基于miR-106b-5p調控CCND1基因研究幽門螺桿菌促進食管癌細胞增殖的功能機制

沈曉雯，黃琳玲，蔣林燕，沈紅梅

江蘇省南通市第二人民醫院檢驗科，江蘇南通 226001

食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，早期診斷難度大，容易發生浸潤和轉移，即使接受較為全面的綜合治療，整體預后仍不佳，很多患者死于局部復發或遠處轉移[1-2]。食管癌的發病與遺傳因素、環境因素、飲食因素等有關，近些年有學者提出幽門螺桿菌(Hp)感染可能是食管癌發病的危險因素，食管癌患者Hp感染率明顯高于慢性食管炎患者及食管不典型增生患者，且Hp感染與食管癌的惡性程度相關[3-4]。但目前關于Hp感染是否參與食管癌發生、發展尚缺乏細胞實驗證據，相關的分子機制也不十分清楚。微小核糖核酸(miR)-106b-5p在食管癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤中發揮抑癌作用，原癌基因細胞周期蛋白D1(CCND1)是miR-106-5p的潛在靶基因之一[5-7]。一項胃黏膜病變相關的細胞實驗證實，Hp脂多糖對miR-106b-5p的表達具有抑制作用，提示Hp可能削弱miR-106b-5p的抑癌作用，進而參與胃癌或食管癌等惡性腫瘤的發生[8]。基于此，本研究將以miR-106b-5p/CCND1途徑為切入點，系統探討Hp感染調控食管癌細胞增殖的作用機制，旨在為深入認識Hp感染導致食管癌發病的分子機制提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年6月至2021年10月在本院手術切除的食管癌標本46份，標本來源患者中男28例，女18例；年齡41～72歲，平均(62.93±11.44)歲。納入標準：(1)經病理檢查診斷為食管癌；(2)按要求留取組織標本；(3)未接受過放化療或其他腫瘤相關治療。排除標準：(1)既往有其他惡性腫瘤病史；(2)合并自身免疫性疾病。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準，取得患者知情同意。

1.2細胞株及菌株來源 食管癌TE-1細胞株(STR鑒定正確，批號C6946)及Hp標準菌株NCTC11637(批號R4601603)均購自美國菌種保藏中心，Hp菌液的水平為1×108CFU/mL。

1.3儀器與試劑 陰性對照(NC)序列及miR-106b-5p模擬物(序列：5′-TAGACGTGACAGTCGTGAAAT-3′)均購于吉瑪公司(中國)， MTS法細胞活力檢測試劑盒購于Promega公司(丹麥)，miR提取試劑盒、miR cDNA第一鏈合成試劑盒、miR熒光定量檢測試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司，CCND1、β-actin特異性一抗購于美國CST實業有限公司。

1.4方法

1.4.1食管癌Hp感染的檢測 取食管癌組織、制作石蠟切片，用快速脲酶法和Warthin-Starry銀染法進行Hp檢測，兩種檢測方法均為陽性則判斷為Hp陽性，反之則為Hp陰性。

1.4.2細胞培養及干預 TE-1細胞在含有10%胎牛血清的培養基中常規貼壁培養，用0.25%胰蛋白酶常規消化，擴增傳代后進行分組干預，具體如下：對照組用不含菌株和藥物的培養基處理；Hp組在培養基中加入Hp菌液，使細胞與細菌比例達到1∶100；miR-NC組轉染NC序列；miR-106b-5p組轉染miR-106b-5p模擬物；miR-NC+Hp組轉染NC序列的同時在培養基中加入Hp菌液(細胞與細菌比例為1∶100)；miR-106b-5p+Hp組轉染miR-106b-5p模擬物的同時在培養基中加入Hp菌液(細胞與細菌比例為1∶100)。每組均連續干預24 h，設置5次重復。

1.4.3MTS法檢測細胞活力 TE-1細胞接種在96孔培養板內，分組干預24 h后采用MTS法進行細胞活力的檢測，按照試劑盒說明書在每個培養孔內加入20 μL檢測液，繼續培養4 h后在酶標儀上檢測吸光度值(A)490。

1.4.4流式細胞術檢測細胞周期 TE-1細胞接種在培養皿內，分組干預24 h后用胰蛋白酶消化收集細胞，取5×105個細胞與10 μL PI溶液混合，染色后在流式細胞儀上進行細胞周期分析，計算G0/G1期、S期、G2/M期的比例。

