紅腌菜發酵過程中細菌多樣性動態分析

石晶紅

（河套學院農學系，內蒙古巴彥淖爾 015000）

紅腌菜是內蒙古西部地區傳統的發酵蔬菜制品，以巴彥淖爾市紅腌菜最為出名。傳統紅腌菜采用“腌制、晾曬、煮制、再晾曬”的工藝進行生產，最初多以蔓菁、蘿卜為原料腌制，因芥菜口感好出成率高，很多廠家改以芥菜為原料腌制。芥菜（Brassica juncea）是我國種植的一種重要的農業和經濟作物，按食用部位分為葉用芥菜，莖用芥菜和根用芥菜[1]。以芥菜為原料經發酵加工而制成的著名特產有涪陵榨菜、襄陽大頭菜等。發酵蔬菜因其豐富的營養價值、感官品質的提高和對消費者的健康益處而備受關注[2-3]。

近年來，越來越多的研究者針對不同發酵芥菜產品的微生物多樣性進行研究。Liang等[4]研究發現榨菜發酵初期乳酸菌生長迅速，然后達到穩定的發酵水平，弧菌、鹽單胞菌、明串珠菌、魏斯氏菌在發酵過程中數量減少，片球菌數量增加。Liu等[5]研究發現芥菜發酵產物中主要微生物為乳酸菌和假單胞菌。吳曉紅等[6]研究發現榨菜發酵前期以自鞘氨醇桿菌屬、魏斯氏菌屬、Cobetia、弧菌屬和假單胞菌屬為主，發酵中期以氣微菌屬、上地桿菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬和不動桿菌屬為主，而發酵后期以芽孢桿菌屬、四聯球菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬和鹽單胞菌屬為主。吳進菊等[7]研究發現襄陽大頭菜以鹽厭氧菌屬、弧菌屬、鹽單胞菌屬、乳桿菌屬和色鹽桿菌屬5個細菌屬為優勢菌屬。發酵過程中出現的微生物類型取決于生產方法、季節和地理區域[8]，且不同地域環境下制作的發酵蔬菜中微生物群落結構存在一定差異[5]。

目前針對紅腌菜發酵過程中微生物方面的研究較少，發酵過程中微生物群落結構變化和種群多樣性了解不夠清楚，限制了紅腌菜的標準化和工業化生產。本研究利用高通量測序技術對紅腌菜發酵過程中的細菌群落多樣性進行解析，同時對紅腌菜發酵過程中細菌的代謝功能進行預測，旨在為傳統紅腌菜工業化生產提供理論依據及篩選特性菌種提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit（強力土壤DNA提取試劑盒） 德國Qiagen公司；Agencourt?AMPure? XP（核酸純化試劑盒） 美國Beckman Coulter公司；ZS紅腌菜發酵液樣品 內蒙古培堯食品有限公司；JS紅腌菜發酵液樣品 巴彥淖爾市農戶家庭自制。

MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司；9700 PCR儀、Step One Plus Qpcr儀 美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅腌菜發酵工藝 農戶傳統發酵方法：挑選優質的芥菜，修整清洗切分后，裝缸壓實，用質量分數為8%～10%的食鹽水填滿密封置于18～22 ℃進行發酵，發酵時間為35 d。

工廠改進發酵方法：挑選優質的芥菜，修整清洗切分后，加鹽擠壓脫水，漂洗脫鹽后裝缸，加醬油、醋、白糖、香辛料等物質，用水填滿密封置于15～18 ℃進行發酵，發酵時間為42 d。

