NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲的生理響應及主成分分析

孫 靜，楊 彤，張志豪，王建瑞，劉 宇

（魯東大學農學院，山東省食用菌技術重點實驗室，山東煙臺 264025）

鹽分脅迫是世界范圍內常見的一種非生物脅迫，全世界20%的耕地和32%的灌溉農業用地都受到了土壤鹽害的嚴重影響，造成了農作物退化減產，甚至絕產[1]。土壤鹽漬化現已成為一個全球性的土地資源問題，它遍及全球100多個國家[2]。此外，由于降水量少，地表水分蒸發量高，海水灌溉等原因，鹽堿地面積正以每年10%的速度增加。據統計，到2050年，50%以上的耕地會被土壤鹽漬化破壞[3]。我國黃河三角洲地區的鹽堿地面積高達47.6萬公頃，分布廣泛、面積遼闊，并且類型繁多，鹽的成分主要以氯化物為主，占80%以上，陽離子以鈉為主，是重要的后備土地資源[4]。

羊肚菌Morehellaspp.，屬于盤菌目 Pezizales，羊肚菌科Morchellaceae[5]，具有很高的營養價值和經濟價值，是中國四大名菌之一。羊肚菌中的蛋白質和碳水化合物含量高、脂肪含量低[6-7]，含有豐富的人體必需氨基酸[8]、維生素[9]以及生物活性物質，對人體健康極為有利[10]。羊肚菌風味鮮美、肉質脆嫩，因此被廣大食用菌愛好者和美食家所喜愛[11-12]。同時，羊肚菌還具有一定的藥用價值，可作為免疫刺激劑和抗腫瘤劑[13]。經前期試驗證明，羊肚菌具有良好的耐鹽性，在高鹽環境（NaCl＞500 mmol/L）下，菌絲仍能夠萌發，但長勢緩慢。本研究團隊前期報道了鹽脅迫下不同時間內六妹羊肚菌菌絲的胞內外多糖、DPPH自由基以及菌絲顯微結構等的變化情況[14]。

本研究以前期耐鹽菌株篩選試驗中耐鹽性最強的六妹羊肚菌菌株為研究對象，測定NaCl脅迫對六妹羊肚菌菌絲14個生理指標的影響，并探討了對低、中、高NaCl脅迫具有指示性的生理指標以及六妹羊肚菌的生理響應，為羊肚菌屬的耐鹽性評價及耐鹽菌株的篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六妹羊肚菌（M.sextelata） 由云南昆明植物研究所提供；PDA固體培養基 馬鈴薯200 g（去皮），葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL，維生素B11片；PDA液體培養基 馬鈴薯200 g（去皮），葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL，維生素B11片；葡萄糖分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；瓊脂粉分析純，北京奧博星生物技術有限責任公司；考馬斯亮藍G-250 分析純，天津市大茂化學試劑廠；聚乙烯比咯烷酮 天津市瑞金特化學品有限公司；硫代巴比妥酸 上海山浦化工有限公司；其他試劑 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海達平儀器有限公司；SW-CJ-IBU型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；OLYMPUS-BX61型全自動金相顯微鏡 日本奧林巴斯集團；SQP型千分級電子天平、A-14型高速離心機 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DGX-943B-1型鼓風干燥箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司；WY-250B型全溫型恒溫培養搖床 天津市泰斯特儀器有限公司；Eppendorf型移液槍 德國漢堡艾本德生命科學公司；TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HHS-21-6型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；MP515-02型高純水電導率儀、802型磁力攪拌器 上海三信儀表廠；BS-100型冰點滲透壓測定儀 北京恒奧德儀器儀表有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器 上海星堯科學儀器有限公司；BHC-1300IIB2型通風櫥 上海精密儀器儀表有限公司；FL1936-G1型粉碎機 溫州福菱科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固體菌種制備 PDA固體培養基，分裝于500 mL三角瓶中，每瓶250 mL，高壓0.12 MPa蒸汽滅菌后倒平板，每皿20 mL。待平板凝固后，在平板上接入活化的六妹羊肚菌菌種，在（22±1）℃條件下黑暗培養，待菌絲長滿平板后，作為菌種備用。

