臨床病理技術用于胸腔積液細胞塊中的臨床意義

張 羽

（遼陽市中心醫院病理科，遼寧 遼陽 111000）

胸腔積液主要由胸腔漿液重吸收功能或滲出功能障礙所引發，若胸腔漿液重吸收功能下降或滲出作用增強，均會導致漿液于胸腔內集聚，從而導致胸腔積液形成[1]。近年來，胸腔積液發病率逐漸升高[2]。目前臨床最常見的胸腔積液主要為肺部感染或惡性腫瘤所致。依據積液性質的不同，胸腔積液常被分為良性與惡性。良性胸腔積液通過常規胸腔抽水即可達到較好治療效果，患者預后較好；若胸腔積液為惡性則治療難度高，患者預后差[3]。因此臨床做好胸腔積液的早期檢查及鑒別診斷，對于改善患者預后具有重要臨床價值和社會意義。通常，典型胸腔積液的臨床特征明顯，診斷效率高，但對于早期積液量較少而無明顯癥狀，或積液位于肺底、葉間膜的積液及包裹性積液等位置不典型的情況，其臨床診斷較為復雜，為胸腔積液的診斷帶來了一定的困難。病理檢查是臨床診斷胸腔積液的常用方法[4]。常規細胞涂片法利用胸腔積液標本制備細胞涂片，置于顯微鏡下檢查，是臨床診斷胸腔積液的傳統病理診斷方法，但其無法清晰鑒別漿膜腔內的原發性間皮性腫瘤和已發生轉移的癌癥病變，對于胸腔積液診斷的敏感性較差（50%～78%）[5]。細胞塊免疫組化檢查法則利用胸腔積液制作細胞蠟塊，經染色處理后置于顯微鏡下確診。為確定上述2種臨床病理技術的價值，本研究針對65例胸腔積液患者進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇于2018年9月至2019年10月在遼陽市中心醫院病理科確診的65例胸腔積液患者為研究對象。其中男36例，女29例；年齡14～78歲，平均（41.73±12.69）歲。本研究符合《赫爾辛基宣言》。所有患者均知情同意并簽署知情同意書，本研究已獲得我院倫理委員會的批準。

1.2 納入與排除標準 納入標準：患者均經相關檢查確診為胸腔積液；獲得合格的胸腔積液作為待檢樣本；均接受病理診斷；了解研究內容，明確研究目的，且自愿簽署協議書。排除標準：合并全身免疫系統或血液系統疾病；聽說能力異常，無法正常溝通。

1.3 方法 所有胸腔積液患者均接受常規細胞涂片法診斷及細胞塊免疫組化法診斷。

1.3.1 常規細胞涂片法診斷 ①獲取胸腔積液標本。給予胸腔積液患者留置胸腔閉式引流管，留取適量胸腔積液，以備脫落細胞學檢查。②制片。于清潔容器內置入50 mL新鮮胸腔積液標本，將細胞采集器的濃縮器端軟管置于胸腔積液內，抽吸胸腔積液（待抽吸吃力或抽完時停止），沿順時針方向打開濃縮器，沿無截留物面朝上方向，將濃縮器內的膜片置于載玻片表面，反復拖動膜片，直至膜片表面的截留物停留于載玻片上。將涂片自然晾干，待邊緣稍干而中心處未干時，將其浸潤于95%乙醇溶液內固定，持續固定15 min后，利用HE自動染色機行HE染色。將染色后的涂片置于顯微鏡下，由2名擁有豐富閱片經驗的病理醫師閱片，判讀結果一致時，確診。

