板上處理細胞，使用HBSS洗3次后，每孔加入儲存液使其終濃度為1 μmol/L，于培養箱孵育30 min后，置于共聚焦顯微鏡下觀察各組的熒光強度。

1.3.8電鏡檢測細胞超微結構的變化 將HT22細胞以1×106個/孔接種于培養瓶中，培養12 h至細胞匯集到80%～90%，按上述實驗分組方法處理后孵育24 h，提取電鏡樣品，細胞刮刮下細胞置于EP管中，1 500 r/min離心5 min，加入戊二醛固定液固定細胞沉淀。將標本置于電鏡下觀察各組線粒體嵴、線粒體膜密度及細胞核的變化。

1.3.9低表達mTOR 時TFR1蛋白水平變化 將HT22細胞隨機分為3組：① 對照組(Ctrl組)：HT22細胞使用HT22細胞專用培養基進行培養；② FAC處理組(FAC組)：使用終濃度為125 μmol/L FAC處理HT22細胞后培養24 h；③ FAC+AZD8055組：使用終濃度為125 μmol/L FAC和終濃度為80 nmol/L AZD8055處理HT22細胞后培養24 h。根據1.3.3項方法，使用Western blot檢測p-mTOR和TFR1的蛋白表達水平。

2 結果

2.1 Dex對FAC暴露下HT22細胞存活率的影響CCK-8實驗表明，0.2、1、5 μmol/L Dex對HT22細胞活力有促進作用，而25 μmol/L Dex作用不顯著(F=13.31,P<0.05)，見圖1A。FAC降低HT22細胞的活力，而1、5 μmol/L Dex預處理抑制了HT22細胞活力的降低(F=0.57,P<0.05) ，見圖1B。因此選取5 μmol/L Dex作為后續實驗劑量。

圖1 Dex對FAC暴露下HT22細胞存活率的影響A：CCK-8法檢測不同濃度Dex處理后細胞存活率；B：CCK-8法檢測Dex預處理細胞后加入FAC的細胞存活率；a：Ctrl組；b-e：0.2、1、5、25 μmol/L Dex組；f：FAC組；g：0.2 μmol/L Dex + FAC組；h： 1 μmol/L Dex+ FAC組；i：5 μmol/L Dex+ FAC組；j：25 μmol/L Dex+ FAC組；與Ctrl組比較：#P<0.05，##P<0.01；與FAC組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 Dex抑制FAC引起HT22細胞發生鐵死亡使用FAC處理HT22細胞24 h后，與Ctrl組相比，FAC組鐵死亡標志性蛋白PTGS2和ACSL4蛋白表達明顯升高，與FAC組比較，Dex組PTGS2和ACSL4蛋白表達下降，這一變化與Fer-1組一致(P<0.05)，見圖2A，且FAC組PTGS2和ACSL4的mRNA表達水平相比于Ctrl組也顯著增加，與FAC組比較，Dex組PTGS2和ACSL4的 mRNA表達水平下降，這一變化與Fer-1組一致(P<0.05)，見圖2B。

圖2 Dex抑制FAC引起HT22細胞發生鐵死亡A：Western blot法檢測HT22細胞PTGS2、ACSL4的表達；B：qPCR法檢測HT22細胞PTGS2、ACSL4的mRNA表達；a:Ctrl組；b：FAC組；c：Dex+FAC組；d：Fer-1+FAC組；與Ctrl組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001;與FAC組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 Dex降低HT22細胞內ROS水平細胞內ROS的水平增高會引起細胞發生氧化應激。DHE熒光探針染色可檢測細胞內ROS水平，使用125 μmol/L FAC處理HT22細胞24 h后，相較于Ctrl組，FAC組ROS水平升高(P<0.01)；使用Dex和Fer-1預處理2 h后，與FAC組比較，Dex組和Fer-1組ROS水平降低(F=35.90,P<0.05)，見圖3。

圖3 DHE熒光探針檢測HT22細胞中的ROS水平 ×400A:Ctrl組；B：FAC組；C：Dex組；D：Fer-1組；與Ctrl組比較：##P<0.01;與FAC組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4 Dex減輕細胞內脂質氧化水平使用125 μmol/L FAC處理HT22細胞24 h后，相較于Ctrl組，FAC組脂質氧化水平升高(P<0.001)；使用Dex預處理2 h后，與FAC組比較，Dex組脂質氧化水平降低(F=162.20,P<0.001)，見圖4。

圖4 MDA試劑盒檢測HT22細胞中脂質氧化程度A:Ctrl組；B：FAC組；C：Dex組；D：Fer-1組；與Ctrl組比較：###P<0.001;與FAC組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.5 Dex降低細胞內Fe2+含量Mito-FerroOrange熒光探針檢測Fe2+的變化，結果顯示，與Ctrl組相比，FAC組細胞內Fe2+濃度升高(P<0.001)，而Dex組與Fer-1組細胞內Fe2+濃度則顯著下降(P<0.001)，表明Dex抑制了FAC所引起的Fe2+濃度的增加(F=0.36,P<0.001)，見圖5。

圖5 Mito-FerroOrange Fe2+熒光探針檢測HT22細胞中的Fe2+含量 ×60A:Ctrl組；B：FAC組；C：Dex組；D：Fer-1組；與Ctrl組比較：###P<0.001;與FAC組比較：***P<0.001