1.2.2 液體菌種制備 PDA液體培養基，分裝于500 mL三角瓶中，每瓶250 mL，高壓0.12 MPa蒸汽滅菌，冷卻后接入已活化的六妹羊肚菌菌種，放入搖床，22 ℃，170 r/min，培養2.5 d。待三角瓶內搖出均勻一致的雪花狀菌絲球，停止培養。

1.2.3 鹽脅迫培養 本研究參考了多種作物[15-16]、其他植物[17-20]、菌根真菌[21-22]等，并結合前期試驗中羊肚菌菌絲的生長狀態，設置NaCl濃度梯度為：0、100、200、300、400和 500 mmol/L。配制不同NaCl濃度的PDA固體培養基，每個處理設置三個重復。在平板中央打孔接入生長狀態相同的六妹羊肚菌菌種，在（22±1）℃條件下黑暗培養，每隔12 h劃線一次，至其中一個平板菌絲長滿平板后，停止劃線，測量數據。

配制不同 NaCl濃度（0、100、200、300、400和500 mmol/L）的PDA液體培養基，每個處理設置三個重復。將培養2.5 d的液體菌種分別定量接入不同處理的液體培養基中，接種量為液體培養基的10%。放入搖床，22 ℃，170 r/min，培養 5 d后，用140目尼龍紗過濾網過濾，分別取樣測各項指標。

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 生長速度及抑制率測定 以開始培養為起點，采用劃線法標記菌絲長度（菌絲長度=菌落直徑-菌餅直徑），在平板選取任意測量位置，按順時針旋轉60°的方法，每個平板共劃線3次，每12 h記錄一次。計算不同NaCl處理對六妹羊肚菌菌絲生長速度和抑制率的影響。

菌絲生長速度：

式中：V是菌落平均生長速度，mm/h；D是菌落最終真實直徑，mm；T是平板長滿的時間，h[23]。

生長抑制率：

式中：P是不同鹽濃度對菌絲生長的抑制率；V1是對照菌絲生長速度；V2是不同鹽濃度處理菌絲生長速度[24]。

1.2.4.2 菌絲顯微結構 使用金相顯微鏡，放大1000倍，觀察菌絲形態。

1.2.4.3 生物量測定 同1.2.3中液體培養5 d后，過濾，用蒸餾水將菌絲表面鹽離子洗凈。用千分級電子天平稱量菌絲鮮重，并記錄。稱重后，放入53 ℃鼓風干燥箱內，每隔12 h拿出稱重，直至三次稱重，重量不變，停止烘干，取出后按照鮮重稱取方法稱量干重。計算不同NaCl處理對六妹羊肚菌菌絲鮮重含水量的影響。

鮮重含水量：

式中：Wc是菌絲鮮重含水量，%；Wf是菌絲鮮重，g；Wd是菌絲干重，g。

1.2.4.4 質膜透性測定 使用高純水電導率儀測定電解質的電導率[25]。

1.2.4.5 丙二醛含量測定 采用硫代巴比妥酸（TBA）方法[26]。

1.2.4.6 滲透壓測定 采用冰點滲透壓測定儀測定數值，為i×C的值，單位是mOsm/L，并根據公式進行計算。

菌絲細胞滲透壓：ψs=-R×T×i×C

式中：ψs為細胞滲透勢；R為氣體常數，R=0.0083（MPa·L·mol-1·K-1）；T 為熱力學溫度，單位 K，即273+t，t為實驗溫度，℃；i為解離常數，蔗糖為1，NaCl為1.8；C為等滲溶液的質量摩爾濃度，mol/L。

1.2.4.7 多糖含量測定 按黃玲玲[27]的方法測定菌絲的胞內多糖含量。

1.2.4.8 可溶性蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍G-250法測定菌絲的可溶性蛋白含量[28]。

