2016—2020 年內(nèi)蒙古某教學(xué)醫(yī)院尿液標本分離菌的耐藥性分析及部分大腸埃希菌多位點序列分型

宿瑞俊， 鄭文琪， 申慧敏， 呂瑩瑩， 郭素芳

作者單位： 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010050。

尿路感染是最常見的感染性疾病之一。據(jù)統(tǒng)計將近50%的女性一年至少經(jīng)歷1 次尿路感染，高達90%的社區(qū)獲得性和50%的醫(yī)院尿路感染由大腸埃希菌引起，而且耐藥大腸埃希菌快速增長已成為全球共同關(guān)注的問題[1]。為了解臨床尿路感染細菌的構(gòu)成及其耐藥情況，現(xiàn)將2016—2020 年5 年間內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院尿液標本分離菌的分布及耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)進行分析和總結(jié)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 菌株來自于2016 年1 月—2020年12 月本院門診和住院患者清潔中段尿液標本。細菌培養(yǎng)計數(shù)革蘭陰性菌 ≥105CFU/mL，革蘭陽性菌≥104CFU/mL。剔除同一患者重復(fù)分離的菌株。1.1.2 試 驗 器 材 VITEK-2 GP/AST-GP67 和VITEK-2 GN/AST-GN16 鑒定藥敏試驗卡（Bio-Mérieux 公司產(chǎn)品）、MH 瓊脂（天津金章公司）、抗菌藥物紙片均為英國OXOID 公司產(chǎn)品。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853、金黃色葡萄球菌 ATCC 25923、糞腸球菌ATCC 29212。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離鑒定及藥敏試驗 采用VITEK-2 自動化儀器進行菌株的鑒定，紙片擴散法或VITEK-2 自動化儀器法進行藥敏試驗。用萬古霉素E 試驗條測定MIC 值復(fù)核確認萬古霉素不敏感菌株。VITEK-2 自動化儀器法檢測超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）菌株。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 采用WHONET 5.6 軟件統(tǒng)計分析。按CLSI 2020 年版標準判讀藥敏結(jié)果。頭孢唑林折點參考非復(fù)雜泌尿道感染敏感折點MIC≤16 mg/L、耐藥折點≥32 mg/L。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分型及B2 型菌株MLST 收集2020 年連續(xù)分離204 株大腸埃希菌進行系統(tǒng)發(fā)育分型。煮沸法提取204 株大腸埃希菌DNA，參照文獻 [2]進行多重 PCR 擴增ChuA、YjaA、TspE4.C2. 基 因，將204 株 大 腸 埃 希 菌 分 為A、B1、B2 或D 四 型。對71 株B2 型 大 腸 埃 希 菌 根 據(jù)Achtman 方案，擴增7 個管家基因（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA 和recA），擴增產(chǎn)物送中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司測序。將序列提交MLST 數(shù)據(jù)庫 （http：//pubmlst.org/organisms/escherichia-spp）進行比對，獲得每個管家基因的等位基因號，從而得到每株菌的ST 型別。

2 結(jié)果

2.1 菌株來源及分布

共收集來自尿液非重復(fù)分離菌9 008 株。78.6%菌株來自住院患者，21.4% 菌株來自門診患者。革蘭陰性菌80.1%，革蘭陽性菌19.9%。排名前5 位的細菌分別是大腸埃希菌58.7%、屎腸球菌8.8%、肺炎克雷伯菌6.7%、糞腸球菌5.1%、無乳鏈球菌4.0%。變形桿菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌也有一定的占比，金黃色葡萄球菌占1.2%，見表1。

表1 主要菌種菌株數(shù)分布構(gòu)成比Table 1 Distribution of bacterial strains isolated from urine from 2016 to 2020

2.2 革蘭陽性菌藥敏試驗結(jié)果

糞腸球菌對測試抗菌藥物的耐藥率均顯著低于屎腸球菌。無乳鏈球菌和屎腸球菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥率＞87%，糞腸球菌耐藥率接近50%。糞腸球菌和屎腸球菌對氨芐西林的耐藥率分別為0 和95.5%；未發(fā)現(xiàn)利奈唑胺耐藥的糞腸球菌和屎腸球菌，未發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥的糞腸球菌，發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥的屎腸球菌3 株，均用萬古霉素E 試驗條測定MIC 值進行確認。甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA） 對β 內(nèi)酰胺類、 大環(huán)內(nèi)酯類、 氨基糖苷類和喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率均顯著高于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA），對甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率MRSA 低于MSSA，未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素和利奈唑胺耐藥的金黃色葡萄球菌。見表2。

表2 革蘭陽性菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 2 Susceptibility of Gram-positive bacteria to antimicrobial agents（%）

2.3 革蘭陰性菌藥敏試驗結(jié)果

2.3.1 腸桿菌科細菌 大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBL 陽性檢出率分別為44.1%和36.0%。大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類仍高度敏感，但均出現(xiàn)耐藥菌株，對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別為0.4%、0.3%和5.5%、4.9%。大腸埃希菌5 年間對測試抗菌藥物耐藥情況變化不大，只有碳青霉烯類、喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率呈現(xiàn)上升趨勢。見表3 和表4。

表3 大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of E. coli and K. pneumoniae to antimicrobial agents（%）

表4 2016—2020 年大腸埃希菌對抗菌藥物的敏感率和耐藥率Table 4 Susceptibility of E. coli to antimicrobial agents by year from 2016 to 2020（%）