1.2.2 樣本采集 取農戶自然發酵缸發酵7、14、21、28、35 d的紅腌菜發酵液，分別編號為JS1、JS2、JS3、JS4、JS5；取工廠自然發酵缸發酵 7、14、21、28、35和42 d的紅腌菜發酵液，分別編號為ZS1、ZS2、ZS3、ZS4、ZS5和 ZS6。樣本采集后于-40 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 測序和數據處理 將紅腌菜發酵液樣本送至北京奧維森基因科技有限公司Illumina MiSeq平臺進行測序。利用Flash軟件[9]根據overlap原始數據進行拼接，采用Uchime軟件[9]去除嵌合體，得到優質序列。用Uclust軟件[10]在97%相似度下構建分類單元（ operational taxonomic unit，OTU）。OTU 聚類結果利用Mothur軟件計算各樣本的α多樣性，基于 Silva V128[11]、RDP v16[12]和 Greengenes v13.5[13]數據庫對OTU代表性序列進行注釋；利用 Qiime軟件[14]對樣品β多樣性進行分析。OTU的主坐標分析、樣本聚類分析通過R軟件實現。采用 PICRUSt軟件[15]和京都基因百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫對發酵液中細菌的代謝功能進行預測。

2 結果與分析

2.1 Alpha多樣性分析

由表1可知，工廠發酵紅腌菜不同發酵時間的6個樣本測序共獲得有效序列332195條，其覆蓋率為99.81%～99.90%；農戶發酵紅腌菜不同發酵時間的5個樣本測序共獲得有效序列1391172條，其覆蓋率為99.94%～99.98%，表明測序深度良好，覆蓋率高，所測得的數據可真實反映兩種發酵方法樣品的細菌群落組成。對樣品測得的有效序列按樣品最低序列數進行抽平處理后，去掉樣本間共有的OTU，工廠發酵樣品和農戶發酵樣品共得到OTU分別為494和388個。

表1 樣品中細菌Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity index of bacteria in samples

從體現微生物總量的Chao 1指數上看，工廠發酵紅腌菜樣品ZS1和ZS2的Chao 1指數較高，隨著發酵的進行Chao 1指數明顯下降。這可能是由于傳統發酵紅腌菜經過干腌清洗后發酵，與干腌相比發酵前期食鹽含量明顯降低，所以樣品中細菌群落的豐富度和多樣性均達到最高，而隨著發酵的進行，發酵液的酸度逐漸增加，導致不耐酸的細菌逐漸消失，所以細菌群落的豐富度和多樣性有所下降。

而農戶發酵紅腌菜樣品中Chao 1指數則隨著發酵時間的延長先增高后降低，其中JS2和JS3的Chao 1指數較高，表明在發酵過程中這2個樣品中群落的豐富度較高。Shannon指數和Simpson指數在各樣品中的變化趨勢與Chao 1指數相似，即群落多樣性與群落豐富度呈現出相似的趨勢。這可能是由于農戶發酵紅腌菜樣品清洗后直接發酵，發酵液中食鹽含量較高不耐鹽的細菌生長受到抑制，而隨著發酵的進行，有些細菌逐漸適應了高鹽的環境，所以樣品中細菌群落的豐富度和多樣性較高；發酵后期發酵液的酸度逐漸增加，導致不耐酸的細菌逐漸消失，所以細菌群落的豐富度和多樣性逐漸下降。

2.2 基于OTU豐度的樣本聚類分析

如圖1細菌聚類結果顯示，工廠發酵紅腌菜樣品ZS3、ZS4、ZS5和ZS6相似性較高聚為一類，樣品ZS1和ZS2與其他樣品相似性都較低單獨聚類；農戶發酵紅腌菜樣品中JS2、JS3、JS4和JS5似性較高為一聚類，樣品JS1單獨聚類。從整個發酵過程中參與的細菌來看，無論是工廠發酵樣品還是農戶發酵樣品，紅腌菜發酵前期細菌群落結構隨著發酵的進行變化大，相似性較低；而發酵后期細菌群落結構趨于穩定，相似性較高。

