阿拉善蒙古牛超數排卵及胚胎冷凍試驗

孟克巴依爾，朱莉仙*，其其格，聶 慧，艾爾青薩仁高娃，烏力吉，朝克圖

（1.阿拉善盟畜牧獸醫技術推廣中心，內蒙古 阿拉善 750300； 2.阿拉善左旗吉蘭泰鎮綜合保障和技術推廣中心，內蒙古 阿拉善 750333）

蒙古牛是我國北方優良牛種之一。蒙古牛具有乳、肉、役多種用途，適應性和抗逆性強，是我國珍貴的遺傳資源。近年來，由于草原牧區家畜牛雜交改良，純種蒙古牛數量和品質大幅下降。目前純種蒙古牛主要分布在阿拉善盟，錫林郭勒盟和呼倫貝爾市有少量分布，其余地區已不復存在。蒙古牛數量的減少使品種內的遺傳距離變得越來越窄，近親繁殖已經不可避免，甚至出現退化現象，蒙古牛已經處于瀕危維持狀態，應當大力加強保護和發展。2021年4月阿拉善左旗綠森種牛場通過國家級保種場的現場驗收。

目前，阿拉善蒙古牛保種最經濟有效的方法是建立阿拉善蒙古牛的胚胎基因庫，關鍵技術是胚胎冷凍保存，但有關阿拉善蒙古牛胚胎冷凍的相關研究鮮見報道。為了有效保護好阿拉善地方蒙古牛品種優質資源，我們嘗試通過在阿拉善盟內選擇優秀的蒙古牛公牛和母牛，采集精液，利用現代胚胎技術，通過供體母牛超數排卵、采集胚胎等一系列生物技術而達到生物基因保種的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供體牛的選擇

在阿拉善盟內養殖蒙古牛的牧戶家，選擇阿拉善蒙古牛7頭（編號200002，200004，200010，200016，200022，200024，200026）和2頭優質成年種公牛（200001，200003）作為供體牛。選擇的2頭種公牛，年齡均超過4歲，體格健壯，性能力正常。所有供體牛體格健壯，無傳染性疾病、生殖系統疾病等，經產母牛沒有空胎史，繁殖機能正常。

1.1.2 實驗藥品與器材

（1）實驗藥品

黃體酮陰道緩釋劑（CIDR），新西蘭DEC進口，規格黃體酮1.38g；

垂體促卵泡素（FSH），國產寧波三生，規格500單位；

氯前列醇注射液（PG），國產上海計勝，規格2ml：0.2mg；

促黃體素釋放激素A3，國產寧波第二激素廠，規格25μg/支；

沖胚液，美國ICP進口，規格1L；

保存液（Holding Solution），美國ICP進口，規格100ml；

冷凍液（乙二醇 1.5M），美國ICP進口，規格20ml；

鹽酸利多卡因注射液，國產山東華魯制藥，規格5ml：0.1g。

（2）實驗器材

顯微鏡，OLYMPUS；

胚胎冷凍儀，澳大利亞 CRYOLOGIC；

保定架、移植槍、滅菌塑料硬外套及軟外套、三通導管、剪毛推子、沖胚器（50ml注射器）、集卵杯等。

1.2 方法

1.2.1 母牛干乳

供體母牛產犢后，7d后斷乳，干乳，具體干乳時間見表1 。

表1 供體母牛干乳

1.2.2 超排處理

7頭母牛超排處理使用CIDR+FSH+PG方法，見表2。

表2 母牛超排處理方法（FSH是7頭母牛平均超排注射量）

1.2.3 母牛人工授精

母牛與公牛采取隔離狀態，觀察確定母牛的發情時間。選擇200001號種公牛人工授精。采用電刺激法采集精液，精液采集完鏡檢合格后裝0.5ml細管7支，避光。一般情況下，每隔12h授精一次，每次輸精一支，共授精3次。