1.3.2 細胞塊免疫組化法進行診斷 ①獲取胸腔積液標本。流程與常規細胞涂片法一致。②標本預處理。將250 mL新鮮胸腔積液置于清潔容器內，于室溫下持續靜置0.5 h。③離心。棄標本上清液，取50 mL底層液體分別置于5個試管內，按照2 000 r/min的速度，將試管持續離心10 min。離心合格的標志為：試管經離心處理后，底層可見沉淀。如試管內的沉淀不足，可重復進行離心處理。④固定。棄上清液，吸出試管內沉淀物，移入潔凈玻璃瓶內。參照沉淀物體積向玻璃瓶內混入適量10%濃度的中性緩沖福爾馬林固定液（固定液:沉淀物=10∶1），以吸管輕輕吹打沉淀物，以促進沉淀物的固定。于室溫下靜置12 h。⑤脫水。棄上清液，將細胞沉渣置入擦鏡紙（事先折成漏斗狀），利用吸水紙吸出細胞沉渣間隙的殘留液體。將擦鏡紙折成閉合狀，置于70%濃度的乙醇溶液中，持續脫水12 h。以吸水紙吸干后，改用80%濃度乙醇脫水（時間為1 h）；再次以吸水紙吸干，置于95%濃度乙醇中脫水1 h；以吸水紙吸干，置于無水乙醇內最后進行1次脫水處理，吸干后即可完成細胞沉渣的脫水操作。⑥病理科染色前處理。選用LEICA EG 1150H型號石蠟包埋機進行石蠟包埋處理。將所制備的細胞蠟塊置于-24 ℃并向內持續冷凍10 min。利用切片機進行切片。⑦免疫組化染色。選用0.3%濃度的過氧化氫溶液持續孵育細胞切片10 min（溫度37 ℃），隨后采用PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。利用枸櫞酸鹽緩沖液針對細胞塊圖片進行高壓修復，噴氣后維持1.5 min，置于室溫下冷卻，以PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。采用羊血清工作液對高壓修復后的細胞切片進行封閉處理，持續封閉10 min（溫度37 ℃）。棄羊血清工作液，向細胞切片上滴加一抗，于4 ℃條件下孵育過夜。隨后采用PBS緩沖液進行沖洗（常規沖洗3次，每次5 min）。向細胞切片滴加生物素標記二抗，置于37 ℃條件下持續孵育15 min，以PBS緩沖液常規沖洗。向試管內滴加DAB溶液進行顯色處理，持續顯色2 min。采用蘇木精進行復染處理（時間為2 min），隨后以中性樹膠進行封閉、固定。⑧將染色后的細胞塊置于顯微鏡下觀察，結果的判讀參照常規細胞切片法標準完成。

1.4 觀察指標 觀察2種病理診斷方法下胸腔積液樣本中胞膜和胞質中癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、鈣結合蛋白（Ca-binding protein，CaBP）和細胞核中Wilm’s腫瘤細胞-1（Wilm's tumor cell-1，WT-1）表達情況，依此判定胸腔積液的陽性檢出率。陽性判定標準：①胞膜胞質中CEA和CK7呈現為棕黃色，CaBP顯示出黃色。②細胞膜中CaBP顯示出黃色。③細胞核中WT-1染色為棕黃色，CaBP顯示出黃色。④所有間皮細胞或腺癌細胞的陽性細胞數占比＞10%[6]。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料采用（）表示，組間比較行t檢驗；計數資料采用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鏡檢結果 常規細胞涂片法的鏡檢結果顯示：部分細胞涂片可清晰顯示細胞結構，但仍存在部分細胞涂片厚度不均、涂片染色背景濃厚、局部細胞重疊、透明度偏低、細胞結構不清等問題。細胞塊免疫組化檢查法的鏡檢結果顯示：細胞結構清晰，細胞核與胞質染色對比突出，透明度較高，細胞厚度分布均勻，且染色背景清晰，細胞切片中保持部分組織學形態特征。

2.2 診斷結果 常規細胞涂片法診斷胸腔積液的準確率明顯低于細胞塊免疫組化檢查法（P＜0.05）。

表1 不同方法的診斷結果比較[n（%）]