1.2.4.9 游離脯氨酸含量測定 采用磺基水楊酸比色法測定菌絲中的游離脯氨酸含量[29]。

1.2.4.10 抗氧化酶活性測定 SOD活性測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法；POD活性測定采用愈創木酚比色法；CAT活性測定采用紫外吸收法[30]。

1.3 數據處理

本試驗所有數據均采用3次重復的平均值。運用SPSS 19.0軟件進行方差分析（P＜0.05）、相關性分析和主成分分析，利用Waller-Duncan（W）法進行樣本間差異顯著性檢驗。通過Origin 2019b軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對六妹羊肚菌菌絲生長的影響

從菌絲外觀形態（圖1）可以看出，各處理組的菌絲直徑隨NaCl濃度升高明顯變細。如圖2，100～500 mmol/L NaCl濃度處理組均與對照組的菌絲直徑呈顯著性差異（P＜0.05）。其中，對照組菌絲直徑最大，為14.45 nm，鹽濃度在100～200 mmol/L處理組之間，菌絲直徑差異不大，分別為11.64、10.63 nm。隨鹽脅迫加深，菌絲逐漸變細。當鹽濃度達到500 mmo/L時，菌絲相比對照組細了62.42%。

圖1 不同濃度NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲顯微結構圖Fig.1 Microstructure of M.sextelata mycelia under different concentrations of NaCl stress

圖2 不同濃度NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲直徑變化Fig.2 Changes of mycelia diameter of M.sextelata under different concentrations of NaCl stress

從圖3可以看出，隨著NaCl濃度的增加，六妹羊肚菌菌絲均能夠萌發，但菌落直徑逐漸變小且菌絲逐漸稀疏。如圖4，菌絲生長速度與鹽濃度呈負相關，而且抑制率與鹽濃度呈正相關。鹽濃度在0～200 mmol/L范圍內時，菌絲的平均生長速度分別為0.58、0.46、0.34 cm/h，各處理組生長速度差異顯著（P＜0.05）。300～400 mmol/L NaCl處理，菌絲長勢較慢，平均生長速度分別為0.28和0.13 cm/h，生長抑制率分別為51.32%、76.98%，各處理組生長速度差異顯著（P＜0.05），其抑制率顯著性情況與生長速度基本一致。當500 mmol/L NaCl處理時，菌絲稀疏且長勢弱，生長抑制率達到85.89%，與400 mmol/L差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同濃度NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲長勢情況Fig.3 Mycelial growth of M.sextelata under different concentrations of NaCl stress

圖4 不同濃度NaCl脅迫對六妹羊肚菌菌絲生長的影響Fig.4 Effects of different concentrations of NaCl stress on M.sextelata mycelial growth

由表1可知，六妹羊肚菌菌絲鮮重和干重隨著鹽脅迫濃度的增加，整體呈下降趨勢。與對照組相比，NaCl濃度為100～500 mmol/L時，各處理組菌絲鮮重和干重均顯著降低（P＜0.05）。其中，0～300 mmol/L時，各處理組菌絲鮮重和干重之間呈顯著性差異（P＜0.05），300～500 mmol/L 時，菌絲鮮重和干重受鹽脅迫影響相差不大。菌絲鮮重含水量隨鹽濃度遞增，呈先上升后下降的趨勢。當鹽濃度為200 mmol/L時，菌絲鮮重含水量達到最大值，為95.79%。鹽濃度達到500 mmol/L時，菌絲鮮重含水量與對照組相比，下降了4.23%。

表1 不同濃度NaCl脅迫對六妹羊肚菌菌絲生物量的影響Table 1 Effects of different concentrations of NaCl stress on the mycelial biomass of M.sextelata

