昆明地區多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥特征及同源性分析

王 佳，曹向紅，彭傳梅，徐 益，儲丹丹，陳秋芳，丁家偉

昆明醫科大學附屬延安醫院/云南心血管病醫院檢驗科，云南昆明 650051

鮑曼不動桿菌曾經被認為是毒力低、致病性弱的病原菌，20世紀70年代以前，大多數抗菌藥物對鮑曼不動桿菌治療有效。近三十年來，臨床上各類抗菌藥物的濫用、有創治療技術的開展、激素類藥物和免疫功能抑制劑的廣泛使用等都使鮑曼不動桿菌在臨床上的檢出率及耐藥率與日俱增[1-3]。據統計，全球每年約有100萬人感染鮑曼不動桿菌，這些感染中有一半是由多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDRAB)引起的[4]。MDRAB對當今幾乎所有常用的抗菌藥物都表現出耐藥，使得可選擇的治療抗菌藥物有限，這已成為一個全球問題，并威脅到全世界的醫療保健系統[5]。鮑曼不動桿菌不但耐藥機制多樣，而且存在嚴重的感染播散現象。對MDRAB進行基因分型，明確其同源性關系，有利于及時發現MDRAB的暴發流行，追尋傳染源和明確傳播途徑，從而為醫院感染控制提供有力的依據。鑒于此，本研究收集了昆明地區兩家三甲醫院92株非重復MDRAB進行了相關研究，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2018年1月至 2020年12月昆明醫科大學附屬延安醫院(簡稱醫院甲)、昆明市第一人民醫院( 簡稱醫院乙) 臨床分離的非重復MDRAB菌株共92株，其中醫院甲50株，醫院乙42株。

1.2儀器與試劑 微生物培養箱、VITEK2-Compact全自動微生物鑒定儀及其配套試劑、抗菌藥物紙片、恒溫孵育器、離心機、電子天平、PCR擴增儀、電泳儀、凝膠成像系統，以及Oligo公司的引物、Master Mix、核酸染料、DNA標志物、瓊脂糖凝膠、TAE緩沖液。

1.3細菌鑒定及藥敏試驗 菌株的分離、培養參照《全國臨床檢驗操作規程(第4版)》進行。采用VITEK2-Compact全自動微生物分析儀進行細菌鑒定與藥敏試驗。其中氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、米諾環素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦的藥敏試驗采用紙片擴散法，其余抗菌藥物藥敏試驗均采用微量肉湯稀釋法檢測最低抑菌濃度(MIC)。結果判定參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)2018、2019、2020年的標準。質控菌株包括大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌 ATCC25923，均購自國家衛生健康委員會臨床檢驗中心。MDRAB納入標準為對5類抗假單胞菌抗菌藥物(包括頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類、含β-內酰胺酶抑制劑的復合制劑、碳青霉烯類)中的3類或3類以上耐藥者，收集菌株于—70 ℃溫度條件下保存待用。

1.4常見β-內酰胺酶耐藥基因檢測

1.4.1DNA模板制備 采用煮沸法制備聚合酶鏈反應(PCR)模板。將經過VITEK2-Compact全自動微生物鑒定藥敏分析系統鑒定后儲存于-70 ℃低溫冰箱的MDRAB轉入血平板，經18～24 h培養后，挑取適量菌落到300 μL蒸餾水中，充分振蕩混勻，然后100 ℃水浴15 min，13 000 r/min離心5 min后取上清液作為DNA模板，-20 ℃冰箱保存備用。

1.4.2PCR擴增 反應體系總體積為50 μL，包括Master Mix 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板2 μL，蒸餾水21 μL。引物序列及產物長度見表1，參照文獻[6-8]設計引物，由北京博邁德基因技術有限公司合成。反應條件：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環，最后72 ℃延伸5 min。

表1 PCR引物序列

1.4.3PCR產物分析 擴增完產物經2%瓊脂糖凝膠，110 V電泳30 min，放入凝膠成像系統掃描成像。電泳出現明亮的條帶并且該條帶與預期產物大小相同者送北京博邁德基因技術有限公司進行測序，測序結果通過NCBI網站Blast比對分析。

1.5菌株同源性分析

1.5.1DNA模板制備 采用煮沸法制備PCR模板，操作同1.4.1。

1.5.2PCR擴增 反應體系：總體積50 μL，包括Master Mix 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板2 μL，蒸餾水21 μL。管家基因引物參照鮑曼不動桿菌MLST數據庫(http://pubmlst.org/abauniannii/)牛津方案，擴增檸檬酸合酶(gltA)、DNA促旋酶亞基B(gyrB)、葡萄糖脫氫酶B(gdhB)、同源重組因子(recA)、60×103伴侶蛋白(cpn60)、葡萄糖-6-磷酸異構酶(gpi)、RNA聚合酶σ因子(rpoD)7個管家基因，引物名稱及序列、產物長度、用途見表2，由北京博邁德基因技術有限公司進行合成。反應條件：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性30 s ，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環，最后72 ℃延伸5 min。

