巨細胞病毒疫苗研究進展

孫 鈺， 張魯平， 蔣銀華， 秦 剛

作者單位： 1. 南通大學附屬醫院感染科，江蘇南通 226001；*耳鼻咽喉科；

2. 南通市婦幼保健院臨床醫學研究中心。

1 巨細胞病毒（cytomegalovirus, CMV）感染現狀

CMV 感染是一個被忽視的重大公共衛生問題,全球近80%人口存在CMV 感染，感染與地理位置、種族和經濟狀況有關。在發達國家，CMV 感染率低于發展中國家，育齡期女性CMV 血清特異性抗體陽性率為41%～50%[1]，新生兒先天性CMV感染率為0.5%～1%[2]。在發展中國家，CMV 感染率較高，育齡期女性CMV 血清特異性抗體陽性率高達80%～100%，新生兒先天性CMV 感染率為0.6%～6.1%[3]。我國是CMV 感染的高發區，我國孕婦的CMV 血清特異性抗體陽性率為94%～98%，新生兒先天性CMV 感染率約0.7%[4-5]。CMV 感染也是導致異基因造血干細胞移植（HCT）和實體器官移植（SOT）患者發病率和死亡率高的重要原因之一，其中HCT 后CMV 活動性感染總發生率為44.08%，病死率為16.18%，異基因HCT后CMV 感染病死率高于同基因HCT 移植與自體移植者（P＜0.01）[6]；在沒有進行抗病毒預防的情況下，SOT 患者CMV 感染率為75%，具體發病率因移植器官的類型而異[7]。

CMV 是人類皰疹病毒中最大的一種，為雙鏈DNA 病毒。完整病毒顆粒直徑為200～300 nm，電鏡下由外向內分別為含有多種糖蛋白的脂質包膜、被膜、二十面體立體對稱衣殼和包含其基因組的內部核蛋白核心。脂質包膜含有糖蛋白，能夠誘導產生中和抗體，目前發現的CMV 包膜糖蛋白包括糖蛋白 B、糖蛋白H、糖蛋白L、糖蛋白O 等。CMV 被膜介于二十面體衣殼與包膜之間，是皰疹病毒所特有的結構，其被膜蛋白包含豐富的磷酸化蛋白pp65，能誘導強烈的細胞免疫應答，在病毒的裝配、基因調控和改變宿主細胞代謝等方面發揮作用。CMV 衣殼蛋白除了構成病毒衣殼外，還有錨定病毒DNA 的作用。基因組是一個64 nm 的線性雙鏈DNA 分子，包含超過230 個蛋白質的非重疊開放閱讀框；其中一種蛋白質是DNA 聚合酶，它在病毒復制中起著不可或缺的作用，并且是目前所有批準的抗病毒藥物的主要靶點[8]。CMV 感染會引起強烈的病毒特異性CD4+和CD8+T 細胞反應。針對CMV 的不同抗原，機體能夠產生特異性抗體，其中IgG 表示既往感染，IgM 表示急性或近期感染。研究發現，機體抗CMV 產生的體液免疫應答主要針對病毒包膜糖蛋白gB，而細胞免疫應答主要針對被膜蛋白pp65[9]。

CMV 感染人體后主要通過體液傳播，包括唾液、尿液、精液、陰道分泌物和乳汁，感染后可累及全身多個系統及臟器，持續存在于被感染宿主體內并在骨髓細胞中保持休眠狀態。當宿主免疫力下降時，病毒發生再激活，被釋放到血液和其他體液中，從而出現感染后癥狀[10]。所以不僅是未感染過CMV 的人群需要接種疫苗，針對CMV 血清抗體陽性人群接種疫苗仍是十分必要的，可以增強機體免疫反應，減輕病毒再激活后的臨床癥狀，減少CMV 感染后并發癥等。在個體成為血清抗體陽性之前的年齡進行免疫接種疫苗可以最大限度地發揮作用。如果疫苗最終部署在血清陽性比例很高的年齡人群中，在血清學測試中可能有一些效用，以確定哪些人可能從疫苗中獲益最多，但如果接種血清陽性者沒有安全問題，也可以考慮在沒有血清學測試的情況下使用已知的僅對血清陰性者有益的疫苗。盡管在出現大量血清反應陽性的年齡接種疫苗可能是安全的，但如果在許多青春期及育齡期女性出現血清反應陽性之前的年齡就接種疫苗，可能會更有說服力[11]。