3 討 論

胸腔是胸腔壁層和臟層之間的間隙，在正常狀態下，胸腔中會有5～15 mL胸膜液發揮潤滑呼吸運動的作用。人體正常代謝所產生的500～1 000 mL的胸腔漿液會被吸收。若胸腔發生病理變化，導致胸膜部位毛細血管中靜水壓和胸膜通透性異常增大，毛細血管中交替滲透壓驟降、壁層胸膜淋巴液正常回流出現障礙等發生，致使胸腔內漿液的吸收功能下降，滲出作用增強，從而形成胸腔積液[7-8]。目前，胸腔積液已被證實為肺癌的常見合并癥[9]。既往臨床經驗證實，多數胸腔積液患者的預后良好，但惡性胸腔積液患者則容易出現不良預后。50%～80%的以肺癌為病因的胸腔積液患者為惡性胸腔積液[10]。因此，判斷胸腔積液良惡性在臨床治療和預后改善方面具有重要的意義。

常用的胸腔積液檢查方法包括影像學檢查、經皮胸膜穿刺活檢[11]、胸腔穿刺抽液檢查和病理學檢查等。其中胸部X線片和CT等影像學檢查方法可用于判斷胸腔積液（積液容量200 mL左右時影像學檢查肋膈角變鈍）[12]；胸部超聲科顯示胸膜壁層和臟層間為無回聲區[13]；胸腔穿刺抽液可用于胸腔積液中細胞數目定量和黏蛋白定性分析及治療效果的評價方面[14]；病理診斷是臨床診斷胸腔積液的主要方法，在未完全明確胸腔積液起病原因的情況下，對患者實施病理檢查，有助于診斷疾病[15]。臨床醫師應選擇適宜的鑒別診斷技術對胸腔積液病情進行診斷，以明確病情，為后續治療方案確定提供科學依據。胸腔積液患者診斷的困難性在于：當胸腔積液患者的積液量≤0.5 L時，通常無明顯癥狀；而當積液量超出0.5 L標準時，可產生呼吸困難、心悸等表現。上述特征限制了常規癥狀評估、體格檢查在胸腔積液診斷中的應用。

常規細胞涂片法的應用原理為：從胸腔積液患者的胸腔積液標本中獲取脫落細胞，制作細胞涂片，置于顯微鏡下，觀察細胞大小及形態，以確定診斷結果[16]。這種檢查方法的制片操作較為簡單，整個過程的耗時較短，且對胸腔積液患者產生的損傷較小。細胞塊免疫組化檢查法作為一種新型病理技術，主要通過采集患者的漿膜腔積液、離心處理獲得細胞沉淀物、固定、脫水、切片、染色處理后，置于顯微鏡下觀察，判定診斷結果[17]。