表2 鮑曼不動桿菌管家基因引物序列

1.5.3PCR產物分析 擴增后的PCR產物送北京博邁德基因技術有限公司進行純化并測序，將測序結果提交到鮑曼不動桿菌MLST數據庫中，從而得到每個管家基因的等位基因編號，按照gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi、rpoD的排列順序，將其編號輸入數據庫中，即能獲得相應菌株的序列型(ST)。

1.6統計學處理 采用WHONET 5.6軟件及Excel表格對菌株信息進行分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1藥敏試驗結果 92株MDRAB對所檢測抗菌藥物耐藥程度均較高，對青霉素類、單環β-內酰胺類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率高達100.0%；在含β-內酰胺酶抑制劑的復合藥物中，醫院甲、乙檢出的MDRAB除對頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為96.0%、90.5%外，對其余復合藥物耐藥率均為100.0%；兩家醫院檢出的MDRAB對妥布霉素、復方磺胺甲噁唑、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星的耐藥率差異較為明顯，醫院甲檢出的MDRAB對上述藥物耐藥率均在80.0%以上，而醫院乙檢出的MDRAB耐藥率僅為65.0%左右，甚至更低；兩家醫院檢出的MDRAB對米諾環素耐藥率差異尤為顯著，醫院甲耐藥率達62.0%，醫院乙耐藥率僅為7.1%；與之相反的是醫院甲檢出的MDRAB對替加環素具有很高的敏感性，耐藥率為0，醫院乙檢出的MDRAB耐藥率達到14.3%。見表3。

表3 不同醫院檢出MDRAB對常見抗菌藥物的耐藥率比較(%)

續表3 不同醫院檢出MDRAB對常見抗菌藥物的耐藥率比較(%)

2.2耐藥基因檢測結果 92株MDRAB β-內酰胺酶耐藥基因分布如下：88株攜帶OXA-23基因，占95.7%(88/92)；77株攜帶ADC基因，占83.7%(77/92)；70株攜帶TEM基因，占76.1%(70/92)；其余基因檢測均為陰性。攜帶ADC+OXA-23基因的菌株占81.5%(75/92)，攜帶TEM+OXA-23基因的占73.9%(68/92)，攜帶TEM+ADC基因的占60.8%(56/92)，攜帶TEM+ADC+OXA-23基因的占59.8%(55/92)。見表4。

表4 92株MDRAB β-內酰胺酶耐藥基因檢測結果

2.3同源性結果分析 將92株MDRAB各管家基因測序結果提交到鮑曼不動桿菌MLST數據庫進行比對，共分為12個ST，主要型別包括ST208型、ST368型、ST1145型、ST195型和ST191型，檢測到的其他分型還包括ST540型、ST159型、ST369型、ST1696型、ST136型、ST1646型、ST1353型。有3株細菌有新的等位基因位點，但鮑曼不動桿菌MLST數據庫尚未匹配，見表5。對兩家醫院MDRAB菌株ST型別進行對比分析，結果顯示兩家醫院的優勢型別各不相同：醫院甲以ST208為主要型別，占58.0%(29/50)；其次為ST1145型，占24.0%(12/50)；再次為ST159型，占6.0%(3/50)。醫院乙以ST368為主要型別，占31.0%(13/42)；其次為ST195型，占21.4%(9/42)；再次為ST208型，占19.0%(8/42)。兩家醫院存在共同型別為ST208和ST540型，其余型別均不同。見表5、圖1。

表5 MDRAB多位點序列分型結果

注：UT為鮑曼不動桿菌MLST數據庫尚未匹配ST。

3 討 論

MDRAB由于其擴展的耐藥基因組可逃避宿主的免疫效應，能夠在生物膜中生長，在極端環境條件下生存，并以最小的代謝率轉向潛在的生長形式，治療可選擇的抗菌藥物有限等，使其成為耐藥較嚴重的病原體之一[6]。根據中國細菌耐藥監測網公布的數據顯示，中國常見革蘭陰性菌對碳青霉烯類等抗菌藥物耐藥情況非常突出，而MDRAB表現更為明顯[7]。本研究分離的92株MDRAB中，對青霉素類、頭孢菌素類及碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率高達100.0%，對慶大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星、復方磺胺甲噁唑、阿米卡星的耐藥率均大于或等于50.0%，僅對替加環素保持較高敏感率。雖然兩家醫院MDRAB均存在高耐藥現象，但是對某些類別抗菌藥物的耐藥性不盡相同，如：醫院甲檢出的MDRAB對米諾環素耐藥率達62.0%，而醫院乙檢出的MDRAB耐藥率僅為7.1%；醫院甲檢出的MDRAB對替加環素具有很高的敏感性，耐藥率為0，醫院乙檢出的MDRAB耐藥率達到14.3%。推測上述耐藥性差異是由于本地區不同醫院常使用的抗菌藥物存在差異所導致。