2.2 NaCl脅迫對六妹羊肚菌菌絲膜透性的影響

從圖5可以看出，隨著鹽脅迫程度加深，六妹羊肚菌菌絲電導率呈逐漸上升趨勢，鹽濃度在100～500 mmol/L范圍之間時，各處理組電導率與對照組均呈現顯著性差異（P＜0.05），電導率最高達到310.87 ms/cm。而隨培養基鹽濃度升高，菌絲中丙二醛含量呈先上升后下降的趨勢，在鹽濃度為200 mmol/L時，丙二醛含量出現最大值，達到0.033 μmol/g，與對照組呈顯著性差異（P＜0.05）。鹽濃度在300～500 mmol/L范圍內時，各處理組之間差異不顯著，但與對照組呈顯著性差異（P＜0.05）。

圖5 不同濃度NaCl脅迫對六妹羊肚菌菌絲膜系統的影響Fig.5 Effects of different concentrations of NaCl stress on the mycelial membrane system of M.sextelata

2.3 NaCl脅迫對六妹羊肚菌菌絲生理指標的影響

由圖6可以看出，六妹羊肚菌菌絲胞內滲透壓隨鹽濃度脅迫加深呈逐漸上升的趨勢，對照組滲透壓僅為0.06 MPa，當鹽濃度為100 mmol/L時，胞內滲透壓與對照組相比，升高了4.5倍，為0.33 MPa，與對照組差異不顯著（P＞0.05）。鹽濃度在 100～200 mmol/L之間時，滲透壓呈顯著差異（P＜0.05）。鹽濃度在300～500 mmol/L范圍之內時，各處理組之間滲透壓具有顯著差異，且與對照組分別呈顯著性差異（P＜0.05），滲透壓最高達到 2.53 MPa。

圖6 不同濃度NaCl脅迫對六妹羊肚菌菌絲生理指標的影響Fig.6 Effects of different concentrations of NaCl stress on mycelial physiological indices of M.sextelata

鹽脅迫下羊肚菌菌絲中的可溶性多糖作為有機滲透調節物質，以緩解鹽脅迫對菌絲生長的抑制。隨液體培養基鹽濃度增加，菌絲內可溶性多糖含量明顯降低。其中，100～200 mmol/L/時，可溶性多糖含量減幅顯著，分別為14.99、9.63 g/L，與對照組差異顯著（P＜0.05），而鹽濃度在 200～500 mmol/L 之間時，各處理組與對照組差異顯著（P＜0.05），各處理組之間未達到顯著性差異（P＞0.05）。

不同濃度的鹽處理對羊肚菌菌絲可溶性蛋白含量的影響不同。鹽濃度為0～500 mmol/L范圍之間時，各處理組差異不大，呈先上升后下降的趨勢。鹽濃度為400 mmol/L時，菌絲可溶性蛋白出現最大值，為41.90 mg/g，與對照組相比增加了23.67%。

隨著鹽脅迫的加深，菌絲內游離脯氨酸的含量呈先上升后下降的趨勢。100～300 mmol/L之間時，脯氨酸含量與對照組相比，漲幅明顯，分別增長了61.44%、273.11%、434.31%。300～500 mmol/L之間時，游離脯氨酸含量逐漸下降，菌絲生長受到抑制。

2.4 NaCl脅迫對六妹羊肚菌菌絲抗氧化酶的影響

如圖7，隨著鹽脅迫程度的加深，菌絲中抗氧化酶系活性呈先升后降的趨勢。超氧化物歧化酶（SOD）活性在300 mmol/L時，達到最高值，與對照組相比，增長了8.72%。過氧化物酶（POD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性在鹽濃度達到200 mmol/L時，出現最高值，分別比對照組升高22.28%、114.93%。當鹽脅迫繼續加深后，菌絲上述酶活性均不同程度降低。

圖7 不同濃度NaCl脅迫對六妹羊肚菌菌絲酶系統的影響Fig.7 Effects of different concentrations of NaCl stress on the mycelial enzyme system of M.sextelata