在胸腔積液診斷中，細胞塊免疫組化法檢查的應用優勢體現為：①制片質量高。采用常規細胞涂片法制片，將細胞涂片置于顯微鏡下檢查，容易發現細胞重疊、細胞染色背景濃厚、厚度不均及透明度低下等問題[18]。而相比之下，細胞塊免疫組化檢查法則可有效改善制片質量。本研究證實：采用細胞塊免疫組價病理檢查法制片，胸腔積液患者的細胞制片染色背景清晰，細胞厚度均勻，細胞結構清晰，組織學形態特征保持良好。這一優勢為這種病理技術的普及應用奠定了良好的基礎。②可長期保存。經常規細胞涂片法制片，所得細胞涂片需于較短時間內進行鏡下檢查，隨著細胞涂片留置時間的延長，涂片中的細胞結構、數量均可能出現變化，進而影響鏡檢結果的可靠性。而細胞塊免疫組化檢查法則直接將胸腔積液中的細胞利用脫水、固定等處理技術，制成細胞蠟塊。相對于細胞涂片而言，細胞塊標本的穩定性較強，可長期保存。當需要進行病理檢查時，可隨時切片，而無須擔憂細胞標本質量受損。細胞塊免疫組化檢查法的這一優勢，可為胸腔積液患者的臨床病理診斷工作帶來諸多便捷。③診斷結果可靠。診斷結果的準確性是評估臨床病理技術價值的主要因素。本研究結果提示，細胞塊免疫組化檢查法的診斷準確率高于常規細胞涂片法（P＜0.05）。分析形成上述差異的原因可能為：經常規細胞涂片法制備的細胞標本質量欠佳，如涂片中的腫瘤細胞缺乏典型性，可能會被誤診為間皮細胞，進而影響診斷結果的準確性；采用常規細胞涂片法診斷胸腔積液時，細胞涂片標本可能受到多種因素的影響。當細胞涂片中存在炎性細胞或受到細胞退變因素影響時，機體間皮細胞容易受上述影響而出現形態改變，增加誤診風險（將正常間皮細胞誤診為腫瘤細胞）。而組織塊免疫組化檢查法則針對常規細胞涂片法的不足加以改進，該方法將胸腔積液患者的積液離心細胞沉淀物制備成石蠟細胞塊，利用固態細胞塊進行切片，可確保細胞結構的清晰度，且保留部分組織形態學特征，進而保障胸腔積液診斷結果的準確性。④耗材少。采用細胞塊免疫組化法進行診斷時，整個診斷流程僅消耗少量甲醛緩沖液、枸緣酸緩沖液、羊血清工作液及石蠟等材料，檢查過程中的耗材較少，成本相對較低。對于胸腔積液患者而言，這一優勢決定著胸腔積液患者對細胞塊免疫組化檢查法的接受度較高，采用該方法進行診斷，不易增加患者的經濟負擔。

雖然細胞塊免疫組化法較常規細胞涂片法具備較多優勢，但采用該方法診斷胸腔積液時，仍然可能會面臨一定的漏診、誤診問題。分析經細胞塊免疫組化法診斷胸腔積液漏診、誤診的原因可能為：①細胞遺失。在按照細胞塊免疫組化檢查法流程進行轉移細胞沉淀物、固定、脫水等常規處理時，可能有部分細胞遺失，進而影響最終診斷結果的準確性。②細胞缺乏異型性。部分細胞缺乏異型性，容易被誤診為間皮細胞。③細胞含量不足。以胸腔閉式引流法采集胸腔積液患者的積液時，部分患者的胸腔積液呈透明狀，內部細胞含量較少，容易增加誤診、漏診風險。

在采用細胞塊免疫組化法診斷胸腔積液時，為確保這種病理技術作用的充分發揮，需加強對以下問題的重視：①固定時間控制。在細胞塊免疫組化檢查中，細胞沉淀物的固定時間是影響最終診斷結果的關鍵所在。采用固定液（甲醛緩沖液）進行固定時，如固定時間過長，容易造成蛋白、細胞的過度吸收，引發細胞形態改變，進而影響診斷結果的準確性；如果固定時間不足，則容易導致固定不充分，也可能干擾診斷結果的準確性。對此，在利用這種病理技術進行診斷時，需注意將胸腔積液患者的細胞沉淀物固定時間控制于12 h左右，以確保固定時間的合理性。②離心處理。結合細胞塊免疫組化檢查法的應用經驗來看，不同類型胸腔積液患者的細胞塊制作成功率存在一定差異。相對于胸腔積液呈透明狀的患者而言，胸腔積液較為渾濁者或血性胸腔積液患者的細胞塊制作成功率較高。為保障細胞塊免疫組化檢查過程的效率，可于前期胸腔積液采集、離心處理環節，預先采集多份胸腔積液標本，并針對多份標本進行離心處理，以確保胸腔積液透明者可成功制作細胞蠟塊[19]。

綜上所述，胸腔積液診斷中宜推行細胞塊免疫組化法檢查，以保障鏡檢下細胞質量，并保障診斷結果的準確性。