圖1 OTU水平上樣本細菌群落聚類分析Fig.1 Cluster analysis of bacterial communities at OTU level

如圖2所示，工廠發酵紅腌菜樣品細菌群落結構信息主要集中在前3 個主成分，其累計方差貢獻率為96.33%，其中PC1的貢獻率為73.42%，PC2的貢獻率為22.91%。樣本之間的距離代表細菌群落結構的差異程度。不同發酵液樣本呈現出明顯的聚類趨勢， ZS1聚為 I類，ZS2聚為 II類，ZS3、ZS4、ZS5和ZS6聚為III類，這與UPGMA聚類分析結果一致。

圖2 OTU水平上樣本細菌群落PCAFig.2 PCA of bacterial community at OTU level

如圖2所示，農戶發酵紅腌菜樣品細菌群落結構信息主要集中在前2 個主成分，其累計方差貢獻率為93.94%，其中PC1的貢獻率為83.93%，PC2的貢獻率10.01%。樣本之間的距離代表細菌群落結構的差異程度。不同發酵液樣本呈現出明顯的聚類趨勢， JS1聚為 I類，JS2、JS3、JS4和 JS5聚為 II類，這與UPGMA聚類分析結果一致。

2.3 門水平細菌群落組成分析

如圖3所示，在門水平上，工廠發酵7 d樣品的優勢菌門（相對豐度＞1%）是變形菌門（Proteobacteria）（28.92%）、厚壁菌門（Firmicutes）（36.97%）、藍細菌門（Cyanobacteria）（4.79%）、放線菌門（Actinobacteria）（3.05%）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（1.97%）；工廠發酵14 d樣品的優勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）（16.47%）、厚壁菌門（Firmicutes）（79.49%）、藍細菌門（Cyanobacteria）（2.49%）；而其他發酵時間樣品的優勢菌門卻只有變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度分別為36.97%～97.93%和28.92%～1.50%。農戶發酵所有樣品的優勢菌門卻只有變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度分別為38.27%～60.09%和39.81%～61.46%。厚壁菌門和變形菌門是傳統發酵紅腌菜的主要菌門，這與Cao等[16-18]報道一致。兩種發酵方法細菌組成的變化都是隨著發酵時間的延長變形菌門的相對豐度逐漸降低，而厚壁菌門的相對豐度逐漸增高。這與Liang[4]、吳進菊[7]、Liu[19]、郝卓莉[20]等研究結果相一致。

圖3 門水平上細菌群落組成分析Fig.3 Analysis of bacterial community composition at phylum level

2.4 目水平細菌群落組成分析

如圖4所示，在目水平上，相同的發酵時間不同腌制方法樣品中所檢測到的優勢菌目（平均相對豐度＞1%）也具有明顯差異。工廠發酵樣品發酵7 d以芽孢桿菌目（Bacillales）（37.39%）、紅螺菌目（Rhodospirillales）（16.76%）、假單胞菌目（Pseudomonadales）（4.06%）、乳酸桿菌目（Lactobacillales）（3.43%）、微球菌目（Micrococcales）（1.73%）、腸桿菌目（Enterobacteriales）（1.38%）為優勢菌目；農戶發酵樣品發酵7 d 以腸桿菌目（Enterobacteriales）（47.83%）、乳酸桿菌目（Lactobacillales）（34.41%）、假單胞菌目（Pseudomonadales）（12.21%）、 梭 菌 目 （Clostridiales）（2.91%）為優勢菌目。

圖4 目水平上細菌群落組成分析Fig.4 Analysis of bacterial community composition at orders level

工廠發酵樣品發酵14 d以乳酸桿菌目（Lactobacillales）（76.74%）、腸桿菌目（Enterobacteriales）（9.50%）、芽孢桿菌目（Bacillales）（4.15%）、假單胞菌目（Pseudomonadales）（2.12%）為優勢菌目；工廠其他發酵時間樣品（21、28、35和42 d）中乳酸桿菌目（Lactobacillales）占絕對優勢，相對豐度分別為92.22%～98.05%。農戶發酵樣品發酵14 d及以后的樣品以乳酸桿菌目（Lactobacillales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、假單胞菌目（Pseudomonadales）、海洋螺菌目（Oceanospirillales）為優勢菌目，相對豐度分別為 53.13%～60.32%、23.20%～31.44%、12.04%～13.48%、1.14%～1.24%；隨著發酵時間的延長腸桿菌目的相對豐度逐漸降低，乳酸桿菌目的相對豐度逐漸增高，假單胞菌目和海洋螺菌目的相對豐度變化不大。

