雷公藤甲素通過CXCL10/CXCR3軸對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥的影響研究

任強，鄧俊，張沄，周進，王宋平

支氣管哮喘（以下簡稱為哮喘）是由多種炎癥細胞（嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等）和細胞因子〔白介素（interleukin，IL）等〕參與的氣道慢性炎癥性疾?。?］。抑制氣道炎癥細胞的浸潤及細胞因子的表達是改善氣道炎癥、提高哮喘控制水平的主要措施，糖皮質激素是目前控制哮喘的主要抗炎藥，但對于激素抵抗的哮喘患者則不能獲得良好的控制效果，且長期使用糖皮質激素也可能產生骨質疏松、血糖升高等不良反應［2］。因此，尋找哮喘新的治療方法仍然是目前亟待研究的課題。

近年來，研究發現，CXCL10/CXCR3軸可趨化免疫細胞至相應部位，進而參與組織炎癥、自身免疫性疾病、血管形成等病理生理過程［3］。WU等［4］研究發現，抑制CXCL10/CXCR3軸可以減少嗜酸粒細胞、中性粒細胞以及細胞因子等在胸膜組織的表達。研究發現，雷公藤甲素具有廣譜的抗炎和免疫調節作用，在改善哮喘患者臨床癥狀方面具有良好的效果［5］。王立新等［6］研究表明，雷公藤甲素可以減少類風濕性關節炎患者體內CXCL10/CXCR3的表達。然而，雷公藤甲素能否通過調節CXCL10/CXCR3軸減輕哮喘的氣道炎癥尚缺乏深入研究。本研究通過構建哮喘小鼠模型，探討雷公藤甲素通過調節CXCL10/CXCR3軸對哮喘小鼠氣道炎癥的影響及相關機制，以期為臨床使用雷公藤甲素治療哮喘提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2020年7—12月選取36只雌性SPF級BALB/c小鼠，周齡6～8周，體質量18～24 g，在符合SPF級實驗動物飼養標準的動物房中飼養，所用飼料及純凈水不含致敏原。動物實驗遵循西南醫科大學醫學實驗室動物護理和使用委員會以及動物研究倫理委員會要求。

1.2 主要試劑與儀器 卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）購自美國Sigma公司，氫氧化鋁粉劑購自成都科隆化學品有限公司，雷公藤甲素購自四川維克奇生物科技有限公司，無水乙醇購自瀘州北方化學工業有限公司，超聲霧化器購自東莞市健寶電子科技有限公司，IL-4、IL-10、IL-17抗體試劑盒購自科鹿（武漢）生物科技有限責任公司，CXCL10和CXCR3試劑盒購自ASPEN公司。

1.3 哮喘小鼠模型的制備［7］采用簡單隨機法將36只小鼠均分為對照組、哮喘模型組和雷公藤甲素組，每組12只。哮喘模型組和雷公藤甲素組小鼠在第1、8、15天腹腔注射0.2 ml OVA+氫氧化鋁混懸液致敏，小鼠出現呼吸急促、打噴嚏、精神萎靡提示造模成功。對照組小鼠在第1、8、15天腹腔注射0.2 ml 0.9%氯化鈉溶液。第22～35天將三組小鼠分別置于封閉紙箱中，哮喘模型組和雷公藤甲素組用10 ml OVA液霧化，激發30 min，每隔2 min晃動紙箱以防止小鼠成堆聚集干擾霧化效果；對照組予以等量0.9%氯化鈉溶液霧化。每次霧化前1 h，雷公藤甲素組腹腔注射0.2 ml雷公藤甲素（40 μg/kg），哮喘模型組和對照組則腹腔注射0.2 ml 0.9%氯化鈉溶液。

1.4 觀察指標

1.4.1 小鼠行為學表現 干預后觀察三組小鼠精神狀態、呼吸頻率、體質量變化、進食飲水等行為學表現。

1.4.2 支氣管肺組織形態學變化 三組小鼠最后一次霧化后24 h內采用頸椎脫臼法處死小鼠，取三組小鼠適量左肺組織，采用4%多聚甲醛溶液固定，之后采用液體石蠟浸潤肺組織并制作厚度為5 μm的病理切片，將脫蠟、脫水、干燥后的肺組織切片采用蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光鏡下觀察支氣管及其周圍組織的病理改變。采用過碘酸-雪夫（periodic acid-schiffstain，PAS）染色，光鏡下觀察氣道上皮杯狀細胞及黏液分泌的變化，并采用Image J灰度分析計算PAS染色陽性的杯狀細胞占比。

