D-阿洛酮糖3-差向異構酶在大腸桿菌內的高效可溶性表達及發酵條件研究

李秋鳳，陳 靜，趙婧邑，韋 欣，王志琦，劉繼棟,

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧 530004；

2.廣西農業科學院/廣西南亞熱帶農業科學研究所，廣西崇左 532415）

近年來，D-阿洛酮糖由于其多種生理功能而受到越來越多的關注，可作為抗癌劑、有效免疫抑制劑以及抗氧化劑，市場潛力巨大，目前針對化工合成法純化復雜、伴有副產物產生的缺點，生物合成法生產D-阿洛酮糖具有良好的應用前景[1]。D-阿洛酮糖3-差向異構酶（D-allulose 3-epimerase，DAEase）是催化D-果糖和D-阿洛酮糖進行可逆反應的異構化酶[1]。近年來，陸續有不同來源DAEase在不同宿主中表達的報道[2-4]。其中，Wei等[2]在枯草芽孢桿菌中成功表達了來自Clostridium bolteae和Doreasp.的兩個DAEase基因，并通過啟動子強度優化將DAEase的產量提高約20%。然而在枯草芽孢桿菌表達系統中，重組質粒具有不穩定性，在大規模生產中容易丟失或發生結構改變，不利于相關的基因表達和調控研究[5]。釀酒酵母作為食品級微生物，Juneja等[4]在釀酒酵母中成功表達了DAEase，在55 ℃時將D-果糖轉化為D-阿洛酮糖的轉化率為26.6%。然而在酵母表達系統中，外源蛋白易于糖基化及發酵過程中產生乙醇，并會導致目標蛋白產量下降[5]。

與其它宿主相比，大腸桿菌具有外源基因表達效率高、蛋白分泌量大和基因操作簡單等優點[5-6]。Zhang等[7]使用重組大腸桿菌表達來源于Doreasp.CAG317的DAEase，在pH6.0的酸性條件下酶活性最高，達到了803 U/mg；Park等[8]在重組大腸桿菌中成功表達了來自Agrobacterium tumefaciens的DAEase雙位點突變體（I33L/S213C），培養 24 h后重組大腸桿菌中DAEase和粗蛋白的表達量分別為8.6%和37.0%（w/w）。目前大腸桿菌表達系統主要存在的問題是蛋白易發生錯誤折疊而形成不溶性包涵體，導致產量偏低[9]。將包涵體通過樹脂和凝膠色譜分離純化耗時耗力，且復性過程易造成肽鏈間的錯誤折疊[10]；此外，蛋白質的正確折疊需在基因表達速率和蛋白溶解度之間達到平衡，基因操作難度大[11]。盡管Tseng等[12]將α-突觸核蛋白酸性尾部衍生的肽段與Agrobacteriumsp.ATCC31749的DAEase融合，其在大腸桿菌中的可溶性表達增加了1.57倍，但酶的分離純化步驟卻較為繁瑣，不利于生產應用。

據報道，溫度會影響蛋白質的合成速率、折疊動力學和蛋白質降解的疏水作用[13]，低溫會為蛋白質折疊提供充足時間[14]。閆真等[15]發現，在17 ℃下誘導表達的重組酶比活明顯高于37 ℃下誘導表達的比活，說明低溫有利于提高可溶性蛋白的產量。低溫可以降低包涵體的數量，然而低溫下菌體生長緩慢會導致單位時間的表達水平降低[16]。CspA是37 ℃時處于抑制狀態的冷休克蛋白，在低溫（15 ℃）下會被激活誘導重組蛋白表達[17]。包含CspA啟動子的pCold-TF是一種融合冷休克表達載體，目標基因被冷激誘導表達之前，細菌可在37 ℃快速生長；另外，TF分子伴侶可以作為可溶性融合標簽表達，防止蛋白質在密集細胞環境中發生錯誤折疊和聚集，與蛋白質結合從而使其穩定折疊，并在發揮作用后自行離開目的蛋白，有利于后續的分離純化[17]。因此，為了提高DAEase的產量，本文選擇冷休克表達質粒pCold TF作為表達載體，以實現DAEase在大腸桿菌表達系統內的高效可溶性表達，并對全細胞催化D-果糖生產D-阿洛酮糖的條件進行優化，為其高效工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