MDRAB對不同抗菌藥物的耐藥性由不同的耐藥機制介導：產生水解酶，膜通透性降低，外膜蛋白改變、缺失及主動外排系統過表達均可以導致細菌多重耐藥。MDRAB在內源性基因突變和高水平基因組可塑性的雙重影響下，細菌菌體表面外排泵表達過度，能夠排出如慶大霉素、卡那霉素、氯霉素、紅霉素、喹諾酮類等抗菌藥物，尤其是外排泵RND系統中的AdeABC泵，在MDRAB對氨基糖苷類藥物的耐藥機制中發揮重要作用，加之生物膜保護作用，抗菌藥物無法進入鮑曼不動桿菌的菌體內，使得MDRAB逃避了抗菌藥物的殺滅作用，繼而對多種抗菌藥物均耐藥[8]。目前，研究得較多、較透徹的是鮑曼不動桿菌對臨床常用的β-內酰胺類抗菌藥物敏感性下降的機制。鮑曼不動桿菌的β-內酰胺酶按照Ambler分類分為A、B、C和D 4種分子類型[9]：A類酶為超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)，主要包括SHV、TEM、CTX-M、PER和GES等型[10-12]；B類酶又稱為金屬β-內酰胺酶(MBL)，因其催化活性需要鋅離子等金屬離子而得名[13]；C類酶為頭孢菌素酶(AmpC酶)，可由染色體和質粒介導，產此類酶鮑曼不動桿菌對頭霉素類、單環類和第1～3代頭孢菌素類抗菌藥物耐藥且不被β-內酰胺酶抑制劑所抑制[14]；D類酶又叫苯唑西林酶(OXA酶)，屬于弱的碳青霉烯類水解酶，但當其上游攜帶強啟動子的ISAba1等可移動元件過度表達時，可導致產此類酶鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥。MDRAB對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥機制中，產生β-內酰胺類水解酶為其最普遍的機制，為進一步分析兩家醫院MDRAB對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制，本研究選取7種常見β-內酰胺酶耐藥基因(SHV、TEM、IMP、VIM、ADC、OXA-23、OXA-58)進行檢測，結果顯示OXA-23、ADC、TEM基因為MDRAB主要攜帶的耐藥基因，分別有95.7%、83.7%、76.1%的菌株檢出，而SHV、IMP、VIM、OXA-58基因均未檢出。本研究中，MDRAB對青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗菌藥物均表現出極高的耐藥率，與TEM、ADC、OXA-23基因的高檢出率相符，表明MDRAB對β-內酰胺類抗菌藥物高耐藥的產生與菌株攜帶TEM、ADC、OXA-23基因密切相關。醫院甲攜帶耐藥基因以TEM、OXA-23為主，而醫院乙攜帶耐藥基因則以OXA-23、ADC為主，兩家醫院攜帶耐藥基因的差異，有可能是導致兩家醫院分離的MDRAB耐藥率不同的主要原因。從上述結果來看，醫院甲對氨基糖苷類、喹諾酮類抗菌藥物(除環丙沙星)耐藥率相對醫院乙總體偏高，推測是由于各醫院的治療手段、消毒措施、環境等各不相同，暴露的感染危險因素也不盡相同，致使細菌面臨的選擇性壓力不同，導致菌株的耐藥性出現差異。此外，醫院甲的MDRAB是否具備其他耐藥機制，如膜蛋白的改變及外排泵的過度表達等，值得以后的研究繼續對其進行進一步探討。

MDRAB作為一種院內感染條件性致病菌，在其生存過程中，保持遺傳性的同時不斷發生變異，攜帶各種耐藥基因的多重耐藥和泛耐藥菌株克隆傳播是造成世界各地醫院暴發流行的原因。本研究對選取的92株MDRAB進行同源性分析，結果顯示92株MDRAB包括ST208、ST368、ST1145、ST195、ST191、ST540、ST159、ST369、ST1696、ST136、ST1646、ST1353型共12個型別，其中ST208型包含37株，占40.2%，其次是ST368型，共檢出13株，占14.1%。分別對兩家醫院菌株進行同源性分析，發現兩家醫院的主要型別并不一致。醫院甲以ST208型為主要型別，占58.0%；醫院乙則以ST368型為主要型別，占31.0%，這說明兩家醫院在各自醫院不同科室可能存在克隆傳播現象，但是目前未發生明顯的醫院間MDRAB菌株克隆傳播。雖然醫院乙ST208型所占比例僅為19.0%，不是該醫院MDRAB菌株的主要型別，但仍然需要警惕未來同一地區不同醫院間的ST208克隆株流行傳播的可能。