一種快速評價小反芻獸疫疫苗效果方法建立

閆修陽，毛愛民，鄭硯超，馮嘉林，韓奇宏，陸宇超，金嘉旻

（1.無錫中德伯爾生物技術有限公司，江蘇 無錫 214174； 2.無錫市水產畜牧技術推廣中心，江蘇 無錫 214026）

小反芻獸疫（ Peste des petits ruminants，PP R）是由小反芻獸疫病毒（ Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一種急性病毒性傳染病，主要感染山羊和綿羊。以高熱、口炎、胃炎、腹瀉和肺炎為特征。該病一年四季均可發生，易感羊群的發病率和病死率最高可達90%以上，該病是OIE法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。近年被納入國家動物強制免計劃，由各級畜牧獸醫主管部門具體組織實施。由于疫苗的種類，羊的個體差異等疫因素其注射疫苗后產生抗體能否達到保護作用濃度，需要進行檢測；目前檢測手段為Elisa方法；本文對一種快速檢測試紙條的制備，及其性能與Elisa試劑盒進行了比對。

1 材料與方法

1.1 試紙條制備

1.1.1 試紙條制備所用試劑

小反芻獸疫蛋白、金標復溶液：中德生物自產；羊抗兔二抗、兔抗：南京梓軒生物；氯金酸（HAuCl4）：分析純，美國Sigma公司；檸檬酸三鈉：分析純，國藥集團；牛血清白蛋白（BSA）：分析純，賽寶生物；其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；PVC底板、NC膜、金標墊、樣品墊、吸水墊：上海捷寧生物科技有限公司。

1.1.2 膠體金制備

稱取1.0 g氯金酸（HAuCl4），用超純水溶解后定容成1%的水溶液，0.45μm過濾后于4℃避光存放備用。稱取1.0g檸檬酸三鈉，用超純水溶解后定容成1%的水溶液，0.45μm過濾后于4℃避光存放備用。在磁力攪拌下，將2ml 1%氯金酸加入200ml的蒸餾水中加熱至沸騰，再向溶液中迅速加入2.7 ml檸檬酸三鈉，繼續加熱5min待溶液變為酒紅色[1]。將溶液放置室溫使其自然冷卻，用分光光度計、電鏡掃描等，計算金膠體金顆粒直徑。

1.1.3 膠體金偶聯蛋白

用上述制備的膠體金分別偶聯兔抗、小反芻獸疫蛋白，其過程包括：最適pH、最佳蛋白偶聯濃度的確定；將制備好的金標偶聯物以合適的噴金量，用噴金儀進行噴金于金標墊上，37℃干燥2h備用。

1.1.4 NC膜制備

以小反芻獸疫抗原作為NC膜上的檢測線（T線），羊抗兔二抗作為質控線（C線），用PBS緩沖液（pH7.4，0.01mol/L，1% 甲醇）稀釋20倍（濃度為1.0 mg/ml），用噴膜儀以噴量1.0μl/cm噴于NC膜上；在檢測線上5mm處以噴量1.0μl/cm噴涂羊抗兔二抗（0.07mg/ml），將包被好的NC膜置于37℃干燥2h備用。

1.1.5 樣本墊、金墊制備

將樣品墊置于含1%BSA、2%葡萄糖、pH8.0、0.1mol/L 的Tris緩沖液中浸泡2分鐘，取出后50 ℃干燥2 h備用；將金標墊置于含3%蔗糖、0.5%BSA、pH7.4、0.2mol/L的PBS緩沖液中均勻浸濕5分鐘，50℃干燥2h后備用。

1.1.6 試紙條制備

把NC膜、金標墊、樣品墊、吸水墊貼在PVC底板上，使樣品墊與金標墊重合0.2cm（長度方向上），金標墊與NC膜重合0.2cm（長度方向上），NC 膜與吸水墊重合0.3cm（長度方向上），組裝并切割成條。

1.1.7 試紙條靈敏度評價

將上述制備好的試紙條進行性能測試，性能需達到檢測稀釋液時，只出現C線；檢測陰性樣本時，只出現C線；檢測陽性樣本（疫苗免疫成功，抗體達到一定濃度）出兩條線。

1.1.8 試紙條批內差異

取同個批號的試紙條，取不同塊大板的前、中、后各10條卡，測試同一個陽性樣本，肉眼觀察檢測卡T、C線顯色均勻且一致，用掃描儀對色度進行量化，T、C的CV值分別在5.8%、6.2%；批內差異較小。

1.1.9 試紙條批間差異

取3個批號的試紙條，每批號各取10卡平行，測試同一個陽性樣本，檢測結果，30卡T、C線顯色均勻且無明顯差異，用掃描儀對色度進行量化，T、C的CV值分別在6.0%、6.5%；批間差異較小。

1.1.10 試紙條穩定性數據

穩定性對于任何一種試紙條而言都是重要的性能參數，為了更好地測定實驗研制試紙條的穩定性，采用將試紙條保存于室內常溫25℃、烘箱50℃加速老化，每隔5d進行一次檢測，監控一個月，同時將不同時間測試的數據進行保存比較，觀察性能變化情況；一個月后對檢測卡進行檢測，其性能可以達到第一天的效果，測試與第0天相同樣本，T線有8.7%下降，C線有9.2%下降。穩定性能穩定。

2 Elisa試劑盒信息

小反芻試劑盒：廠家ID.VET 批號：2021.06.10

3 血清樣品信息

血清樣本由無錫動衛所提供。

4 結果及分析

用制備的膠體金檢測卡，測試動衛所收集的91份血清；同時用ID.VET小反芻ELISA試劑盒對這91份血清進行測試；將兩者測試結果進行比對，觀察吻合效果；膠體金測試結果，陰性為只有C線，陽性有T、C兩條線，結果如圖1、圖2、圖3；Elisa測試結果如表1。

表1 Elisa測試結果

圖1 膠體金測試結果1

圖2 膠體金測試結果2

圖3 膠體金結果3

結果：共測試了91份樣本，膠體金的結果與小反芻ID.VET ELISA試劑盒結果吻合度較高可以達到98.9%（90/91），其中一份判讀不吻合的樣本，ELisa結果為疑似樣本，膠體金檢測卡判讀陰性。

5 結論

膠體金檢測卡與ELisa結果吻合度較高，可初步替代ELisa進行測試；性能基本吻合的情況下，膠體金可體現出，檢測時間短，操作簡單，不需要儀器設備等較多優點，后續可以繼續增加大量樣本測試。

鑒于Elisa試劑盒測試出的可疑樣本，膠體金測試出的弱陽性樣本，對此類樣本建議重復測試，一旦結果依舊為疑似樣本，或者弱陽性樣本，建議加強免疫等增加免疫抗體。