2.3.2 不發(fā)酵糖革蘭陰性菌 銅綠假胞菌對所有測試抗菌藥物的耐藥率均顯著低于鮑曼不動桿菌。鮑曼不動桿菌對阿米卡星耐藥率略低于20%，對替加環(huán)素耐藥率較低為3.2%，對其他測試抗菌藥物的耐藥率均在30%以上；銅綠假單胞菌對所測試的抗菌藥物的耐藥率低于25%，見表5。

表5 銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 5 Susceptibility of P. aeruginosa and A. baumannii to antimicrobial agents（%）

2.4 菌株種系分型和MLST

對2020 年尿液標本分離的204 株大腸埃希菌株的種系分型，A 型15.7% （32 株）、B1 型6.4%（13 株）、B2 型47.0% （96 株）、D 型24.0% （49株）、另有6.9% （14 株）不能進行分型。71 株B2 型大腸埃希菌的MLST 共檢出6 種ST 型別（ST1193、ST131、ST95、ST4、ST12、ST3910），其中 ST1193 數(shù)量最多， 占54.9%（39 株），其次是ST131（25 株），占35.2%，ST95 型4 株，ST4 型、ST12 型和ST3910 型各1 株。6 種序列類型的分布及耐藥性總體情況見表6。

表6 大腸埃希菌6 種序列類型的分布及耐藥性總體情況Table 6 Patient demographics and antimicrobial resistance rate summarized by 6 sequence types of E. coli

3 討論

我院5 年間尿液標本的臨床分離菌以革蘭陰性菌為主，前5 位的細菌為大腸埃希菌、屎腸球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌和無乳鏈球菌，其中前4位的菌種與CHINET 監(jiān)測網(wǎng)2020 年泌尿道標本分離前4 位的菌種一致[3]。

腸球菌是尿路感染中僅次于大腸埃希菌的第二大病原菌。本組資料尿液標本的屎腸球菌檢出率高于糞腸球菌，與CHINET 監(jiān)測網(wǎng)[3]、余建洪等[4]報道一致。國內(nèi)也有尿路感染糞腸球菌檢出率高于屎腸球菌的報道[5-7]。屎腸球菌對多數(shù)抗菌藥物的耐藥率明顯高于糞腸球菌。糞腸球菌對青霉素、氨芐西林的耐藥率較低, 分別是3.1%和0；而屎腸球菌對二者的耐藥率則很高，分別是93.3%和95.5%。腸球菌對利奈唑胺和萬古霉素仍高度敏感，未檢出對利奈唑胺耐藥的腸球菌屬細菌，亦未檢出對萬古霉素耐藥的糞腸球菌，檢出0.4%的萬古霉素耐藥屎腸球菌。腸球菌感染治療，一般采用β 內(nèi)酰胺類聯(lián)合氨基糖苷類，但對于青霉素、氨芐西林或高濃度慶大霉素耐藥菌株則無協(xié)同作用。

大腸埃希菌是引起尿路感染最主要的病原菌，75%單純性尿路感染和65%復(fù)雜性尿路感染是由大腸埃希菌所致[8]。本組資料顯示尿液標本分離菌居首位的大腸埃希菌占到58.7%。大腸埃希菌對左氧氟沙星的耐藥率高達70% 以上，碳青霉烯類抗生素仍然對大腸埃希菌保持較高抗菌活性。5 年間大腸埃希菌對測試抗菌藥物的耐藥性變化不大，包括對喹諾酮類抗菌藥物的高耐藥率，可能是喹諾酮類被臨床醫(yī)師廣泛用于治療尿路感染。

上世紀90 年代中期，大腸埃希菌ST131 出現(xiàn)，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，并導(dǎo)致大腸埃希菌的耐藥率迅速增高[9]，其中ESBL 陽性率較高，有研究報道中國某地區(qū)ST131 菌株中ESBL 陽性率為65.5%[10]，本研究也達到了56.0%。有研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌 ST131 克隆株與腎盂腎炎高度相關(guān)，尤其是ST131 的H30 亞克隆株與持續(xù)性或復(fù)發(fā)性尿路感染密切相關(guān)[11-13]。自2012 年以來，一種新的氟喹諾酮類耐藥大腸埃希菌ST1193 在多個國家出現(xiàn)，在美國氟喹諾酮類耐藥的大腸埃希菌ST1193 在尿路感染中的比例急劇增長[9,14-17]，在中國，大腸埃希菌ST1193 相關(guān)研究也有報道[18-19]，本組資料中大腸埃希菌ST1193 也有較高的分離率，占54.9%。ST131 和ST1193 兩種型別菌株對β 內(nèi)酰胺類抗生素的不敏感率前者高于后者，但對非β 內(nèi)酰胺類抗生素的不敏感率兩者大致相仿，均很高：對左氧氟沙星和環(huán)丙沙星等氟喹諾酮類的不敏感率均高達87.2%以上；對甲氧芐啶-磺胺甲唑的不敏感率兩者約50%左右。ST131 對慶大霉素的不敏感率（48.0%）高于ST1193（25.6%）。提示不同型別的大腸埃希菌對抗菌藥物的耐藥率具有各自的特點，如能在可行的情況下開展大腸埃希菌的MLST，有助于尿路感染的甄別診斷和治療。

細菌對抗菌藥物耐藥率的增高和多重耐藥菌株的出現(xiàn)成為醫(yī)學(xué)發(fā)展中重要的問題[20]。尿路感染早期及時診斷及治療可避免對腎臟造成損害[21-22]。尿液標本臨床分離菌的培養(yǎng)和藥敏試驗對尿路感染的診斷和治療具有十分重要的指導(dǎo)意義。對疑有尿路感染癥狀的患者應(yīng)及時送檢尿標本做病原學(xué)檢查，根據(jù)藥敏結(jié)果合理使用抗菌藥物，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。