肺動脈高壓致病基因和靶向治療研究進展

王蔚，鐘子晴，荀秋芬，祝國風，楊青

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一組以毛細血管前PH為特點的疾病，其致殘率和病死率均較高。從家族性PH基因研究到高通量組學技術，越來越多的致病基因和突變基因被發現，使研究者對PAH突變基因及發病機制的了解更加深入，也為尋找新的藥物靶點提供了科學依據。本文主要綜述了PAH致病基因和靶向治療研究進展，以期為PAH的分子機制探索和個體化治療提供思路。

1 PAH的分類和致病基因

在臨床上，PAH可分為7個亞型，包括特發性肺動脈高壓（idiopathic pulmonary hypertension，IPH）、遺傳性肺動脈高壓（heritable pulmonary hypertension，HPH）、藥物和毒物相關性PH、疾病相關的PH、對鈣通道阻滯劑長期有效的PH、具有明顯肺靜脈/肺毛細血管受累的PH〔遺傳性肺毛細血管瘤?。╬ulmonary capillary hemangiomatosis，PCH）和肺靜脈閉塞?。╬ulmonary veno-occlusive disease，PVOD）〕和新生兒持續性PH［1］。目前，通過測序技術發現了16個PH的致病基因［2-19］（見表1），這些致病基因功能異?？梢鸩煌腜H表型。

表1 PH的致病基因Table 1 Pathogenic genes of PH

2 與IPH和HPH相關的突變基因

2.1 轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路致病基因

2.1.1 骨形成蛋白受體2（bone morphogenetic protein receptor type 2，BMPR2） 2000年，研究者發現了PH的首個致病基因——BMPR2，其是TGF-β超家族成員，是PH（特別是IPH和HPH）的主要發病基因［20］。

2.1.1.1 BMPR2的結構及突變類型 BMPR2可編碼TGF-β家族Ⅱ型受體，在肺動脈內皮細胞（pulmonary arterial endothelial cells，PAECs）上呈高表達。目前，在MalaCards數據庫（https://www.malacards.org/），研究者從800多例PH患者中檢測到486個不同位點的非重復性突變基因，這些突變位點廣泛分布于外顯子中，且大多數位于關鍵功能區，其中25.3%是由氨基酸替換產生的錯義突變、27.4%是無義突變、22.6%是小核苷酸插入或缺失引起的移碼突變、13.9%是拷貝數突變、10.0%是剪切位點突變［2-3，21］。

2.1.1.2 BMPR2功能 BMPR2蛋白可通過TGF-β信號通路對疾病產生作用，而TGF-β信號通路主要有兩條傳導路徑：（1）TGF-β在細胞膜上與其受體結合形成復合物，誘導Ⅱ型受體磷酸化Ⅰ型受體ALK4、ALK5、ALK7蛋白，進而活化下游Smad2、Smad3蛋白；（2）骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）與其Ⅱ型受體BMRP2等結合后，Ⅱ型受體可磷酸化Ⅰ型受體ALK1、ALK2、ALK3、ALK6蛋白，進而激活下游Smad1、Smad5、Smad8蛋白。Smad蛋白是一種轉錄因子，在信號傳導過程中其一旦被磷酸化，則Smad2、Smad3或Smad1、Smad5、Smad8會與Smad4形成復合物并轉移到細胞核中，進而調節下游靶基因表達［22］。TGF-β和BMPR2受體基因突變破壞了TGF-β信號傳導通路，最終導致TGF-β信號增強、BMPR2信號減弱，肺動脈增殖。

2.1.1.3 BMPR2突變的臨床表型 BMPR2突變導致了70%～80%的HPH和10%～40%的IPH，患者主要表現為心臟指數偏低、肺血管阻力升高、平均肺動脈壓升高及靜脈血氧飽和度降低，患者對急性肺血管擴張試驗的反應性差，疾病診斷及死亡的年齡更??；其中男性PH患者BMPR2突變率、死亡風險更高［23］，而BMPR2突變的女性PH患者較無BMPR2突變的女性PH患者疾病診斷年齡更小，且錯義突變患者較截斷突變患者病情更嚴重［24］。

BMPR2突變的平均外顯率僅為20%左右，且常見的p.S775N突變與PH發病無明顯相關性，提示一些攜帶突變基因的個體并不會發病［10］。目前研究認為，環境及修飾基因對疾病外顯可能具有重要作用，PH患者淋巴細胞中野生型BMPR2表達水平明顯低于未發病的BMPR2突變攜帶者，進而影響BMP通路，故野生型BMPR2作為修飾因素可能影響致病基因的外顯［25］。