1.4.3 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）檢查 三組小鼠被處死后，打開胸腔結扎左主支氣管，用1 ml空針針尖插入右主支氣管內，采用0.4 ml PBS液灌洗，反復注入和抽吸3次，然后回收BALF。取出BALF在離心機上于4 ℃以1 500 r/min離心10 min（離心半徑198 mm），取細胞沉淀制作細胞重懸液，吸取重懸液計數細胞數量，在載玻片上，使用吉姆薩染色后立即封固，沖洗、干燥后在400倍顯微鏡下觀察炎癥細胞，分別計數各類炎癥細胞數量。取BALF離心后的上清液，采用ELISA測定上清液中IL-4、IL-10、IL-17。操作步驟按試劑盒說明書進行，在450 nm波長處測量各孔樣品的吸光度（optical density，OD）值，根據標準曲線計算出各樣品中IL-4、IL-10、IL-17。

1.4.4 Western blotting法檢測支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量 分別取各組6只小鼠的左肺組織，加入RIPA裂解液，收集上清液，測定總蛋白濃度，參照BCA樣品盒試劑說明書檢測肺組織勻漿上清液中CXCL10、CXCR3相對表達量，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離、轉膜、抗體孵育、曝光、顯影，采用Image J灰度分析計算CXCL10、CXCR3相對表達量。

1.4.5 免疫組化法檢測支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量 分別取各組另外6只小鼠左肺組織，支氣管肺組織切片制備方法同1.4.2，免疫組化染色操作步驟按試劑盒說明書進行，將支氣管肺組織切片置于含有枸櫞酸鈉緩沖液的器皿中，加熱至沸騰。冷卻、清洗后加入山羊血清，常溫擱置30 min后清洗，分別加入抗CXCL10抗體及抗CXCR3抗體（用PBS液代替一抗作為陰性對照），37 ℃孵育30 min，清洗、擦干支氣管肺組織切片后加入二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑染色，封固，置于光鏡下觀察CXCL10和CXCR3的表達情況，采用Graphad Prim 8軟件計算CXCL10、CXCR3相對表達量。

1.5 統計學方法 采用Graphad Prim 8軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組小鼠行為學表現 干預后對照組小鼠精神狀態、呼吸頻率、體質量、進食飲水等表現如常，未見明顯變化；哮喘模型組小鼠出現精神萎靡、呼吸頻率增快、體質量減輕及厭食厭飲等；雷公藤甲素組小鼠精神狀態、呼吸頻率、體質量變化、進食飲水等行為異常表現較哮喘模型組有所減輕。

2.2 支氣管肺組織形態學變化

2.2.1 HE染色結果 對照組小鼠氣道上皮結構完整，未見明顯炎癥細胞浸潤及黏液分泌。與對照組比較，哮喘模型組可見氣道上皮細胞脫落、炎癥細胞浸潤、黏液分泌增多，氣道平滑肌增生；與哮喘模型組比較，雷公藤甲素組氣道上皮細胞脫落、炎癥細胞浸潤、黏液分泌均減少，見圖1。

2.2.2 PAS染色結果 對照組小鼠氣道內結構完整，未見明顯杯狀細胞增生。哮喘模型組可見氣道上皮杯狀細胞增生，黏液分泌明顯增多，PAS染色呈紫紅色；與哮喘模型組比較，雷公藤甲素組氣道上皮杯狀細胞增殖、黏液分泌減少，見圖2。對照組、哮喘模型組、雷公藤甲素組氣道上皮杯狀細胞占比分別為（0.05±0.01）、（0.37±0.14）、（0.25±0.09），差異有統計學意義（F=49.371，P＜0.01）；其中，哮喘模型組、雷公藤甲素組氣道上皮杯狀細胞占比高于對照組，雷公藤甲素組氣道上皮杯狀細胞占比低于哮喘模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 三組小鼠支氣管肺組織的形態學變化（PAS染色，×200）Figure 2 Morphology of bronchopulmonay tissue in three groups of mice

2.3 BALF結果檢查

2.3.1 BALF中細胞總數、炎癥細胞計數 三組BALF中細胞總數、嗜酸粒細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中，哮喘模型組、雷公藤甲素組BALF中細胞總數、嗜酸粒細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數高于對照組，雷公藤甲素組BALF中細胞總數、嗜酸粒細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數低于哮喘模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組小鼠BALF中細胞總數、炎癥細胞計數比較（±s，×105/ml）Table 1 Comparison of cell count and inflammatory cell count in BALF among the three groups of mice

表1 三組小鼠BALF中細胞總數、炎癥細胞計數比較（±s，×105/ml）Table 1 Comparison of cell count and inflammatory cell count in BALF among the three groups of mice