2.5 NaCl脅迫下生理指標的相關性分析和主成分分析

通過SPSS 19.0軟件對上述測得的六妹羊肚菌菌絲在NaCl脅迫下的14個生理指標利用相關性分析和主成分分析進行綜合分析。

從相關性分析（表2）可以看出：菌絲生長抑制率與生長速度、菌絲鮮重與干重均呈極顯著相關（P＜0.01）；脯氨酸含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性均與鮮重呈顯著相關（P＜0.05）；胞內多糖含量則與菌絲干重呈顯著相關（P＜0.05）；過氧化物酶（POD）活性與丙二醛呈極顯著相關（P＜0.01）；過氧化氫酶（CAT）活性與丙二醛（MDA）和過氧化物酶（POD）活性均呈極顯著相關（P＜0.01）。

表2 NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲各項生理指標的相關系數Table 2 Correlation matrix of physiological indexes of M.sextelata mycelia under NaCl stress

從主成分分析得出的碎石圖（圖8），呈“先陡后緩”的趨勢，主成分特征值越大，趨勢越陡，說明涵蓋信息越多。本研究中，前三個成分特征值均大于1，且累計貢獻率為96.611%（表4），能夠代表不同NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲96%的生理信息。因此，可用這3個主成分對六妹羊肚菌菌絲的14個指標進行分析。

圖8 主成分分析碎石圖Fig.8 Crushed stone diagram of principal component analysis

從回歸因子得分（表3）可以看出：前3個主成分的貢獻率分別為66.237%、22.347%和8.027%。其中，NaCl濃度在0～100 mmol/L時，主成分1得分較高，NaCl濃度在100～200 mmol/L時，主成分2得分較高，NaCl濃度在200～400 mmol/L時，得分較高的是主成分3。根據主成分分析（表4）可以看出，主成分1中特征向量值較大的是生長速度、菌絲直徑、干重、鮮重和胞內多糖等指標，主成分2中特征向量值較大的是丙二醛（MDA）、可溶性蛋白、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性等指標，主成分3中的特征向量值較大的是脯氨酸、可溶性蛋白和超氧化物歧化酶（SOD）活性等指標。

表3 NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲生理指標的回歸因子得分Table 3 REGR factor scores of physiological indexes of M.sextelata mycelia under NaCl stress

表4 NaCl脅迫下六妹羊肚菌菌絲生理指標的主成分分析Table 4 Principal component analysis of physiological indexes of M.sextelata mycelia under NaCl stress

3 討論

3.1 六妹羊肚菌菌絲生長對NaCl脅迫的響應

鹽脅迫對六妹羊肚菌菌絲形態發育和生長情況具有顯著影響。菌絲在鹽脅迫下，其新陳代謝與生長速度都會受到一定程度的影響。本試驗中，NaCl脅迫對六妹羊肚菌菌絲生長有抑制作用，且菌絲逐漸變細，對其鮮重和干重及鮮重相對含水量也有顯著影響，并隨鹽濃度的遞增呈降低的趨勢。主要原因可能是在鹽脅迫下，菌絲吸收培養基中的Na+、Cl-增加，抑制了Ca2+、K+、NO3-吸收，而細胞為了維持正常功能的離子含量和離子平衡，必然會消耗生長過程所需的部分能量，所以抑制了菌絲的生長。菌絲內營養失衡，菌絲無法獲得營養而長勢減弱變細，使得菌絲鮮重下降，進一步導致干重下降。而鹽脅迫為300～500 mmol/L處理組的菌絲鮮重和干重趨于平緩，說明在高鹽脅迫下，離子平衡無法維持，隨著膜透性顯著提高，細胞膜受傷害程度愈加嚴重，生長速度極其緩慢，使得各處理組相差不大。六妹羊肚菌菌絲在鹽脅迫下生長變化與繩狀青霉菌[21]基本一致。