除了基因外顯率低之外，“二次打擊”理論（即帶有附加修飾基因的致病基因）被認為參與了PH的發病。1例攜帶BMPR2突變的PH患者，約20%的PAECs有13號染色體缺失，這段缺失的染色體包含BMP通路的下游基因Smad9，進而造成其編碼的Smad8蛋白表達缺失，反過來Smad8蛋白表達缺失又使BMP信號通路功能進一步受損，即“二次打擊”［26］。

2.1.2 其他致病基因 除BMPR2外，TGF-β信號通路對肺動脈平滑肌細胞增殖、細胞外基質合成和分化也具有重要作用［27］。

2.1.2.1 Smad家族 2011年，有研究者對324例散發性PH患者進行基因測序，發現Smad家族的Smad1、Smad4、Smad9發生了由氨基酸替換產生的突變［16］，其中有兩種錯義突變在體外表現出信號傳導活性降低。Smad4中一個剪切位點突變導致了因剪切效率降低而產生的轉錄丟失。DRAKE等［17］研究發現，Smad9雜合性缺失可明顯影響Smad的轉錄活性。

2.1.2.2 BMP9突變 BMP9編碼的生長分化因子2（growth differentiation factor 2，GDF2）是PAECs BMPR2/ACVRL1受體復合物的主要循環配體，而該受體信號傳導對內皮分化和血管形態發生至關重要。有研究者對一組歐洲PH家系進行全基因組測序發現，BMP9基因雜合突變包括1個移碼突變和7個錯義突變［11］；對一個中東PH家系進行全基因組測序發現了BMP9的新雙等位基因突變（p.P85L和p.D218N），其與BMPR2（p.S775N）聯合突變產生了該家族唯一發病表型［10］；該測序結果同時驗證了BMPR2基因的“二次打擊”理論。一項采用基因面板的前瞻性研究發現，1.2%的成年PH患者存在BMP9突變［28］。一項針對中國331例PH患者全外顯子組測序研究發現，6.7%的患者伴有BMP9突變［29］。上述研究初步表明，BMP功能缺失突變在PH發病中具有一定作用。

2.1.3 ACVRL1和ENG 對遺傳性出血性毛細血管擴張癥（hereditary hemorrhagic telangiectasia，HHT）家系合并PH患者進行基因組測序發現了ACVRL1和ENG致病突變，且絕大多數ACVRL1突變屬于錯義突變，其中約89%的突變位點位于重要的催化結構域［30］。ACVRL1突變后機體ALK1蛋白表達減少，進而影響功能激酶結構域，抑制PAECs中的Smad1、Smad5、Smad8通路活性，同時刺激ALK5活性及增加下游Smad2、Smad3信號通路，導致BMPR2信號減弱、TGF-β信號增強，最終促進細胞增殖和遷移。研究表明，ACVRL1突變攜帶者較無ACVRL1突變攜帶者和BMPR2突變攜帶者PH發病年齡更?。?］，且部分PH患者診斷早于HHT的臨床表現。雖然ACVRL1突變攜帶者在診斷時未出現明顯的血流動力學改變，但其對急性血管擴張試驗無反應，且疾病進展快、預后更差［31］。

ENG主要在PAECs上表達，其可作為共受體來穩定配體-受體復合物，并保證受體信號的正確傳導。有研究者對一組ENG突變的PH患者進行基因組測序，發現16例患者有8個致病突變基因，最常見的是p.G191D突變；其中5例患者同時攜帶BMPR2、ACVRL1突變［13］。研究表明，ENG剪切位點突變導致單倍體功能不足，使受體信號傳導障礙、血管生成失調、血管畸形及PAECs異常增殖［32］；臨床上ENG突變攜帶者平均PH診斷年齡較無ENG突變者小8歲［13］。

2.2 鉀通道相關致病基因

2.2.1 KCNA5 KCNA5編碼的Kv1.5是電壓門控鉀通道成員之一，其支持心房特異性鉀電流。PH患者存在KCNA5突變，KCNA5和BMPR2雙基因突變可引起肺動脈收縮和嚴重的早發PH表型。

2.2.2 KCNK3 KCNK3是編碼鉀通道蛋白超家族成員之一。2013年，研究者通過測序發現KCNK3的6種雜合子錯義突變（G203D、G97R、V221L、T8K、E182K和Y192C），且均為致病突變［33］。2017年，有研究者在日本PH患者中發現了雜合子錯義突變（p.G203D）［34］、在西班牙PHA患者中發現了純合子突變（p.G106R和p.L214R）［35］。上述研究證實了KCNK3在PHA發病中的作用，KCNK3功能和表達缺失是PH患者右心室肥大和功能障礙的標志。研究表明，攜帶KCNK3純合子突變的PH患者，發病年齡更小、病情更嚴重；但KCNK3突變為不完全顯性遺傳，且純合子突變患者臨床癥狀更嚴重［35］。

