乳清濃縮蛋白與卵清蛋白復合膜的制備及其性能

張夢媛，王千一，蒲雪麗，妥彥峰，牟光慶，姜淑娟

（大連工業大學食品學院，遼寧大連 116034）

合成包裝材料造成的環境污染促使了新型環保材料的發展，生物聚合物薄膜和涂層因其可生物降解性而受到越來越多的重視[1]。可食性薄膜作為食品包裝材料，可以延緩食品劣變，從而提高食品質量，延長保質期[2]。

乳清濃縮蛋白（WPC）主要通過氫鍵、二硫鍵與其他分子的相互作用來維持其特征結構[3]，具有良好的成膜性能、優異的阻氣性能和兩親性等功能特性，已成為一種很有前途的生物基聚合物。卵清蛋白（EWP）營養豐富具有很好的成膜性，形成的膜具有較好的透光性[4]。但因蛋白基膜的機械性能和阻隔性能較差，常用化學[5]、物理[6]、酶法[7]改性。趙曉彤等[8]以大豆分離蛋白為成膜材料，添加聚乙烯醇和納米纖維素，輔以超聲處理制備的復合膜阻隔性能和機械性能提高。Zhang等[9]通過美拉德反應將木糖糖基化，制備了面筋/玉米醇溶蛋白納米纖維膜，結果表明糖化后的復合膜由于分子間的纏結和高分子鏈之間的相互作用增強，水蒸氣透過率降低，網絡結構更加致密。轉谷氨酰胺酶（TG）能誘導谷氨酰胺的酰胺基和賴氨酸的氨基發生共價交聯。Fernandez-Bats等[10]以豌豆蛋白為原料，經TG酶交聯，添加二氧化硅納米顆粒制備復合膜，研究結果發現，添加TG酶后提高了薄膜對氣體和水蒸氣的阻隔作用。Rossi等[11]添加TG酶制備乳清蛋白/果膠復合膜，發現添加TG酶后可有效防止鮮切蘋果和馬鈴薯在貯藏10 d內腐爛。

課題組前期研究中以WPC和EWP為成膜基質、添加TG酶（5 U/g蛋白）處理，成功制備出性能較好的WPC/EWP復合膜。因此，本研究進一步深入研究WPC和EWP質量比、膜液pH、甘油添加量對WPC/EWP復合膜的機械性能、阻隔性能和微觀結構的影響，以期為WPC/EWP復合膜的實際開發應用提供理論與技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清濃縮蛋白 食品級，德國米萊乳品公司；蛋清蛋白 食品級，美國Sigma-Aldrich公司；轉谷氨酰胺酶 食品級，江蘇一鳴生物制品有限公司；甘油分析純，天津市大茂化學試劑廠。

V-100D可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；TA-XT plus質構儀 英國 Stable Micro System公司；JSM-7800F場發射掃描電子顯微鏡日本電子株式會社；Spectrum10傅里葉變換紅外光譜儀 美國Perkin Elmer公司；SL200KB接觸角分析儀 美國Kino公司；Binder KBF115恒溫恒濕箱德國Binder有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膜制備方法 用WPC和EWP為基準，按質量比（g/g）混合后使用超純水進行制備，使WPC和EWP在水中的質量分數為8%，并磁力攪拌至完全溶解，在4 ℃冰箱放置過夜。溶液放置室溫后將5 U/g蛋白的TG酶添加到混合液中，在50 ℃下孵育2 h。反應后，80 ℃水浴10 min并冷卻至室溫[12]。以蛋白質質量為基準，在成膜溶液中添加甘油作增塑劑，在25 ℃下磁力攪拌1 h后，量取9 mL溶液立即澆鑄在塑料平皿（90 mm×90 mm）上，于30 ℃、相對濕度為50%的恒溫恒濕箱中烘干成膜12 h。揭膜后在25 ℃、相對濕度50%條件下回軟24 h，備用。

1.2.2 不同底物質量比復合膜的制備 改變WPC和 EWP 質量比（1:0、3:1、1:1、1:3、0:1），將成膜液pH調到7，以蛋白質量計添加45%的甘油，其余條件不變，按照1.2.1的方法制備復合膜。