T4 DNA連接酶、SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、5×蛋白加樣緩沖液、Real Band蛋白預染 Marker、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp） 生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon Biotech）；限制性核酸內切酶EcoRⅠ、HindⅢ TaKaRa 公司；Ni Seoharose 6 Fsat Flow 蛋白純化樹脂 美國GE公司；D-阿洛酮糖標品（99%）色譜純 Sigma公司；其他試劑 均為國產分析純；大腸桿菌Escherichia coliDH5α、BL21 （DE3）感受態細胞、冷休克表達載體pCold TF 由本實驗室保存；引物合成和核酸測序 由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；LB培養基：10 g/L 蛋白胨、10 g/L 氯化鈉和 5 g/L 酵母提取物，pH7.2，121 ℃ 滅菌20 min，用于大腸桿菌的培養。

GR85DP型高壓滅菌鍋 智微（廈門）儀器有限公司；Power PacTM Basic型蛋白電泳儀 美國伯樂（BIO-RAD）公司；T100 Thermal Cycler型 PCR 儀美國伯樂（BIO-RAD）公司；Waters 2595型高效液相色譜儀 美國沃特世（Waters）公司；722N可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒的構建 在NCBI數據庫上篩選得到來源于C.bolteaeATCCBAA-613的DAEase基因序列，對其進行了針對E.coli中表達的密碼子的優化[18]，在C端加上6×His標簽，同時在基因序列的 5'端與 3'端分別引入EcoRⅠ和HindⅢ 酶切位點，將優化后的基因序列交由上海生工生物公司合成，連接至載體PUC57上。將優化合成的DAEase基因用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，并與經同樣酶切的pCold TF載體在T4連接酶的介導下連接，將其轉化至E.coliDH5α感受態細胞中，37 ℃培養過夜[19]。次日挑取單克隆于LB培養基（含100 μg/mL Amp）中，37 ℃、200 r/min培養 12 h，提取質粒，EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定目的基因的插入，并送測序。經測序驗證后，將構建正確的重組質粒命名為pCold TF-Cb-DAE。

1.2.2 pCold TF-Cb-DAE重組質粒誘導表達 將重組質粒pCold TF-Cb-DAE轉入到大腸桿菌E.coliBL21 （DE3）中，37 ℃ 過夜培養后，取 1% 的種子液接種于 50 mL LB 培養基（含 100 μg/mL Amp），37 ℃下200 r/min振蕩培養至生物量OD600約為0.6～0.8，加入 0.25 mmol/L IPTG，15 ℃下 200 r/min低溫誘導培養，24 h后收集菌液離心，用15 mL 1× PBS緩沖液懸浮菌體，經超聲波細胞破壁后的上清液及沉淀經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）鑒定，分析菌體中目的蛋白的表達情況。

1.2.3 Cb-DAEase的純化 重組菌株經搖瓶培養24 h后，收集上清液用于蛋白質純化。上清液中存在大量的雜蛋白質，使用Ni Seoharose 6 Fast Flow蛋白純化樹脂對其進行純化，可以得到高純度的目的蛋白[20]。采用梯度洗脫法（咪唑濃度 20、50、500 mmol/L），低濃度咪唑洗脫液洗脫雜蛋白，高濃度咪唑洗脫液洗脫目的蛋白，SDS-PAGE檢測純化效果[21]。

1.2.4 Cb-DAEase的酶學性質 為進一步驗證目的蛋白是否可以催化合成D-阿洛酮糖，以50 g/L D-果糖為底物測酶活力，加入適量純化的Cb-DAEase和1 mmol/L的 Co2+，在 55 ℃和 pH 7.0條件下催化10 min后，立即沸水浴10 min以終止反應，反應終止液用0.22 μm濾膜過濾后，通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測D-阿洛酮糖的合成，酶活定義為：每分鐘產生1 μmol的D-阿洛酮糖所需的酶量是1 U。檢測條件：Waters 2595型液相色譜儀，Sugar-Pak1糖柱，Waters 2414示差折光檢測器，85 ℃柱溫，流動相為超純水，流速為0.4 mL/min[22]。

1.2.4.1 最適溫度和pH的測定 在pH8.0條件下，測定不同溫度（40、45、50、55、60、70、75及 80 ℃）條件下的酶活力；在測得的最適反應溫度條件下，測定不同 pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5）條件下的酶活力，將最高酶活力定義為相對酶活100%，其他處理組酶活力/最高酶活力×100%為相對酶活力。

1.2.4.2 金屬離子對DAEase活力的影響 保持上述最適催化溫度和pH不變，在標準測定體系中分別加入 1 mmol/L 不同金屬離子（Co2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+和 Zn2+），催化反應 10 min，使用HPLC測定酶活力。以緩沖溶液代替金屬離子為對照組，將對照組的酶活力設為相對酶活100%。