2.2.3 ABCC8 ABCC8可編碼ATP敏感性鉀通道調節亞基蛋白。對未發現BMPR2和ACVRL1突變的兒童和成年PH患者進行篩查，發現了ABCC8的一個新的有害錯義突變（p.R958H），該突變位于編碼蛋白的一個關鍵結構域的高度保守區，且ABCC8突變分別與IPH、HPH或冠心病-PH患者相關，提示該基因在PH各亞型中無特異性分布［15］。

3 與PCH和PVOD相關的致病基因

2014年，研究者在遺傳性和散發性PCH［36］、PVOD［37］患者中均發現了EIF2AK4致病突變，其是編碼磷酸化真核生物翻譯起始因子2的α亞單位激酶。PCH和PVOD是PH的少見類型，均為常染色體隱性遺傳。目前指南推薦，檢測出EIF2AK4雙等位基因突變就可以對遺傳性PVOD/PCH進行診斷，不需要進行肺活檢［38］。有研究者對1個HPH家系進行二代測序發現，家族成員均攜帶兩種致病雜合子突變：BMPR2移碼突變和EIF2AK4剪切位點新突變，且同時發生兩種基因突變的家族成員才發?。?9］。上述研究結果不僅支持“二次打擊”理論，還提示對已知攜帶基因突變的家族成員，有必要進行PH的基因測序。

研究表明，EIF2AK4突變患者比無EIF2AK4突變患者的診斷年齡小、生存率低［5］。分析EIF2AK4突變患者治療困難的原因是其對現有前列環素衍生物、內皮素受體拮抗劑和磷酸二酯酶5型抑制劑無良好的治療反應，且易出現肺水腫。但藥物治療也存在有效案例，如1例散發性EIF2AK4突變的PVOD患者，經前列環素類似物治療后其急性加重次數減少、體力改善、肺動脈高壓得到控制［40］。此外，在IPH或HPH患者中，攜帶EIF2AK4雙等位基因突變者平均發病年齡＜50歲、一氧化碳彌散量＜50%［4］，提示攜帶EIF2AK4雙等位基因突變的PH患者發病年齡小、肺彌散功能差。

4 與兒童PH相關的突變基因

研究表明，在兒童PH中發現的突變基因包括BMPR2、ACVRL1、ABCA3、NOTCH3、KCNK3、HTR2B、ENG和EIF2AK4，且基因突變攜帶者肺血管阻力指數較高，對血管擴張劑反應很差，1、2、3年生存率分別為86.6%、63.8%、52.2%［41］。近年來通過測序發現了更多與兒童PH相關的致病基因。

4.1 CAV1 CAV1可編碼小窩蛋白1，在內皮細胞中呈高表達，是形成胞膜穴狀內陷的結構蛋白。CAV1對BMP受體的物理結構起作用，能調節PAECs的功能和滲透性，其表達缺失會減弱BMPR2的膜定位和信號傳導［42］。在PH患者肺動脈組織中，CAV1蛋白表達降低反映了肺血管內皮細胞增殖和抗凋亡表型。

4.2 TBX4 TBX4缺失和突變與小髕骨綜合征相關［7］，通?？蓪е掳被崽鎿Q或轉錄過程過早截斷。TBX4雜合子突變功能缺失是幼年早發PH最常見的遺傳因素，可伴或不伴小髕骨綜合征［43］。

5 其他致病基因

2018年，有研究者對先天性心臟病相關PH患者進行基因組測序，發現了SOX17 p.Y137基因突變引起編碼蛋白截短的現象，提示SOX17是一個新的候選易感基因［44］。SOX17基因高度保守，是在發育過程中參與Wnt/β-catenin和Notch信號通路的轉錄因子，可調節細胞類型和組織分化，與β-catenin結合后可激活靶基因轉錄。多數SOX17突變是通過使結合結構域缺失或阻止蛋白相互作用來影響β-catenin功能的。