1.2.4 胚胎采集

供體母牛受精日計0d，輸精第7d采集胚胎，沖胚之前，所用的儀器、器皿等經過嚴格的消毒滅菌處理，采用二路沖卵管法進行非手術沖卵。

首先將牛保定，用2%的利多卡因實行尾椎硬膜外麻醉，利多卡因用量5～10ml，直至尾部無知覺。麻醉后將牛尾固定，清除糞便，清洗、消毒會陰部及外陰。

用擴宮棒擴張子宮頸，然后插入宮頸粘液器將粘液抽出，隨后把帶剛芯的沖卵管慢慢插入陰門，達到子宮角前端。沖卵管先沖一定氣量10～20ml，最后抽出內芯。

連接沖胚和三通導管。用50ml注射器吸取沖胚液從輸入管注入子宮角，然后吸回，一般情況下一側子宮角需沖6～8次，用300～400ml沖胚液。沖卵完成后，將氣囊空氣放出，沖卵管抽至子宮體，灌注青霉素、鏈霉素藥物預防子宮炎。

1.2.5 胚胎處理及冷凍保存

胚胎處理：將回收液緩慢倒入集卵杯內，用帶針頭的一次性注射器抽取沖胚液，沖洗集卵杯濾網3～4次，最后保留10ml左右液體倒入Ф100mm培養皿中，進行鏡檢。劃分區域檢查、避免遺漏。用移液器將檢出胚胎移至盛有保存液的Ф35mm培養皿中。同一供體牛的胚胎放于同一培養皿液滴中，然后用移液器先吸入少量第二滴保存液到第一液滴，吸入全部胚胎，防止吸入黏液、雜質，移至第二滴中，一次沖洗胚6～8次。

胚胎裝管：即五段液體、四個氣泡。細管塞上需記錄好胚胎明細：供體牛號、胚胎數量、質量、日期等。裝管后平衡10min左右。

胚胎冷凍：先將冷凍室內加少許液氮預冷，預冷后加入足量液氮，將裝有胚胎的細管放入冷凍室，至制冰溫度時，平衡，進行植冰，70min后，將胚胎細管投入液氮保存。

2 結果

2.1 超排效果

選擇7頭阿拉善蒙古牛母牛進行超排，共采卵7頭次，采集卵數12枚，其中4枚可用胚胎，具體見表3。

表3 阿拉善蒙古牛母牛超排效果

2.2 胚胎形態學

3頭供體母牛的胚胎形態如圖1，經鑒定，胚胎等級見表2。

圖1 供體母牛胚胎形態

3 討論

3.1 影響超排效果可能的因素

影響超數排卵效果因素很多[1]。供體牛的營養情況也是影響超排反應的一種重要因素，因為營養狀態優良的供體牛，其卵巢功能好，排卵多，而營養狀態較差的牛排卵較少影響超排反應[2]。Prakash 等[3]研究表明，供體體況對于超排反應具有重要的影響，體況差的牛導致并加劇黃體的早期退化（發情后 6～8 h），嚴重影響超排效果，退化嚴重時，甚至無法得到胚胎。

研究表明，季節和環境的變化會顯著影響超排效果[4]。即使在同一季節、氣候條件、營養水平不同，動物的感受刺激也不盡相同，它們影響動物的超排效果[4]。一般的說，嚴寒、酷熱均對家畜造成應激，這些極端刺激對生理的不良影響會作用于生殖內分泌軸，繼而影響到發情和排卵[5]。

在生產實踐中，如用經產母牛作為供體，一定要嚴格選擇并了解經產牛的產犢歷史、胎衣排出情況及產犢時間，同時了解經產牛的胎次及年齡，調整FSH的劑量，這在超排實踐中非常重要[6]。實踐證明，產犢后3個月的母牛超排才能達到理想的效果[6]。

與吳柱月等報道[7]：“（包括西門塔爾、短角牛、Lowlone 牛）的超排效果：頭均可用胚胎數：青年牛為5.9～7.2枚，經產牛為5.8～7.5枚，”相比之下，阿拉善蒙古牛的超排效果很差，這是否與蒙古牛品種有關還是使用的藥品原因？以及種公牛人工授精的效果有差異？阿拉善蒙古牛母牛的超排尚未見有報道。牛的超數排卵是一個復雜的生理過程，受很多因素的影響：包括品種、生物學特性、年齡、季節、時間、FSH品牌及劑量、卵巢狀態、超排方法及飼養管理水平等等因素的影響[8]。阿拉善蒙古牛的超排效果是否就是現在試驗的效果，有待進一步的實驗研究。