注：a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與哮喘模型組比較，P＜0.05

組別 只數 細胞總數 嗜酸粒細胞計數 中性粒細胞計數 淋巴細胞計數對照組 12 2.83±1.90 0.42±0.52 0.25±0.45 1.17±0.58哮喘模型組 12 28.58±3.85a 6.58±1.16a 4.67±1.23a 6.92±1.50a雷公藤甲素組 12 9.00±1.54ab 3.08±2.02ab 1.58±0.79ab 2.83±0.94ab F值 313.16 60.36 78.67 90.61 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3.2 BALF中炎癥因子 三組BALF中IL-4、IL-10、IL-17比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中，哮喘模型組、雷公藤甲素組BALF中IL-4、IL-17高于對照組，IL-10低于對照組，雷公藤甲素組BALF中IL-4、IL-17低于哮喘模型組，IL-10高于哮喘模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組小鼠BALF中炎癥因子比較（±s，pg/ml）Table 2 Comparison of inflammatory factor in BALF among the three groups of mice

注：IL=白介素；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與哮喘模型組比較，P＜0.05

組別 只數 I L-4 I L-1 0 I L-1 7對照組 1 2 1 7.2 9±3.6 9 1 5.8 1±1.0 3 1 9.4 3±4.1 9哮喘模型組 1 2 6 6.3 1±4.4 3 a 1 1.4 6±1.9 9 a 7 0.0 3±3.6 1 a雷公藤甲素組 1 2 3 9.4 6±3.1 5 ab 1 3.9 3±1.3 8 ab 4 2.9 6±3.5 1 ab F值 5 0 2.4 1 2 4.6 1 5 3 7.7 1 P值 ＜0.0 1 ＜0.0 1 ＜0.0 1

2.4 支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量

2.4.1 Western blotting法結果 Western blotting法結果顯示，三組支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中，哮喘模型組、雷公藤甲素組支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量高于對照組，雷公藤甲素組支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量低于哮喘模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖3。

圖3 Western blotting法檢測三組小鼠支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量Figure 3 Relative expression of CXCL10 and CXCR3 in bronchopulmonay tissue detected by Western blotting in the three groups of mice

表3 三組小鼠支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量比較（Western blotting法）（±s）Table 3 Comparison of relative expression of CXCL10，CXCR3 in bronchopulmonay tissue among the three groups of mice （Western blotting）

表3 三組小鼠支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量比較（Western blotting法）（±s）Table 3 Comparison of relative expression of CXCL10，CXCR3 in bronchopulmonay tissue among the three groups of mice （Western blotting）

注：a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與哮喘模型組比較，P＜0.05

組別 只數 CXCL10 CXCR3對照組 6 0.15±0.02 0.21±0.01哮喘模型組 6 0.73±0.03a 0.63±0.03a雷公藤甲素組 6 0.41±0.19ab 0.39±0.02ab F值 1 040.00 507.86 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.4.2 免疫組化法結果 免疫組化法結果顯示，三組支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中，哮喘模型組、雷公藤甲素組支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量高于對照組，雷公藤甲素組支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量低于哮喘模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4、圖4。

圖4 免疫組化法檢測三組小鼠支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量（×200）Figure 4 Relative expression of CXCL10 and CXCR3 in bronchopulmonay tissue detected by immunohistochemical in the three groups of mice

表4 三組小鼠支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量比較（免疫組化法）（±s）Table 4 Comparison of relative expression of CXCL10，CXCR3 in bronchopulmonay tissue among the three groups of mice（immunohistochemistry）

表4 三組小鼠支氣管肺組織中CXCL10、CXCR3相對表達量比較（免疫組化法）（±s）Table 4 Comparison of relative expression of CXCL10，CXCR3 in bronchopulmonay tissue among the three groups of mice（immunohistochemistry）

注：a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與哮喘模型組比較，P＜0.05

組別 只數 CXCL10 CXCR3對照組 6 1 369.33±8.94 321.67±3.08哮喘模型組 6 7 331.50±10.75a 5 172.17±7.94a雷公藤甲素組 6 4 702.00±6.29ab 1 587.17±5.64ab F值 683 948.53 1 093 504.77 P值 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

哮喘是一種常見的慢性呼吸系統疾病，其治療大多使用糖皮質激素、β2-受體激動劑和白三烯調節劑。其中，糖皮質激素是控制哮喘氣道炎癥最有效的藥物［8］。但部分患者對激素治療并不敏感，且長期使用激素會導致如骨質疏松、血糖升高等不良反應［2］。雖然近年來治療哮喘的靶向藥物如奧馬珠單抗、美泊利單抗等對部分哮喘患者有一定的效果，但由于其治療費用昂貴，有些藥物還未在國內上市［9-11］。因此，仍有必要尋找有效、價廉、可降低疾病負擔的抗炎藥物，以提高哮喘的控制水平、患者的生活質量。