1.2.3 不同膜液pH復合膜的制備 以WPC和EWP質量比為1:3（g/g）制備膜液，將膜液調為不同的pH（6、7、8、9、10）以蛋白質量計添加 45% 的甘油，其余條件不變，按照1.2.1的方法制備復合膜。

1.2.4 不同甘油添加量復合膜的制備 以WPC和EWP質量比為1:3（g/g）制備膜液，將膜液調為8，添加不同的甘油添加量（25%、35%、45%、55%、65%）（以蛋白質量計），其余條件不變，按照1.2.1的方法制備復合膜。

1.3 性能測定方法

1.3.1 膜厚度 使用靈敏度為0.001 mm的數顯千分尺隨機確定薄膜厚度[13]。在薄膜表面隨機取5個測量薄膜厚度，最終厚度被視為5次測量的平均值。

1.3.2 掃描電子顯微鏡 用掃描電子顯微鏡（SEM）在20 kV加速電壓下觀察了薄膜的表面結構[12]。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜 在4000～400 cm-1范圍內使用衰減全反射紅外光譜對膜樣品進行掃描[14]，光譜在4 cm-1分辨率下獲得。

1.3.4 機械性能 薄膜的拉伸強度（TS）和斷裂伸長率（EAB）通過一些修改[15]來適應樣品。采用TAXT Plus質地分析儀的A/TG探針分析。膜被切割成40 mm長和10 mm寬的樣品進行測試。

1.3.5 透光率 根據Jiang等[12]的研究結果，采用比色法測定薄膜的透光率。將膜裁剪成比色皿規格（1.0×4.0 cm）的條狀，緊貼在比色皿內側，用空比色皿作對照，在600 nm下測定膜的透光率。

1.3.6 水蒸氣透過率 對Jiang等[16]的方法進行修改后，在25 ℃、50% RH的恒溫恒濕箱中測量薄膜的水蒸氣透過率（WVP），每2 h記錄稱量瓶重量的變化，時長10 h，結果用g·s-1m-1Pa-1表示。

1.4 數據處理

每項測定至少重復三次。數據用均值±標準差表示，用SPSS 25軟件進行方差分析（ANOVA）和用Duncan's顯著性分析，用Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 WPC和EWP質量比對復合膜結構和性能的影響

薄膜的微觀結構以及結構中可能存在的間隙和裂紋采用掃描電子顯微鏡技術研究。五種膜的表面形態圖如圖1所示，從圖1中可以看出，WPC單一膜表面有較多孔隙和少量裂縫產生，EWP單一膜有少量聚集體，而當WPC和EWP質量比為1:1和1:3時，WPC/EWP復合膜的表面比 WPC單一膜和EWP單一膜表面光滑且沒有縫隙，結構致密，表明WPC和EWP具有很好的相容性，能夠有效阻止水蒸氣的透過。在Dong等[17]的研究中發現，利用蛋清蛋白對小麥面筋蛋白改性后，復合膜的表面比小麥面筋單一膜光滑。

圖1 不同底物質量比復合膜的表面結構圖（1000×）Fig.1 Surface structure of composite films with different substrate mass ratios (1000×)

紅外光譜對薄膜的理化性質有直接影響，反映了薄膜中聚合物之間的相互作用，如圖2所示。出現在3300～3200 cm-1的峰屬于O-H的伸縮振動，受分子內和分子間氫鍵的影響。在2950～2900 cm-1的峰和C-H的伸縮振動有關。在1700～1600 cm-1范圍內的峰是酰胺1帶中C=O的伸縮振動，和蛋白質二級結構相關。在1550～1500 cm-1范圍內的峰是酰胺Ⅱ帶中N-H的彎曲振動[18]。與WPC單一膜相比，隨著EWP的加入，WPC/EWP膜的O-H帶、CH帶及酰胺Ⅰ帶的吸收峰向高波數移動，而酰胺Ⅱ帶的吸收峰向低波數移動。這說明振動基團所需的能量增加，復合膜基團之間更加穩定和相容[19]。和復合膜抗拉強度增加的結果一致，膜的表面結構也更加致密。從圖2中可以看出紅外光譜沒有檢測到復合膜官能團的顯著變化，這支持了之前的觀點，非共價相互作用（例如氫鍵和范德華力）被認為是膜組分連接的主要驅動力[20]。