3.2 六妹羊肚菌菌絲膜系統對NaCl脅迫的響應

電導率是分析膜完整性的重要指標。本研究中隨鹽脅迫加深，六妹羊肚菌菌絲的電導率逐漸升高?？赡苁怯捎谂囵B基中鹽濃度升高，菌絲吸收鹽離子，會造成細胞膜的結構和功能損傷，從而導致膜的透性變大，培養基中大量的Na+進入菌絲細胞，細胞膜上結合的Ca2+被置換，使膜結合的Na+/Ca2+增加，膜的結構遭到破壞，功能也隨之改變。此時，細胞內的K+、Mg2+和有機質外滲，使得電導率升高，說明鹽對細胞膜透性產生影響，且濃度越高，對膜的破壞程度越大。而細胞膜不飽和脂肪酸發生過氧化作用的最終產物是丙二醛，生物膜的結構和功能被破壞，最終引起菌絲細胞代謝紊亂[27]，其含量的高低反映細胞膜脂過氧化程度。本實驗中，隨鹽濃度遞增，丙二醛呈上升趨勢，鹽濃度在200 mmol/L時達到最大值，說明低鹽濃度脅迫對菌絲傷害較小，自身防御體系能夠保護細胞。之后隨鹽濃度繼續升高，丙二醛逐漸下降，證明菌絲細胞膜脂過氧化程度加劇，潛在的保護膜不受損傷能力持續降低，細胞膜結構遭到嚴重破壞。這與濱海雀稗[27]、金盞菊[28]等研究結果相似。

3.3 六妹羊肚菌菌絲滲透系統對NaCl脅迫的響應

滲透調節是機體對抗逆境脅迫最重要且最為有效的機制[31]。在一定滲透脅迫條件下，六妹羊肚菌菌絲生長過程中會積累一些滲透調節物質，導致滲透壓升高，使其在滲透壓的環境下仍能夠吸收水分和營養物質，這就是菌絲進行滲透調節的過程。本實驗中，鹽濃度逐漸加深，造成菌絲細胞內滲透調節物質外滲，導致細胞內離子數量減少，而滲透勢具有“依數性”特點[32]，因此，滲透勢降低，最終造成滲透壓升高。隨著鹽濃度升高，可溶性多糖含量顯著下降，鹽濃度大于300 mmol/L時，可溶性多糖含量趨穩，變化不大；而可溶性蛋白和脯氨酸含量呈先上升后下降趨勢，分別在400、300 mmol/L出現峰值。本實驗出現此結果可能的原因是可溶性多糖、可溶性蛋白和脯氨酸都是六妹羊肚菌菌絲體內重要的有機滲透調節物質和營養物質，其含量能夠影響菌絲細胞的保水能力，有利于六妹羊肚菌耐鹽性的提高。這些滲透調節物質在鹽脅迫下，一方面，對細胞膜起保護作用；另一方面，菌絲為適應鹽脅迫，將營養物質有效利用，供應菌絲生長發育，以緩解鹽脅迫對菌絲生長的抑制，從而表現出較強的耐鹽能力。由此可見，六妹羊肚菌在一定鹽濃度范圍內，能通過調節自身滲透系統來減輕鹽脅迫傷害，超過一定范圍，則生長緩慢甚至停止生長。這與紫花苜蓿[33]研究結果基本一致。