1.4.5熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)法檢測miR-106b-5p的表達水平 取食管癌組織及分組干預24 h后的TE-1細胞，采用miR提取試劑盒提取組織及細胞中的miR，采用miR cDNA第一鏈合成試劑盒將miR反轉錄為cDNA，采用miR熒光定量檢測試劑盒對cDNA中的miR-106b-5p表達水平進行檢測，檢測的體系參照試劑盒進行配制，分別使用miR-106b-5p引物(上游引物序列：5′-TATGCGTAGCTTAGCTAT-3′；下游引物為試劑盒內通用引物)和U6引物(上游引物序列：5′-ACTATGCTATATGCTAGCT-3′；下游引物序列：5′-TATCGTAGCTAGTATAC-3′)。檢測程序為95 ℃預變性3 min，95 ℃15 s、60 ℃34 s，重復40個循環，程序結束后生成循環曲線及循環閾值(Ct)，以U6為內參，代入2-ΔΔCt計算miR-106b-5p的表達水平。

1.4.6免疫印跡法檢測CCND1表達水平 取食管癌組織及分組干預24 h后的TE-1細胞，采用免疫印跡法進行細胞活力的檢測，裂解細胞得到蛋白后，將蛋白加入到聚丙烯酰胺凝膠中并按照Western blot流程進行電泳、電轉膜、封閉、孵育一抗及二抗，最后在凝膠成像系統內顯影得到CCND1、β-actin的蛋白條帶，掃描條帶的灰度值，以β-actin為內參，計算CCND1的表達水平。

1.4.7雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-106b-5p靶向CCND1 TE-1細胞接種在24孔培養板內，將CCND1的雙熒光素酶報告基因轉染至細胞內，然后按照miR-NC組和miR-106b-5p組的干預方式分別轉染NC序列和miR-106b-5p模擬物，48 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測系統對細胞中的螢火蟲熒光活力及海腎熒光活力進行檢測，計算報告基因的熒光活力，熒光值=螢火蟲熒光活力/海腎熒光活力。

2 結 果

2.1Hp陽性及陰性的食管癌組織中miR-106b-5p、CCND1表達水平的比較 共收集46例食管癌患者食管癌組織，其中Hp陽性33例，Hp陰性13例。Hp陽性患者與Hp陰性患者年齡及性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。Hp陽性患者食管癌組織中miR-106b-5p的表達水平低于Hp陰性患者，CCND1的表達水平高于Hp陰性患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 Hp陽性及陰性患者一般資料及食管癌組織中miR-106b-5p、CCND1表達水平比較

圖1 Hp陽性及陰性的食管癌組織中CCND1的

2.2食管癌組織中miR-106b-5p與CCND1表達水平的相關分析 Pearson相關分析結果顯示，食管癌組織中miR-106b-5p的表達水平與CCND1的表達水平呈負相關(r=-0.414，P=0.004)。

2.3Hp感染對TE-1細胞增殖及細胞周期的影響 Hp組的A490水平及S期、G2/M期比例高于對照組，G0/G1期比例低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 Hp組與對照組A490與細胞周期比例比較

注：A為對照組；B為Hp組。

2.4Hp感染對TE-1細胞中miR-106b-5p、CCND1表達水平的影響 Hp組TE-1細胞中miR-106b-5p的表達水平低于對照組，CCND1的表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 Hp組與對照組TE-1細胞中miR-106b-5p、CCND1表達水平比較

圖3 Hp組與對照組TE-1細胞中CCND1的免疫印跡圖

2.5TE-1細胞中miR-106b-5p靶向CCND1 miR-106b-5p組TE-1細胞中野生型CCND1報告基因的熒光值低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。miR-106b-5p組TE-1細胞中突變型CCND1報告基因的熒光值與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 miR-106b-5p組與對照組CCND1報告基因熒光值比較

2.6過表達miR-106b-5p對Hp感染TE-1細胞中CCND1表達的影響 miR-NC+Hp組TE-1細胞中miR-106b-5p的表達水平低于miR-NC組，CCND1的表達水平高于miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)；miR-106b-5p+Hp組TE-1細胞中miR-106b-5p的表達水平高于miR-NC+Hp組，CCND1的表達水平低于miR-NC+Hp組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5、 圖4。

表5 miR-NC+Hp組、miR-NC組和miR-106b-5p+Hp組 miR-106b-5p、CCND1表達水平比較

圖4 miR-NC+Hp組、miR-NC組和miR-106b-5p+Hp組CCND1的免疫印跡圖

2.7過表達miR-106b-5p對Hp感染TE-1細胞增殖及細胞周期的影響 miR-NC+Hp組TE-1細胞的A490水平及S期、G2/M期比例高于miR-NC組，G0/G1期比例低于miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)；miR-106b-5p+Hp組TE-1細胞的A490水平及S期、G2/M期比例低于miR-NC+Hp組，G0/G1期比例高于miR-NC+Hp組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6、圖5。