2 疫苗研究進展

CMV 疫苗被美國醫學研究所和疫苗咨詢委員會認為是21 世紀疫苗中的高度優先報告事項[12]。雖然目前對CMV 疫苗的需求十分迫切，但至今尚無CMV 疫苗上市。第一代CMV 疫苗主要是減毒活疫苗，有免疫原性但臨床預防效果差[13]。第二代疫苗主要是亞單位疫苗，如gB 疫苗、gH/gL/UL128/UL130/UL131A 五聚體疫苗、pp65 肽疫苗。第三代疫苗為各種基因疫苗，如DNA 疫苗、病毒載體疫苗。當前的CMV 疫苗已經進行了廣泛的臨床研究，在針對特殊人群的CMV 感染及相關疾病預防方面取得了令人鼓舞的成績。如果疫苗能有效預防感染或病毒脫落，最初接種CMV 疫苗的目標人群包括青春期及育齡期女性[14]。

2.1 減毒活疫苗

Towne-Toledo 嵌合體疫苗Towne 株和未減毒的Toledo 株的基因組重組研制4 種獨立的嵌合候選疫苗。首次人體試驗是一次Ⅰ期臨床試驗，試驗結果表明4 種嵌合CMV Towne-Toledo 候選疫苗對20 名CMV 血清陽性受試者均具有良好的安全性與耐受性，沒有與疫苗接種相關的嚴重不良事件。為辨別4 種不同疫苗在安全性或耐受性方面的差異,在之后進行了一項針對CMV 血清陰性受試者的Ⅰ期臨床試驗。36 名受試者均分為4 組，分別接受Towne-Toledo 嵌合體1～4 疫苗。試驗結果表明，接種疫苗后發生抗體反應，嵌合體1～4的血清抗體由陰性轉為陽性的人數占總人數的百分比不同，分別為11.11%、33.33%、0、77.78%，顯然嵌合體4 在誘導血清轉化方面最成功。在接種后12 周或發生血清轉化者的 52 周內，所有受試者的尿液或唾液檢測CMV 均為陰性，即該疫苗在CMV 血清陰性受試者中具有良好的耐受性并且不會被排出體外。檢測到發生CD4+T 細胞反應的概率為2.78%，僅在1 名接受嵌合體4 的受試者中檢測到。檢測到發生CD8+T 細胞反應是在 11 個血清轉化者中，概率為72.72%。然而，在所有血清轉化的受試者中，與其他疫苗相比，發生血清學反應的強度、持續時間并沒有明顯更強、更長，即沒有證據表明該疫苗的免疫原性強于其他疫苗。需要注意的是該疫苗尚沒有在其他受試者中進行試驗，無法確定在其他受試者中的安全性和免疫原性，且仍需進一步的試驗確定該疫苗的最佳劑量[15]。

2.2 亞單位疫苗

2.2.1 gB 疫苗 現階段研究最為深入的疫苗是gB亞單位疫苗。gB/MF59 疫苗為重組CMV gB 蛋白和MF59 佐劑組成的疫苗，最初由美國 Chiron 公司研發，之后授權給法國Sanofi Pasteur 公司。已在三種受試者分別為經產婦、SOT 受者及青春期女性的Ⅱ期臨床試驗中顯示出部分保護作用。其中在針對CMV 血清特異性抗體陰性的健康經產婦和青春期女性的兩項Ⅱ期臨床試驗中，總有效率為43%～50%[16-17]。兩次試驗的具體結果如下：受試者為經產婦，隨機分配為疫苗組和安慰劑組。疫苗組的年感染率為3.30%，安慰劑組為6.60%，總體疫苗效力為50%[16]。受試者為青春期女性，試驗結果表明，若按方案接種，疫苗有效率45%。總體而言，該疫苗安全且具有免疫原性[17]。另一項Ⅱ期臨床試驗是針對等待腎或肝移植的成年人，140 名受試者按照CMV 血清陰性和血清陽性1:1隨機分配為疫苗組和安慰劑組。研究表明疫苗組gB 抗體滴度顯著增加。在移植后出現病毒血癥的患者中，gB 抗體滴度與病毒血癥的持續時間呈負相關（r=0.62，P=0.002 2）。在有血清陽性供者的血清陰性受者中，接種疫苗者的病毒血癥持續時間 （12%對57%，P=0.048 0）和更昔洛韋治療天數（13% 對 69%，P=0.028 7）減少。同時，試驗結果認為該疫苗誘導的抗體可能結合CMV 陽性供者所捐獻器官中的病毒，防止移植后受者發生病毒血癥[18]。此外，為驗證該疫苗對于CMV 血清特異性抗體陽性人群的有效性，對已感染CMV 的人群進行了Ⅰ期臨床試驗。研究表明，在慢性 CMV 感染的女性中接種gB/MF59 疫苗后，CMV 特異性抗體和CD4+T 細胞反應均可增強[19]。評估疫苗策略的金標準傳統上認為是誘導有效的中和抗體反應，有數據顯示，血清陽性移植受者的血清具有中和抗體，但接種gB/MF59 后這些抗體并未明顯增強。最有可能的是，gB 疫苗的有效性并不完全依賴于經典的中和生物活性，還應歸因于部分非中和抗體[20]。