1.2.5 重組菌株發酵條件優化

1.2.5.1 碳源對細胞生長和Cb-DAEase活力的影響在LB培養基的基礎上，分別以5.0 g/L的葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘油為碳源，按1%的接種量轉接到50 mL培養基（含Amp濃度100 mg/L）中，于 37 ℃下 200 r/min恒溫振蕩培養5 h，當 OD600為 0.6～0.8時加入 0.25 mol/L IPTG誘導劑，繼續置于15 ℃的搖床中以200 r/min的轉速誘導培養24 h，考察不同種類的碳源對酶活力和菌體生長量的影響。酶活力測定同1.2.4節，菌體生長量的測定：將發酵液樣品稀釋至適宜濃度，使用分光光度計記錄OD600，其中稀釋倍數以OD600落在0.2～0.8確定。

1.2.5.2 氮源對細胞生長和Cb-DAEase活力的影響在LB培養基的基礎上，以7 g/L的甘油為碳源，分別以10 g/L的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、氯化銨作為氮源，考察不同種類的氮源對酶活力和菌體生長量的影響，其他培養條件同1.2.5.1節。

1.2.5.3 培養條件對Cb-DAEase活力的影響 將培養過夜的重組菌株BL21/TF-Cb接種到200 mL含有 100 μg/mL Amp的 LB液體培養基中，37 ℃下200 r/min培養至OD600值為0.6～0.8，使用單因素實驗考察接種量、IPTG誘導劑濃度和誘導前培養時間等因素對酶活力的影響，將最高酶活力定義為相對酶活100%。在培養基中接種不同量（0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、1.75%和2.0%）的種子液，添加0.25 mmol/L IPTG誘導劑，于15 ℃下200 r/min誘導24 h，收集發酵液測定酶活力和菌體生長量；在培養基接種1% 的種子液，添加不同濃度（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35及 0.4 mmol/L）的 IPTG，于 15 ℃ 下 200 r/min誘導24 h，收集發酵液測定酶活力和菌體生長量；在培養基中接種1%的種子液，培養不同時間（3、4、5、6、7 h）后，加入0.25 mmol/L的IPTG誘導劑，于15 ℃、200 r/min誘導24 h，收集發酵液測定酶活力和菌體生長量。

在上述最適條件下，以120 g/L果糖為底物進行全細胞催化30 min，整個體系經離心處理后0.22 μm濾膜過濾，濾液使用高效液相色譜（HPLC）檢測，測定阿洛酮糖產量和酶活力，以未優化條件培養重組菌作為對照組。

2 結果與分析

2.1 Cb-DAEase誘導表達及分離純化

將構建成功的重組菌株BL21/TF-Cb接種于LB培養基中誘導表達Cb-DAEase，通過SDS-PAGE鑒定其分子量。DAEase的分子量大小約為34.2 kDa，攜帶TF分子伴侶的質粒分子量大小約為54 kDa，Cb-DAEase的分子量預測為88.2 kDa。如圖1（a），在75～100 kDa之間有明顯的條帶，與預測值一致，說明重組質粒pCold TF-Cb-DAE成功在大腸桿菌宿主E.coliBL21（DE3）中表達。與總粗酶液（lane 2）相比，Cb-DAEase更多的以可溶性蛋白的方式存在于上清液中（lane 3），經分析軟件Image J分析得出，上清中目的蛋白表達量占總蛋白的84.7%±1.4%，而沉淀中的包涵體含量僅占少部分（lane 4），說明冷休克表達質粒pCold TF在低溫誘導條件下成功實現了DAEase在大腸桿菌中的高效可溶性表達。pCold載體上攜帶的分子伴侶TF可以伴隨著蛋白質的初始折疊，通過與錯誤折疊的多肽暴露的疏水區域結合，并將分子轉移到特定的亞細胞，從而避免蛋白質聚集，減少包涵體形成[21]。

圖1 大腸桿菌 E.coli BL21（DE3）中表達 Cb-DAEase 的SDS-PAGE電泳圖（a）以及純化Cb-DAEase的SDS-PAGE 結果（b）Fig.1 Expression of Cb-DAEase in E.coli BL21 (DE3) SDSPAGE electrophoretogram (a) and SDS-PAGE results of purified Cb-DAEase (b)