圖2 不同底物質量比復合膜的紅外結構圖Fig.2 Infrared structure of composite films with different substrate mass ratios

表1為WPC和EWP質量比對復合膜厚度、水蒸氣透過率、透光率、抗拉強度和斷裂伸長率的影響。在可食膜的制備過程中，成膜材料的質量比對復合膜的厚度有較大影響[21]。如表1所示，隨著EWP質量的增加，各組之間膜的厚度無明顯的變化規律，但隨著EWP的增加復合膜的厚度略微下降。隨著EWP含量的增加，WPC/EWP復合膜的抗拉強度和斷裂伸長率均呈現先增加后下降的趨勢。當WPC和EWP質量比為1:3時，WPC/EWP復合膜的抗拉強度為3.46 MPa，斷裂伸長率為129.87%，達到最大值（P＜0.05）。這是由于加熱使蛋白質分子內部的二硫鍵、氫鍵等暴露出來[22]，在TG酶的催化作用下，蛋白鏈間發生更強烈的作用，分子間作用增強，形成了更加致密的網絡結構，進而導致了WPC/EWP復合膜抗拉強度和斷裂伸長率的增加。Huang等[23]研究發現，隨著蛋清蛋白質量的增加，蛋清蛋白/κ-卡拉膠的抗拉強度下降，斷裂伸長率呈現先增加后減小的趨勢，原因是蛋清蛋白的加入改變了復合膜的空間結構[24]。從表1中可以看出，與 WPC和EWP單一膜相比，復合膜的透光率達到最大值為72.2%（P＜0.05），說明 WPC和 EWP在比例為 1:3時相容性較好。

表1 WPC/EWP質量比對復合膜阻隔性能和機械性能的影響Table 1 Effects of WPC/EWP mass ratio on barrier and mechanical properties of composite films

膜的水蒸氣透過率隨著EWP質量的增加呈現先下降后上升的趨勢，且在WPC和EWP質量比為1:3時，復合膜的水蒸氣透過率達到最小值（2.72×10-10/g·s-1m-1Pa-1）（P＜0.05）。原因可能是隨著EWP含量的增加，WPC和EWP之間形成了靜電相互作用，促進了電荷的抵消[25]。當WPC和EWP質量比為1:3時，由上述電鏡圖可知WPC/EWP復合膜結構致密，表現出更好的疏水特性，進而限制了聚合物鏈的遷移降低了水蒸氣透過率。在Tavares等[25]研究中發現，在乳清分離蛋白中加入殼聚糖后，復合膜的水蒸氣透過率降低。

2.2 膜液pH對WPC/EWP復合膜結構和性能的影響

圖3是不同成膜液pH對WPC/EWP復合膜表面結構的影響。從圖中可以看出，當成膜液pH為6時，復合膜表面有較大聚集體產生且復合膜表面不光滑，原因可能是此pH接近蛋白質的等電點[26]，導致蛋白質變性嚴重，進而在膜干燥過程中產生了較大的聚集體。隨著成膜液pH的增加，WPC/EWP復合膜表面的聚集體減少且逐漸光滑，當pH為9時，WPC/EWP復合膜的表面最光滑且無孔隙。

圖3 不同成膜液pH復合膜的表面結構圖（1000×）Fig.3 Surface structure of composite films with different pH of film-forming solutions (1000×)

成膜液的pH可以影響蛋白質表面電荷進而影響了蛋白質分子之間的相互作用以及膜的性能[27]。表2是成膜液pH對WPC/EWP復合膜厚度、水蒸氣透過率、透光率、抗拉強度及斷裂伸長率的影響。

從表2可以看出，成膜液pH對WPC/EWP復合膜的厚度影響較小，但在成膜液pH為8時，復合膜的厚度達到最小值為0.167 mm。WPC/EWP復合膜的抗拉強度和斷裂伸長率隨著成膜液pH的增加呈現先增加后下降的趨勢，當成膜液pH為8時，WPC/EWP復合膜的抗拉強度為1.88 MPa，斷裂伸長率為182.86%。當pH增加到8后，蛋白質的電荷發生改變，蛋白質暴露出更多的疏水或巰基等活性基團[27]，使WPC和EWP的相互作用增大。然而成膜液pH繼續增大到9和10后，由于蛋白質的堿水解作用和TG酶的活性下降，破壞了復合膜的致密結構，使蛋白質的網絡結構疏散，進而造成了抗拉強度和斷裂伸長率的降低以及水蒸氣透過率的增大。