2.2.2 gH/gL/UL128/UL130/UL131A 五 聚 體 疫苗 V160 疫苗由是德國的Merck Sharp ＆ Dohme公司研發，該疫苗源自AD169 毒株，在疫苗制造過程中使用一種稱為Shield-1 的合成化學物質作為培養基中的補充劑，能夠嚴格調控病毒生長，使其在接種后無法在機體內正常復制。并通過基因改造恢復病毒gH /gL/UL128/UL130/UL131A 五聚體復合物的表達，該復合物為病毒感染機體所必需的決定因素，也是機體感染后自然免疫產生中和抗體的主要靶點，應答主要集中在IE1 和pp65上。在一項受試者為CMV 血清特異性抗體陽性及陰性人群的Ⅰ期臨床試驗中。檢測疫苗組受試者的唾液或尿液，沒有發現病毒脫落，證實了V160存在復制缺陷。在血清特異性抗體陰性的受試者中，接種該疫苗后受試者抗上皮細胞感染的中和抗體效價明顯增加。接種疫苗后的第7 個月，所有疫苗接受者均出現中和抗體陽性，在第12 個月和第18 個月，大多數疫苗接受者中和抗體仍呈陽性。證明該疫苗對CMV 血清陰性與陽性人群的安全性和免疫原性均良好[21]。雖然V160 不能在體內復制，但仍可以有效地啟動已接種疫苗的受試者的免疫系統。此外，一項Ⅱb 期多中心研究自2018 年開始進行（NCT03486834），目的是評估2 劑和3 劑V160 方案在16～35 歲健康血清陰性女性中的安全性、耐受性、有效性和免疫原性。該試驗共有2 200 名參與者，參與者在第1 天、第2 個月和第6個月接受V160 疫苗（3 劑量方案）；第1 天和第6個月接受V160 疫苗，第2 個月接受安慰劑（2 劑量方案）；或在第1 天、第3 個月和第6 個月接受安慰劑（安慰劑對照組）。目前尚無研究結果公布。Towne-Toledo 疫苗和gB/MF59 疫苗在CMV 血清

陰性的婦女中，這兩種疫苗對CMV 感染療效溫和，因為都缺乏病毒五聚體復合物的表達，而病毒五聚體復合物是CMV 感染上皮細胞和內皮細胞的趨向性決定因素，也是在自然感染期間觀察到的有效中和抗體的關鍵抗原。V160 是第一個設計用來表達五聚體復合物的候選疫苗，這項首次人類評估的結果證實了在臨床前評估中觀察到的五聚體復合物在誘導有效中和效價對抗人類上皮細胞病毒感染方面的重要性。雖然已經證明五聚體特異性抗體在中和上皮細胞進入方面比gB 抗體強，但關于五聚體疫苗的研究結果尚不足以說明五聚體疫苗強于gB 疫苗。