將重組菌株BL21/TF-Cb發酵上清液通過Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析柱分離純化目的蛋白，如圖1（b）所示，條帶W1為20 mmol/L洗脫液洗出的雜蛋白，條帶W2為50 mmol/L洗脫液洗出的剩余雜蛋白（SDS-PAGE電泳圖中未出現條帶），表明20～50 mmol/L咪唑洗脫液條件下可將所有的雜蛋白洗脫。條帶E1、E2為500 mmol/L洗脫液洗出的目的蛋白，純化后的Cb-DAEase條帶單一清晰占比高，回收的目的蛋白純度高，可用于后續的酶學性質研究。

2.2 Cb-DAEase的酶學特性分析

重組菌株在以D-果糖為底物的培養基中發酵，通過HPLC檢測D-阿洛酮糖的生成。如圖2所示，在20.25 min左右檢測到D-阿洛酮糖，這表明Cb-DAEase可以在大腸桿菌冷休克系統中表達為活性蛋白，具有催化合成D-阿洛酮糖的能力。

圖2 重組Cb-DAEase活性HPLC檢測Fig.2 HPLC analysis of the bioactivity in recombinant Cb-DAEase

2.2.1 溫度、pH、金屬離子對Cb-DAEase酶活的影響最適溫度作為生物催化反應的重要參數，可反應其是否適用于工業化生產[23]。Cb-DAEase的最適反應溫度為 55 ℃（圖3A）。在溫度 45～65 ℃ 內，Cb-DAEase仍保存50%以上的活性；但當溫度超過55 ℃時，酶活力隨著溫度的升高而逐步下降，80 ℃時Cb-DAEase僅有19.56%的活性，說明溫度是影響酶活力的主要因素。

Cb-DAEase在 pH7.0時酶活力最高（圖3B），在pH5～7.5時Cb-DAEase可以保持60%以上的相對酶活力。Sato等[22]報道的 Trpr-DAEase在 pH 8.0時表現出最高活性，Zhu等[1]報道的重組DAEase在pH 7.5～8.0時活性最高，與目前發現的偏堿性DAEase不同，本研究的Cb-DAEase為中性酶，中性條件可避免褐變反應及其它非特異性副反應發生，減少后續分離純化的難度，在工業應用中具有明顯優勢。

金屬離子能夠與酶形成絡合物，穩定或破壞蛋白質的空間結構，在生物催化中起重要作用[23]。與對照組相比（圖3C），金屬離子Co2+、Mn2+及Mg2+在不同程度上提高了Cb-DAEase的活性，Mg2+將酶活力提高了1.48倍，Mn2+將酶活力提高了2.43倍，Co2+的激活作用最強，將酶活力提高了4.52倍，其激活作用原因可能是該陽離子在調節酶活力構象中起重要作用，從而促進果糖異構化成阿洛酮糖[24]。

圖3 重組Cb-DAEase的酶學性質Fig.3 Enzymatic properties of the recombinant Cb-DAEase

2.3 碳源對細胞生長和Cb-DAEase活力的影響

碳源是細胞生長的基礎，其種類及濃度是影響胞內酶表達的重要因素[25]。如圖4A，在添加葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和甘油的培養基中，以甘油為碳源時最有利于細胞生長、相對酶活最高，與Su[25]和Lei[26]等研究相似。甘油作為成本低廉的小分子穩定劑，可以降低發酵體系的極性，與酶蛋白形成氫鍵，有利于隔絕水分子環境及穩定蛋白結構[25]。

通過在培養基中加入濃度為3～7 g/L的甘油，研究了不同甘油質量濃度對細胞生長和Cb-DAEase活性的影響。如圖4B，當甘油濃度為3～5 g/L時，菌株生長量隨著濃度的增加而提高；當甘油濃度為5～7 g/L時，菌株生長量隨著濃度的增加而降低，這可能是由于碳代謝阻遏（CCR）效應[27]，據報道，CCR效應會隨著碳源濃度的增加而降低發酵培養基的pH，而且重組蛋白的表達通常會對細胞生長產生一定的代謝負擔，降低細胞生物量[28]。Cb-DAEase的相對酶活力隨著甘油濃度的增加而顯著提高，7 g/L時相對酶活最高，菌體生長旺盛，故選擇7 g/L甘油作為碳源。

圖4 碳源種類及甘油質量濃度對菌體生長量和Cb-DAEase酶活性的影響Fig.4 Effects of carbon source type and glycerol concentration on growth mass and activity of Cb-DAEase