2.5 屬水平細菌群落組成分析

如圖5所示，工廠發酵紅腌菜整個發酵過程樣品可聚為3 類，ZS3、ZS4、ZS5和ZS6在屬水平細菌群落結構比較接近，歸為一類，ZS1和ZS2各歸為一類；農戶發酵紅腌菜整個發酵過程樣品可聚為2類，JS2、JS3、JS4和JS5樣品在屬水平細菌群落結構比較接近，歸為一類，JS1歸為一類，這與聚類分析和PCA結果一致。

圖5 屬水平上細菌群落組成分析Fig.5 Analysis of bacterial community composition at genus level

在屬水平上，工廠發酵樣品發酵7 d以芽孢桿菌屬（Bacillus）（25.57%）、葡萄糖醋酸桿菌屬（Gluconacetobacter）（11.52%）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）（5.11%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（2.93%）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（2.09%）、賴氨酸芽胞桿菌屬（Lysinibacillus）（2.05%）、海洋桿菌屬（Oceanobacillus）（1.56%）、慢生芽胞桿菌屬（Lentibacillus）（1.27%）、微桿菌屬（Exiguobacterium）（1.12%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（1.04%）為優勢菌；農戶發酵樣品發酵 7 d以乳球菌屬（Lactococcus）（20.62%）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（9.46%）、明串珠菌屬（Leuconostoc）（8.19%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（5.16%）、Clostridium sensu stricto1（2.69%）、泛生菌屬（Pantoea）（2.20%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（1.53%）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）（1.22%）為優勢菌。

工廠發酵樣品發酵14 d樣品以乳桿菌屬（35.13%）、魏斯氏菌屬（Weissella）（35.10%）、明串珠菌屬（6.13%）、厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus）（3.08%）、沙雷氏菌屬（Serratia）（1.63%）、果膠桿菌屬（Pectobacterium）（1.62%）、不動桿菌屬（1.20%）、泛生菌屬（1.14%）為優勢菌；農戶發酵樣品發酵14 d以乳桿菌屬（Lactobacillus）（29.72%）、乳球菌屬（16.35%）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（10.93%）、明串珠菌屬（Leuconostoc）（6.52%）、海單胞菌屬（Marinomonas）（1.20%）、泛生菌屬（1.05%）為優勢菌。

工廠其他發酵時間樣品（21、28、35和42 d）中乳桿菌屬（Lactobacillus）（96.45%、91.27%、96.96%和86.41%）占絕對優勢地位；農戶其他發酵時間樣品（21、28和 35 d）則以乳桿菌屬（Lactobacillus）（24.42%、29.76%和 28.77%）、乳球菌屬（18.26%、19.03%和 20.13%）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（12.47%、12.27%和12.24%）、明串珠菌屬（Leuconostoc）（12.67%、10.61%和10.88%）為優勢菌屬。

工廠發酵樣品發酵初期以芽孢桿菌屬、葡萄糖醋酸桿菌屬為主，發酵中期以乳酸桿菌屬和魏斯氏菌屬為主，發酵后期以乳酸桿菌屬為主；農戶發酵樣品發酵初期以乳球菌屬為主，發酵中后期以乳酸桿菌屬、乳球菌屬、不動桿菌屬、明串珠菌屬為主，這與文獻[6-7,20-21]等研究結果不一致。馬歡歡等[22]研究發現，魏斯氏菌是韓國泡菜的優勢乳酸菌之一，而四川泡菜在發酵過程中基本不含或僅含少量的魏斯氏菌。與農戶發酵樣品不同，工廠發酵樣品中魏斯氏菌屬和葡萄糖醋酸桿菌屬是優勢菌之一，魏斯氏菌屬作為乳酸菌除了具有產酸特性以外，還是食品風味形成的重要貢獻者[23]，其可以增加食品中有機酸、酯類等物質的含量，提高發酵食品的風味[24]；而葡萄糖醋酸桿菌可用于發酵葡萄糖酸[25]。