2.6 Dex減輕細胞超微結構損傷使用透射電子顯微鏡觀察HT22細胞中的超微結構改變，與Ctrl組比較，FAC組線粒體損傷嚴重，膜密度增厚，線粒體嵴消失，Dex組和Fer-1組細胞內線粒體損傷程度減輕，見圖6。

圖6 電子顯微鏡下HT22細胞中線粒體及細胞核超微結構的變化情況 ×13 500A:Ctrl組；B：FAC組；C：Dex組；D：Fer-1組；箭頭：線粒體

2.7 Dex通過減輕鐵超載毒性抑制鐵死亡使用mTOR抑制劑AZD8055后，TFR1表達上調(F=73.03，P<0.05)，見圖7A；與Ctrl組比較，FAC組mTOR表達水平下調，TFR1及Fpn水平上調，鐵蛋白(Ferrtin)表達降低；與FAC組比較，Dex組mTOR表達水平升高，TFR1和Fpn表達水平減少，而Ferrtin表達活躍(P<0.05)，見圖7B。

圖7 Dex通過減輕鐵超載毒性抑制鐵死亡A：Western blot法檢測HT22細胞經AZD8055處理后p-mTOR、TFR1的表達；B：Western blot法檢測鐵代謝相關蛋白的表達；a:Ctrl組；b：FAC組；c：FAC+AZD8055組；d：Dex組；e：Fer-1組；與Ctrl組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001;與FAC組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

本研究根據文獻[9]和CCK-8法檢測結果確定了Dex是一種安全無毒的麻醉藥物，可以保護HT22細胞免受毒性損傷。采用FAC誘導HT22細胞，建立鐵超載模型。結果表明，與Ctrl組相比，FAC組Fe2+含量升高，提示鐵超載模型建立成功。本實驗采用5 μmol/L Dex預處理，發生鐵超載毒性的HT22細胞中Fe2+含量下降，提示Dex可以減輕鐵超載引起的HT22細胞損傷。

鐵死亡是迄今為止發現的一種相對較新的死亡方式，它與神經退行性疾病和腦缺血/出血性中風均有密切關系[10]，鐵代謝紊亂可以認為是鐵死亡的觸發階段[11]，影響細胞中ROS和脂質氧化的水平。HT22細胞分離自大腦海馬體，是鐵死亡高度敏感的細胞，目前廣泛應用于神經系統疾病的研究。FAC誘導的細胞外高鐵濃度，使HT22細胞受到鐵超載毒性攻擊。HT22細胞發生鐵超載后，會產生過量脂質氧化產物，加速細胞的損傷，引起氧化應激。細胞外高鐵能增加TFR1入口的鐵積累量，刺激TFR1通道打開，大量鐵流入細胞，細胞內Ferrtin可以調節細胞內鐵水平，對其進行貯存，維持細胞內鐵的穩態。一旦Ferrtin降解，鐵將變成游離態并促進Fenton反應發生，生成脂質過氧自由基(PUFA-OO·)，并最終形成脂質氫過氧化物(PUFA-OOH)，加速脂質積聚，最終導致鐵死亡[12]。PTGS2和ACSL4是已知的鐵死亡關鍵的標志性蛋白，參與上述脂質積累的過程，本研究結果顯示，與Ctrl組比較，FAC組HT22細胞PTGS2和ACSL4的蛋白和mRNA表達水平升高，ROS、脂質氧化水平和Fe2+水平表達升高，細胞內線粒體結構損壞程度加重，提示FAC可以促進鐵死亡的發生；且Dex能降低FAC引起的HT22細胞中PTGS2和ACSL4的蛋白和mRNA表達水平升高，減輕ROS、脂質氧化水平和Fe2+水平表達的升高，以及緩解細胞內線粒體結構損壞程度，提示Dex可能是通過抑制鐵死亡的方式保護HT22細胞。

mTOR通路失控通常表現在腦出血、神經退行性疾病和衰老等許多疾病中,因此靶向mTOR治療在近年來快速興起[13]， mTOR在鐵死亡的研究中越發受到重視，許多研究者認為mTOR介導的鐵代謝與腦出血之間存在聯系。mTOR作為調節鐵離子代謝的上游靶點已被證實[14]，mTOR-TFR1信號通路作為調節鐵離子代謝的關鍵通路，因此mTOR在鐵死亡的發生機制中具有重要作用。細胞高鐵濃度會使mTOR的表達受到抑制，導致細胞內鐵穩態失衡，引起氧化應激誘發鐵死亡[15]。本研究顯示，在HT22細胞鐵超載的模型中，使用mTOR抑制劑AZD8055處理，在mTOR表達量低的組別中下游TFR1蛋白表達水平升高，這表明在HT22細胞的鐵超載模型中存在該通路的調控；使用Dex處理后，由FAC誘導的mTOR蛋白表達上調，下游的TFR1蛋白表達被抑制，并且降低了FAC引起的HT22細胞中Ferrtin和Fpn——鐵相關的蛋白表達水平的上調。這說明Dex可能是通過調節鐵代謝的方式影響細胞存活，從而改善鐵超載引起的HT22細胞損傷。

本研究證實Dex可以抑制FAC誘導的HT22細胞發生鐵死亡，從而減輕HT22細胞的鐵超載毒性，其機制可能與激活mTOR-TFR1通路有關，自噬可能參與其中，但本研究尚未證實。本研究使用的Dex是商品針劑，對細胞實驗存在一定影響；其次，在細胞機制方面，本研究證實Dex對鐵超載引起的HT22細胞氧化應激損傷具有明確的保護作用，但尚未在原代神經元上驗證；在動物體內Dex對鐵超載引起的認知和記憶功能障礙是否具有保護作用是本課題組下一步的研究方向。

(致謝：本實驗在安徽醫科大學藥學院教育部抗炎免疫藥物重點實驗室完成，感謝各位老師和同學的幫助。)