由表2可知，WPC/EWP復合膜的透光率隨成膜液pH的增加沒有明顯變化趨勢，但當pH為8時，復合膜的透光率為73.0%為最大值（P＜0.05），表明WPC和EWP具有較好的相容性。在張軒等[26]的研究中發現了相似的結果。WPC/EWP復合膜的水蒸氣透過率隨著pH的增加呈現先減少后增加的趨勢，當成膜液pH為8時，WPC/EWP復合膜的水蒸氣透過率最小（2.99×10-10g·s-1m-1Pa-1）。說明在此 pH，WPC和EWP具有較強的相互作用，形成了致密的網絡結構，有效阻止了水分子的滲透。然而在辛穎等[28]的研究中發現，成膜液pH對乳清蛋白膜的水蒸氣透過率沒有顯著影響，但透氧率呈現先減少后增加的趨勢。

表2 pH對WPC/EWP復合膜阻隔性能、機械性能的影響Table 2 Influence of pH on barrier and mechanical properties of WPC/EWP composite films

2.3 甘油添加量對復合膜性能的影響

在增塑劑存在的情況下，蛋白質的熱處理會導致蛋白質的展開、不可逆變性和相互作用，形成蛋白質和增塑劑的復雜固體網絡[29]。由于蛋白質分子鍵的剛性作用，膜較脆，常添加甘油來改變膜的特性。從表3可以看出，WPC/EWP復合膜的厚度隨著甘油添加量的增加呈現增大的趨勢，而WPC/EWP復合膜的抗拉強度隨著甘油添加量的增加由2.65 MPa下降至0.66 MPa，而斷裂伸長率呈現一個增加的趨勢，當甘油添加量為55%時，復合膜的斷裂伸長率達到185.09%。甘油添加到大分子聚合物中，形成氫鍵，減少分子內部的氫鍵作用，同時削弱了蛋白質分子間的范德華力，分子鏈之間的空隙增加，軟化了復合膜的剛性結構，柔韌性增加進而使膜的斷裂伸長率增加[30]。在制備條件對大豆分離蛋白-淀粉復合膜機械性能的影響中發現了相似的趨勢[31]。復合膜的透光率隨著甘油添加量的增加呈下降趨勢，在Huntrakul等[32]的研究中發現添加甘油作為增塑劑的膜有較低的透光率。

由表3可知，水蒸氣透過率隨甘油添加量的增加呈現增大的趨勢，這是由于添加甘油后，成膜基質內的分子變得比較柔軟，分子內非結晶區增多，自由度變大，導致水蒸氣容易透過薄膜。當甘油添加到成膜液中時，破壞了大分子之間的結構，進而導致WPC和EWP之間的相互作用降低，分子間間隙變大造成了水蒸氣透過率的增加[30]。在不同增塑劑對大豆分離蛋白膜透氣性的影響中發現，隨著甘油質量分數的增加透氣性增加[33]。

表3 甘油添加量對WPC/EWP復合膜阻隔性能、機械性能的影響Table 3 Effects of glycerin addition on barrier properties and mechanical properties of WPC/EWP composite films

綜合考慮WPC/EWP復合膜的厚度、水蒸氣透過率及機械性能和膜的形態，選擇甘油添加量為35%較為合適。

3 結論

本文以WPC和EWP為成膜基質、甘油為增塑劑、TG酶作為交聯劑進行WPC/EWP復合膜的制備與性能研究，探明了WPC和EWP質量比、成膜液pH、及甘油添加量對膜性能的影響。研究表明WPC/EWP復合膜的適宜成膜條件為WPC/EWP質量比1:3，成膜液pH8，甘油添加量35%，在適宜制備條件下WPC/EWP復合膜結構致密、WPC和EWP之間形成了靜電相互作用，具有良好的機械性能和阻隔性能，顯示出開發應用潛能。本研究為WPC/EWP復合膜的實際開發應用提供了理論指導，在后續研究工作中應進一步深入研究該復合膜的在食品包裝方面的適宜途徑和實際應用性能。