3.4 六妹羊肚菌菌絲酶系統對NaCl脅迫的響應

在不同NaCl添加量的培養基中，菌絲細胞內會因受到鹽環境的刺激而產生大量的活性氧自由基，使細胞內自由基的產生和消除難以達到動態平衡[34-35]。超氧化物歧化酶（SOD）作為菌絲體內最重要的抗氧化物質之一，具有清除細胞中多余的超氧陰離子的作用，而過氧化物酶（POD）則能夠清除超氧化物歧化酶（SOD）催化反應的產物過氧化氫，從而使菌絲細胞免受過氧化氫的毒害。因此，六妹羊肚菌菌絲在鹽脅迫下需要靠超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）來清除細胞內多余的自由基。本研究中，隨著培養基中鹽含量的不斷增加，六妹羊肚菌菌絲中的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性呈先上升后下降的趨勢，分別在鹽濃度300和200 mmol/L時，活性達到最高值，隨之活性呈下降趨勢?？赡艿脑蚴窃谝欢ǖ臐舛确秶鷥?，超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）可以清除菌絲細胞內過多的自由基，但隨著鹽濃度繼續增加，環境中大量Na+進入細胞，細胞內多種功能被破壞，使生理代謝紊亂，抑制抗氧化酶活性，造成菌絲超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性下降，這與叢枝菌根真菌對田菁耐鹽性[36]研究結果相吻合。此外，Jakubowski等[37]研究發現，鹽脅迫下酵母菌中抗氧化物質含量增加，比如超氧化物歧化酶（SOD）的活力增加等，酵母菌在進入穩定期后會對氧化損傷的增強做出適應性反應，可解釋鹽脅迫下六妹羊肚菌菌絲中抗氧化酶的活性變化。過氧化氫酶（CAT）具有在鹽害脅迫條件下，延緩衰老的作用[38]，能夠將超氧化物歧化酶（SOD）等產生的H2O2轉化為H2O，是清除活性氧的關鍵[39]。本實驗中，隨著鹽脅迫加深，過氧化氫酶（CAT）活性，表現出先上升后下降的趨勢，在200 mmol/L時，過氧化氫酶（CAT）活性達到最大值。說明在鹽濃度小于200 mmol/L時，菌絲細胞內通過產生大量的過氧化氫酶（CAT）來抵御逆境帶來的毒害，而在高鹽脅迫下，過氧化氫酶（CAT）活性降低，菌絲進入衰老期。

3.5 六妹羊肚菌菌絲對NaCl脅迫的綜合響應

通過對本研究中測定的14個生理指標進行相關性分析和主成分分析，可以得出：在不同鹽濃度下，發揮指示作用的生理指標不同。在鹽濃度為0～100 mmol/L范圍之間時，六妹羊肚菌菌絲生長過程中主要的指示性指標是生長速度、菌絲直徑、干重、鮮重和胞內多糖，說明在低鹽濃度脅迫時，對六妹羊肚菌菌絲的影響主要表現在菌絲的形態和生長指標，對菌絲生理指標影響不大；在鹽濃度為100～200 mmol/L范圍之間時，主要的指示性指標是丙二醛、可溶性蛋白、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性，說明在中鹽濃度脅迫時，對六妹羊肚菌菌絲的影響主要表現在膜系統和酶系統，是因為鹽脅迫到達一定濃度時，菌絲細胞膜遭到破壞，為了抵抗不良環境，菌絲細胞內的抗氧化酶表達量逐漸升高；在鹽濃度為200～400 mmol/L范圍之間時，主要的指示性指標是脯氨酸、可溶性蛋白和超氧化物歧化酶（SOD）活性，說明在高鹽濃度時，對六妹羊肚菌菌絲的影響主要是在滲透系統，是因為在高鹽脅迫時菌絲細胞膜被嚴重破壞，開始使細胞內營養離子大量外流，造成滲透壓升高。

4 結論

六妹羊肚菌菌絲體內的各項生理指標對鹽脅迫均有一定的響應。鹽脅迫下六妹羊肚菌菌絲生長抑制率、滲透壓和電導率持續升高，生長速度、菌絲直徑、生物量和可溶性多糖顯著下降，丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和抗氧化酶活性在一定鹽濃度脅迫下呈上升趨勢，隨著鹽濃度加深，生長受到抑制，各項生理指標開始下降。本實驗中，通過對六妹羊肚菌菌絲的14個生理指標的主成分分析發現：在低NaCl濃度（0～100 mmol/L）脅迫時，生長速度、菌絲直徑、干重、鮮重和胞內多糖對六妹羊肚菌菌絲的指示性最強；在中 NaCl濃度（100～200 mmol/L）脅迫時，超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛含量、可溶性蛋白含量對六妹羊肚菌菌絲的指示性最強；在高NaCl濃度（200～400 mmol/L）脅迫時，脯氨酸、可溶性蛋白和超氧化物歧化酶（SOD）活性對六妹羊肚菌菌絲的指示性最強。此外，本研究測定了六妹羊肚菌菌絲在鹽脅迫下各項生理指標，開展耐鹽基因的篩選和挖掘，是下一步研究的重點。