2018年，有研究者對歐洲IPH、HPH和厭食藥物相關PH患者進行基因測序發現，除了BMPR2（15.3%）、TBX4（1.3%）、ACVRL1（0.9%）、SOX17（0.9%）、ENG（0.6%）、SMAD9（0.4%）和KCNK3（0.4%）外，還發現了新的突變基因——AQP1（0.9%）和ATP13A3（1.1%）。其中AQP1可編碼質膜水通道蛋白1，維持血管張力。家系研究發現，在5例HPH患者中發現了AQP1錯義突變，即p.R195W和p.V176E［11］。動物實驗發現，AQP1基因缺失小鼠內皮細胞遷移和血管生成受損，而應用AQP1抑制劑可減輕缺氧誘導的AQP1表達上調，并通過降低右心室壓力、減緩右心室肥厚而逆轉肺血管壓力升高［45］。ATP13A3是ATP酶家族中的一員，能跨膜轉運多種陽離子，在大血管細胞類型中呈高表達［11］。ATP13A3的3個雜合子移碼突變會導致ATP酶催化活性喪失，其他雜合子錯義突變則會破壞催化結構域的構象，對蛋白功能產生嚴重影響。研究表明，敲除ATP13A3基因后，內皮細胞增殖減少、凋亡增加［11］。內皮功能障礙介導的抗凋亡細胞不斷增殖及其導致的疾病關鍵部位增殖細胞明顯增多，是PH的始動因素［46］。因此，ATP13A3的促細胞增殖作用可能是引起PH的內在關聯因素。

6 基于致病基因的靶向治療

PH患者的異常BMP信號和表觀遺傳可部分通過誘導Warburg線粒體的非耦合糖酵解代謝，進而為異常細胞提供能量、促進細胞增殖［47］。小分子PDK抑制劑二氯乙酸是針對上述代謝途徑的新療法，其能逆轉PASMCs和右心室心肌細胞的Warburg表型。一項Ⅳ期IPH臨床研究顯示，二氯乙酸能降低IPH患者mPAP和右心室收縮壓，延長其6 min步行距離；但攜帶SIRT3和UCP2基因功能變異的IPH患者對二氯乙酸治療無應答［48］。

與BMPR2相關的靶向治療包括補救突變基因功能或通過非突變等位基因產生功能性受體，以增強BMPR2信號傳導。補救策略包括使用通讀化合物，如Ataluren（PTC-124），其可促進終止密碼子通讀提前，并從突變等位基因中產生功能性全長BMPR2蛋白［49］。使用化學伴侶也可以補救錯義突變，如4-苯基丁酸鹽可同時增加錯誤折疊和促進功能性BMPR2蛋白從細胞內質網轉運到細胞表面。其他靶向治療方法正在開展臨床前試驗，其一是增強非突變BMPR2蛋白信號：傳遞重組配體BMP9或使用BMP小分子激動劑FK506，增強BMPR2介導的內皮細胞信號傳導，進而逆轉PH模型；其二是通過溶酶體抑制劑（如羥氯喹）抑制BMPR2降解，進而預防PH進展。研究表明，靶向敲除小鼠PASMCs上的LRP1基因可使TGF-β信號增強（去抑制），進而誘導PH發生和肺動脈遠端肌化；過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）γ激動劑吡格列酮能抑制人PASMCs的TGF-β1-CTGF通路激活，抑制PASMCs增殖，進而改善LRP1缺失引起的PH［50］。

7 PH的遺傳檢測和全球策略

目前，美國和歐洲均在進行大規模的基因學研究。美國國家生物樣本數據庫（https://www.pahbiobank.org）建立了3 000多例PH患者的生物樣本遺傳數據，包括靶向DNA測序、全外顯子組和全基因組測序等。美國肺血管疾病表型組學計劃旨在將PH臨床表型與多個“omics”分析結合起來，并在傳統PH分類基礎上定義新的分子分類。英國BRIDGE項目（https://bridgestudy.medschl.cam.ac.UK/PAH.shtml）已經將PH列為罕見病，目前已對1 250多例歐洲IPH/HPH患者進行潛在遺傳突變分析。目前，臨床上遺傳檢測發現的PH相關基因有BMPR2、ACVRL1、ENG、SMAD4、SMAD9、CAV1、KCNK5、KCNK3、BMP9和NOTCH3。遺傳檢測適用人群包括HPH、IPH、厭食藥相關性PH、PVOD/PCH和兒童PH患者［51］；需同時對PH患者的親屬進行遺傳咨詢和遺傳檢測，對有風險的家庭成員應每3年進行1次教育和隨訪，以便早期診斷和治療PH。

8 小結

PH患者存在多基因突變、遺傳異質性和不完全外顯性等特點，導致其基因學表現復雜，除了目前已知的致病基因突變外，可能還有其他罕見基因突變，同時PH的遺傳和環境修飾也有待鑒定。此外，兒童和成人PH相關致病基因可能有所不同。未來，隨著基因學及基因組學研究不斷深入，PH的表型和靶向治療研究將迎來新的突破。

作者貢獻：王蔚進行文章的構思與設計，文章的可行性分析，撰寫、修訂論文；鐘子晴、荀秋芬、祝國風進行文獻/資料收集、整理；楊青負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。