表6 miR-NC+Hp組、miR-NC組和miR-106b-5p+Hp組A490及細胞周期比例比較

注：A為miR-NC組;B為miR-NC+Hp組；C為miR-106b-5p+Hp組。

3 討 論

Hp是一種在胃黏膜內定植的微需氧革蘭陰性菌，國內姜紅梅等[4]和陶茂淮等[3]通過橫斷面研究證實食管癌組織中Hp的感染率高于食管炎組織、食管不典型增生組織，且Hp感染與食管癌的惡性程度有關。POLYZOS 等[9]及LV等[10]的研究結果表明Hp感染是食管癌發病的危險因素之一。DOORAKKERS等[11]通過隊列研究證實根除Hp能明顯降低食管癌的發病風險。以上結果表明Hp感染與食管癌發病有關，但尚缺乏Hp感染促進食管癌發生、發展的直接細胞實驗證據。

胃癌相關的細胞實驗研究結果表明， Hp感染胃癌細胞或Hp脂多糖刺激胃癌細胞均可促進胃癌細胞的增殖、加速胃癌細胞的細胞周期進程[12-13]。本研究進行了Hp感染食管癌TE-1細胞的實驗，與未感染Hp的對照組TE-1細胞比較，Hp組TE-1細胞的增殖增強，細胞周期S期、G2/M期比例增加，表明Hp感染促進了食管癌細胞的增殖，同時加速了細胞周期進入S期和G2/M期。在此基礎上，本研究繼續深入探討Hp感染促進食管癌細胞增殖的分子機制。

CCND1是調控細胞周期進程的關鍵蛋白，在食管癌、胃癌、結直腸癌等消化道惡性腫瘤中均呈高表達，且與腫瘤的病理進展、預后不良有關[14-16]。目前，研究認為具有抑癌作用的miR-106b-5p是CCND1潛在的上游調控分子，食管癌中miR-106b-5p表達降低會削弱其靶向抑制CCND1表達的作用，進而使CCND1表達增加、細胞周期加速、細胞增殖增強[15]。本研究在手術切除的食管癌組織中檢測了miR-106b-5p、CCND1的表達及Hp的感染情況，與Hp陰性食管癌組織比較，Hp陽性食管癌組織中miR-106b-5p的表達水平降低，CCND1表達水平增加，且miR-106b-5p與CCND1的表達呈負相關，表明Hp感染可能通過調控miR-106b-5p/CCND1途徑參與食管癌的發生、發展。因此，本研究在細胞實驗中進一步以miR-106b-5p靶向調控CCND1為基礎，探討Hp感染促進食管癌發生、發展的機制。

本研究結果顯示，在Hp感染的食管癌TE-1細胞中miR-106b-5p的表達水平降低、CCND1表達水平增加，與Hp感染的食管癌組織中miR-106b-5p及CCND1的變化趨勢一致。同時本研究還通過雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-106b-5p組野生型CCND1報告基因的熒光值降低，表明miR-106b-5p直接靶向調控CCND1，與食管癌組織中miR-106b-5p表達與CCND1呈負相關的結果吻合。miR-106b-5p的抑癌作用已經在多種惡性腫瘤細胞中得到證實[17-18]，本研究進一步探討了miR-106b-5p在Hp感染促進食管癌細胞增殖及細胞周期進程中的作用。在Hp感染的同時轉染miR-106b-5p的模擬物，逆轉Hp抑制miR-106b-5p表達的作用后，CCND1的表達水平降低，細胞增殖減弱，細胞周期G0/G1期的比例增加，表明過表達miR-106b-5p削弱了Hp對食管癌細胞的調控作用，抑制了細胞增殖，使細胞周期停滯于G0/G1期并下調CCND1的表達水平。這也提示Hp感染對食管癌細胞的調控作用與其調節miR-106b-5p及CCND1的表達有關。

綜上所述，Hp感染食管癌細胞后促進細胞增殖、加速細胞周期，這一作用與調控miR-106b-5p/CCND1途徑有關。Hp感染能夠抑制miR-106b-5p表達，削弱miR-106b-5p對CCND1的靶向抑制作用，進而使CCND1表達增加、細胞周期加速。