2.4 氮源對細胞生長和Cb-DAEase活力的影響

此外，本研究還考察了氮源種類對細胞生長和Cb-DAEase發酵活性的影響。在含有酵母膏、牛肉膏、蛋白胨和胰蛋白胨的培養基中，重組菌株生長量高，Cb-DAEase相對酶活在70%以上（圖5A），其中酵母膏作為氮源時菌株生長量和相對酶活最高，說明有機氮源是基因工程菌表達Cb-DAEase的適宜氮源，這可能是由于有機氮源中除了含有蛋白質、肽及游離的氨基酸以外，還含有少量的維生素和生長因子，促進大腸桿菌的生長和蛋白表達[26,29]。

酵母膏濃度在6～10 g/L的范圍時，Cb-DAEase活力和細胞生長都隨著濃度的增加而提高，10 g/L時酶活力和生物量最高（圖5B），當酵母膏濃度在10～14 g/L的范圍時，酶活力和細胞生長都隨著濃度的增加而下降，故確定酵母膏的最適添加濃度為10 g/L。

圖5 氮源種類及酵母膏質量濃度對菌體生長量和Cb-DAEase酶活性的影響Fig.5 Effects of nitrogen source type and yeast extract concentration on growth mass and activity of Cb-DAEase

2.5 培養條件對細胞生長和Cb-DAEase活力的影響

接種量是影響菌株生長快慢的因素之一，接種量過少會導致一個長時間的滯后期[30]；增加接種量可促進微生物生長，縮短細胞生長的滯后期并降低感染雜菌的概率，但接種量過高會導致代謝廢物增加，增加菌株的生物量，過早引起菌株之間的競爭[31]，從而降低Cb-DAEase生物合成的速率，故研究接種量對細胞生長和Cb-DAEase活性的影響尤為重要。由圖6A可知，Cb-DAEase的相對酶活隨著接種量變化呈現先增加后降低的趨勢，當接種量為1%時Cb-DAEase的相對酶活最高。

圖6 接種量（A）、誘導劑濃度（B）和誘導前培養時間（C）對生物量和Cb-DAEase表達的影響Fig.6 Effects of inoculum size (A)， IPTG concentration (B) and induction time (C) on growth mass and expression of Cb-DAEase

以1%接種量為基礎，改變誘導劑濃度，如圖6B，隨著誘導劑濃度的增加，酶活性和菌體生長量先增加后降低，在0.25 mmol/L時達到最高。IPTG濃度過高具有一定的毒性，導致菌體生長緩慢及形成包涵體，細胞內不溶性DAEase的比例增加[26]；用量過多也會增加生產成本，故選擇0.25 mmol/L作為最佳誘導劑濃度。

以上述條件為基礎，改變誘導前培養時間，如圖6C，培養時間在3～5 h時，酶活性和生長量隨著培養時間的增加而提高；培養時間為5 h時，酶活力與生長量達到最大；此后延長培養時間，酶活力和生長量反而呈現下降趨勢，說明培養5 h重組菌株生長旺盛，有利于產酶。因此，最終確定誘導前培養時間為5 h。

以120 g/L果糖作為底物，在上述條件下對重組菌株BL21/TF-Cb進行發酵優化培養，經全細胞反應催化后通過HPLC儀檢測產物。Cb-DAEase活力達到（10.11±0.02） U/g，同比優化前（1.38±0.01） U/g 提高了 86.35%；阿洛酮糖產量為（11.47±0.04） g/L，同比優化前（1.03±0.02） g/L提高了 91.02%，是 Zhang等[31]發酵產量（4.56±0.01）g/L 的 2.51 倍，優化效果十分顯著，達到高效可溶性表達的目的，為工業化高產D-阿洛酮糖提供了數據支持。

3 結論

在大腸桿菌中構建冷休克啟動子誘導的外源蛋白表達系統，其新穎之處在于解決了胞內蛋白濃度過高導致折疊時間、空間受限而形成大量包涵體的問題，從而顯著提高了DAEase在大腸桿菌中的表達水平。此外，以7 g/L甘油、10 g/L酵母膏、1%接種量、0.25 mmol/L IPTG、誘導前培養5 h的條件進行發酵顯著降低了DAEase的生產成本， DAEase活力達到（10.11±0.02） U/g；以 pH7.0、55 ℃ 和 1 mmol/L Co2+催化條件進行全細胞反應，D-阿洛酮糖產量最高可達（11.47±0.04） g/L，基于這些結果，大腸桿菌冷休克表達系統在DAEase生產中顯示出巨大的應用潛力，為進一步研究利用生物轉化法生產D-阿洛酮糖提供技術參考。