2.2.3 pp65 肽疫苗 CMV PepVax 疫苗由由美國希望之城醫療中心和美國國家癌癥研究所研制，由美國輝瑞公司提供佐劑，是由HLA A*0201 人群的限制性CTL 表位 pp65495-503 與破傷風毒素T 細胞表位融合而成的肽疫苗，佐劑為Toll 樣受體 9 激動劑PF03512676。pp65 被膜蛋白是CMV血清反應陽性健康成年人中最常被免疫學識別的CMV 抗原之一。在一項Ⅰb 期臨床試驗中，共有68 名HLA-A*0201 CMV 血清陽性或血清陰性的受試者，試驗結果證明盡管添加 PF03512676 佐劑會增加不良反應的反應原性，但該肽疫苗在大多數受試者中是安全且耐受的。但是，研究報告顯示使用 PF03512676 佐劑時發生流感樣不良反應的比例很高，這表明需要謹慎用于免疫活性供體產品的進一步開發[22]。異基因HCT 受者極易受到機會性感染，其中CMV 仍然是HCT 受者的主要感染并發癥。在一項主要目的是研究該疫苗的安全性與免疫原性的Ⅰb 期臨床試驗中，受試者為36 名CMV 血清陽性的HCT 受者，且為HLA-A* 0201限制性，按CMV 供體血清水平分層后隨機分配到疫苗組或對照組。對照組在接受HCT 后的100 d內 pp65495-503 特異性CD8+T 細胞的水平增加為基 線 的1.4 倍（95%CI：0.6～3.3，P=0.27）， 而疫苗組增加為基線的3.5 倍（95%CI：1.6～7.9，P=0.0018），疫苗效應疫苗組與對照組相比從基線到第100 天平均增加2 倍（95%CI：1.04～3.51，P=0.025）；移植后180 d 內，疫苗組與對照組相比病毒再激活減少（1 例對 6 例，P=0.039），發生病毒血癥者接受抗病毒治療后痊愈的時間縮短（15 d對 263 d，P=0.03）。研究表明該疫苗安全性、耐受性與免疫原性均良好，可以減少CMV 再激活和抗病毒藥物的使用[23]。一項多中心Ⅱ期臨床試驗自2015 年開始（NCT02396134），目的是評估優化劑量的PepVax 疫苗對HCT 受者的保護功能，并研究該疫苗接種后在接受干細胞移植的患者中減少發生嚴重CMV 感染的效果，以評估該疫苗的保護效益。這項試驗參與者為133 名CMV 血清陽性的HCT 接受者，隨機分配為兩組，在接受CMV 血清特異性抗體陽性的HCT 治療的同時，接受該疫苗或安慰劑治療，并在未來的一年中接受隨訪觀察，暫時無具體試驗結果公布，這將進一步確定該疫苗策略在HCT 環境中的作用和影響。當前研究的數據表明，最近開發的CMVPepVax 疫苗迅速擴增了具有記憶效應表型的CMV 特異性T 細胞，這通常在未接種疫苗的HCT 患者發生病毒血癥的CMV 再激活后出現。這些特性使CMVPepVax 疫苗成為進一步臨床評估的有希望的候選者。盡管如此，CMVPepVax 只能用于HLA A*0201 接受者（約占40%），這是該疫苗的一個重大限制[24]。

2.3 基因疫苗

2.3.1 DNA 疫苗 ASP0113 疫苗是由美國Vical公司開發，現由日本的Astellas 公司接管，是一種DNA 疫苗，由兩個編碼gB 和pp65 的質粒構成。已經完成了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗，但是結果卻證明該疫苗缺乏療效，主要是由于DNA 疫苗本身就較難產生強的免疫原性。在Ⅰ期臨床試驗中，試驗過程沒有發生嚴重不良事件，表明該疫苗耐受性良好，但該疫苗與對照組相比沒有增強抗體反應。Ⅱ期臨床試驗的受試者為HCT 受者。與對照組相比，疫苗組可檢測到的 CMV 病毒血癥的發生率顯著降低（P=0.008），CMV 病毒血癥發作次數更少 （P=0.017），雖試驗中出現不良反應，但差異沒有統計學意義，所以該試驗認為疫苗的耐受性良好[25]。在另一項Ⅱ期臨床試驗中，目的是評估疫苗ASP0113 在CMV 血清特異性抗體陰性腎移植受者中接受來自CMV 血清特異性抗體陽性供體的器官的有效性和安全性。結果表明，疫苗組與對照組之間的差異在統計學上沒有顯著意義 （OR=0.79，95%CI：0.43～1.47，P=0.307）。疫苗組與對照組的移植受者之間對pp65 的平均T 細胞反應和平均gB 抗體水平相似。且疫苗組和對照組受試者在第一次研究藥物注射后一年內CMV 病毒血癥的發生率差異無統計學意義。結果表明該疫苗在CMV 血清特異性抗體陰性的腎移植人群中無效但安全[26]。在一項目的是評估該疫苗在接受HCT 的CMV 血清特異性抗體陽性受體中的保護功效和安全性的Ⅲ期臨床試驗中，514 名CMV 血清特異性抗體陽性HCT 接受者，隨機接受疫苗或安慰劑。疫苗組與對照組之間的gB 特異性抗體反應總體上差異無統計學意義（P=0.112）。該疫苗在降低總體死亡率和CMV 感染終末器官病變方面沒有效果，并且在同種異體HCT 受者移植后1 年期間，在降低CMV 病毒血癥方面似乎也沒有效果。此外，與對照組相比，ASP0113 并未引起有效的T 細胞或B 細胞反應，與對照組安全性結果相似。由于缺乏療效，ASP0113 的開發已被終止[27]。盡管接種ASP0113 的受者CMV 病毒血癥的首發時間較長，CMV 病毒血癥的發生率較低，但未能達到減少需要抗病毒治療的CMV 病毒血癥的主要終點。