雷公藤甲素是一種二萜三環氧化物，是一種從雷公藤中分離出來的具有抗炎和免疫抑制作用的中藥活性化合物［5］。雷公藤甲素除了對自身免疫性疾病、皮膚疾病等有良好的治療效果外，還被證實具有抗氣道炎癥的作用［12］。張朝順等［13］研究發現，雷公藤甲素可以減少外周血和骨髓中嗜酸粒細胞數量；WEI等［14］研究發現，雷公藤甲素可以通過調節哮喘動物模型中炎癥細胞相關信號轉導和轉錄激活因子（如STAT3和STAT5）來影響Th17和Tregs的分化，從而減少氣道內IL-4、IL-17等炎癥遞質的表達；YANG等［15］研究證實，雷公藤甲素還可以抑制肥大細胞產生組胺、半胱氨酸、白三烯等炎癥遞質，從而發揮抗氣道炎癥作用；此外，雷公藤甲素還能通過抑制巨噬細胞產生一氧化氮和活性氧，抑制NF-κB活化和JNK磷酸化來減輕炎癥細胞（嗜酸粒細胞及中性粒細胞）對氣道的浸潤，并促進抗炎因子IL-10的表達［15-16］。

CXCL10/CXCR3軸與哮喘關系密切［17］。BRIGHTLING等［18］對哮喘患者支氣管黏膜活檢提示，在哮喘患者氣道內可見較正常人更多的CXCR3與CXCL10，且CXCR3與CXCL10的表達水平與氣道炎癥呈正相關。研究已證實，CXCR3基因缺失（CXCR3-/-）小鼠氣道中中性粒細胞及淋巴細胞的浸潤明顯減少，在使用中和抗體阻斷CXCL10后，小鼠支氣管肺組織中的嗜酸粒細胞浸潤也明顯減少［19-20］。研究發現，CXCL10與CXCR3結合，可以激活機體內ERK和MAPK途徑，從而誘導嗜酸粒細胞趨化至炎癥部位，進而引發炎癥反應［21］。TAKAKU等［22］研究發現，CXCL10和CXCR3在以中性粒細胞為主的哮喘表型中增多。在哮喘患者中，CXCL10與CXCR3結合可以激活中性粒細胞并將其吸引到氣道內。WU等［4］研究證實，IL-10缺失可以促進CXCL10與CXCR3的結合，繼而導致Th1細胞表達的IL-4和Th17細胞表達的IL-17在惡性胸腔積液中增加。王立新等［6］研究證實，雷公藤甲素可以減少類風濕關節炎患者體內CXCL10/CXCR3的表達，從而減輕機體內的炎癥反應。然而，雷公藤甲素能否通過調節CXCL10/CXCR3軸來減輕哮喘小鼠的氣道炎癥尚缺乏相關研究。

本研究采用雷公藤甲素干預哮喘小鼠，結果顯示：與哮喘模型組比較，雷公藤甲素組氣道上皮杯狀細胞增多、黏液分泌減少；BALF中嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞計數降低，同時促炎因子IL-4、IL-17降低，而抑炎因子IL-10卻升高。已有研究表明，炎癥細胞及細胞因子受CXCL10/CXCR3軸的調控［23-24］。而本研究發現，在雷公藤甲素組，調控氣道炎癥細胞（嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞）在氣道的浸潤及炎癥因子（IL-4、IL-17、IL-10）在氣道中表達的CXCL10與CXCR3也減少，表明雷公藤甲素可能通過調控CXCL10/CXCR3軸而抑制氣道炎癥。

綜上所述，雷公藤甲素能夠減少哮喘氣道上皮杯狀細胞及BALF中嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞，下調促炎因子IL-4、IL-17，上調抑炎因子IL-10，同時抑制CXCL10和CXCR3的表達，繼而減輕哮喘小鼠模型氣道炎癥，這可能與雷公藤甲素可調控CXCL10/CXCR3軸有關。本研究為雷公藤甲素治療哮喘提供了理論依據。但本研究也存在不足：一是，雷公藤甲素組僅設置了一個給藥劑量，未分析不同劑量梯度對哮喘小鼠氣道炎癥的作用，不清楚雷公藤甲素的抗炎作用是否存在劑量依賴性；二是，未觀察雷公藤甲素對哮喘小鼠的不良反應，這些問題有待進一步研究。

作者貢獻：任強對文章進行構思與設計，資料收集與整理，論文撰寫；鄧俊進行研究的實施與可行性分析；周進進行統計學處理；任強、張沄進行論文修訂；王宋平負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。