2.3.2 病毒載體疫苗 希望之城三聯疫苗由美國希望之城醫療中心研發，是一種表達與保護性免疫相關的CMV 抗原的重組減毒痘病毒修飾的安卡拉痘苗 （MVA），該疫苗可表達來自CMV 的3 種免疫優勢抗原（pp65、IE1、IE2），是一種高度減毒、非增殖性病毒載體疫苗。對該疫苗的首次臨床評估的Ⅰ期臨床試驗證明該疫苗在健康成人中具有良好的耐受性和高度免疫原性[28]。一項Ⅱ期臨床試驗中，在高危異基因HCT 接受者中完成了對該疫苗安全性和療效的研究：將102 例需要接受HCT 治療的CMV 血清抗體陽性患者隨機分為疫苗組和對照組，在移植后的前100 d 內，5 例三聯患者（9.8%）和10 例安慰劑患者（19.6%）發生CMV 再 激 活（HR=0.46，95%CI：0.16～1.4，P=0.075），證明接種該疫苗后發生CMV 事件的風險下降了一半。疫苗組的免疫應答顯著增加，如CD137+CD4+和CD137+CD8+pp65 特異性T 細胞在接受HCT 后的第100 天以及1 年后顯著增強。在整個1 年的觀察期內，抗病毒藥物的使用率，對照組為25.5%，而疫苗組為19.6%。盡管疫苗組接種前后3 級或4 級急性移植物抗宿主病發生率較高，但沒有超過預期。三聯療法耐受性對于血清特異性抗體陽性的HCT 接受者來說很好，在預防病毒血癥和改善CMV 特異性T 細胞重建方面明顯優于對照組。這是第一個通用的 （非HLA 特異性）、基于病毒載體CMV 疫苗，可以安全地在免疫抑制患者中誘導強大而持久的CMV 特異性T 細胞反應[29]。

HB-101 疫苗是由美國Hookipa Pharma 公司研發，載體為非復制型淋巴細胞性脈絡膜腦膜炎病毒（LCMV），編碼必需糖蛋白的LCMV 基因被編碼gB 或pp65 蛋白的基因取代。表達gB 的rLCMV 載體編碼缺乏來自CMV 株 Merlin 的細胞質結構域的C 端截短形式的gB，而表達pp65 的rLCMV 載體編碼來自CMV 株AD169 的未修飾的pp65 蛋白。該疫苗是等量的pp65 和gB 表達載體的混合物。在一項Ⅰ期臨床試驗中，共有54 名CMV 血清陰性受試者，目的是評估該疫苗在3 種不同劑量下對抗CMV 的安全性和免疫原性。該疫苗在所有劑量水平下均具有良好的耐受性，并且沒有報告嚴重不良事件。試驗結果是低劑量時未誘導出LCMV 載體中和抗體。發現gB 結合和中和抗體均出現劑量依賴性反應。高劑量組和中劑量組中的所有疫苗接種者 （100%）在第三次接種后都產生了gB 結合和中和抗體，在低劑量組中反應率為93%。在3 次給藥后，分別在71%、93%和86%的低、中和高劑量接受者中檢測到對gB和/或pp65 特異性細胞因子CD8+T 細胞反應。該研究表明HB-101 疫苗在高達100%的接受者中引發了CMV 特異性體液反應，在高達93%的接受者中引發了功能性細胞反應。伴隨這些CMV 特異性T 細胞反應，HB-101 誘導了LCMV NP 特異性、分泌IFN-γ 的T 細胞，這些載體特異性T 細胞的存在并不能阻止HB-101 對CMV gB 或pp65 特異性T 細胞的加強。HB-101 疫苗是迄今為止測試過的最有效的CMV 疫苗。CMV 特異性和 LCMV 特異性T 細胞反應是否以及在何種程度上可以競爭仍有待研究。當前研究中的受試者在研究開始時均為CMV 血清抗體陰性，未來的研究中將包括血清抗體陽性的受試者[30]。

3 小結與展望

綜上所述，目前已有多種CMV 疫苗進入不同階段的臨床試驗研究，甚至DNA 疫苗已經進入Ⅲ期臨床試驗，但疫苗的有效性和安全性還有待進一步研究，所以至今尚無CMV 疫苗進入臨床使用。相信隨著人們對CMV 免疫學及保護機制的研究不斷深入和科研技術的不斷進步，安全有效的CMV疫苗上市指日可待。