工廠發酵和農戶發酵樣品中細菌菌群組成的差異可能與調味品的成分有關，也可能與生產工藝、環境條件有關。有研究表明蔬菜基質或調味品成分是蔬菜發酵中本土微生物群的主要來源，生菜清洗方法、鹽度和pH都可能影響發酵過程中的微生物群落組合[26]。生產工藝或環境條件（如溫度、濕度）不僅影響發酵微生物群落的組成和結構，也是影響蔬菜發酵和發酵產品最終質量的重要因素[27-28]。紅腌菜是一種傳統的蔬菜發酵產品，其發酵微生物是由原料和環境自發發酵產生的本地微生物群，而自發發酵的最終產品的營養和感官特性主要依賴于本地微生物群落[29]。有證據表明，細菌群落的結構多樣性，尤其是乳酸菌與感官屬性、營養素和發酵產品的質量密切相關[30]。乳酸菌可將原料中的小分子糖類物質轉化為酸類和醇類化合物，這兩類物質反應進一步形成酯類化合物，賦予產品柔和的酸味、酯香和醇香等特征。總體來說，乳酸菌是紅腌菜發酵過程中主要優勢菌，但兩種發酵方式不同種屬乳酸菌的豐度差別顯著。

2.6 菌群代謝功能預測

在 KEGG 生物代謝通路分析數據庫中主要包括環境信息加工、代謝、遺傳信息加工、細胞加工、人類疾病、生物有機系統六大類。如圖6所示，紅腌菜發酵過程中細菌群落的預測功能可分為4類（平均相對豐度＞1%），工廠發酵樣品和農戶發酵樣品不同發酵時間的平均相對豐度分別為代謝（metabolism）（78.40%、80.75%）、遺傳信息處理（genetic information processing）（14.10%、11.57%）、環境信息處理（environmentalinformationprocessing）（4.42%、3.84%）、細胞過程（cel-lularprocesses）（2.42%、3.07%），說明紅腌菜發酵過程中70%以上的細菌參與了原料的代謝，而多種微生物的生長代謝促進了芥菜的感官品質及營養的變化。

圖6 紅腌菜發酵過程中細菌群落所預測到KEGG一級通路相對豐度圖Fig.6 Relative abundance of KEGG primary pathway predicted by bacterial community during fermentation of red pickles

如圖7所示，工廠發酵樣品和農戶發酵樣品的代謝功能包括碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）（16.40%、15.45%）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）（11.45%、11.08%）、輔助因子和維生素代謝（metabolism of cofactors and vitamins）（10.95%、11.43%）、其他氨基酸代謝（metabolism of other amino acids）（9.51%、8.49%）、外源生物降解和代謝（xenobiotics biodegradation and metabolism）（7.15%、7.26%）、脂質代謝（lipid metabolism）（7.27%、6.43%）、能量代謝（energy metabolism）（5.33%、5.15%）、萜類化合物和聚酮化合物代謝（metabolism of terpenoids and polyketides）（4.08%、8.86%）、多聚糖的生物合成和代謝（glycan biosynthesis and metabolism）（2.87%、2.74%）、核苷酸代謝（nucleotide metabolism）（2.22%、1.92%）、其他次生代謝產物的生物合成（Biosynthesis of other secondary metabolites）（1.17%、1.95%）。工廠發酵樣品和農戶發酵樣品的遺傳信息處理功能包括復制與修復（replication and repair）（7.00%、5.20%）、翻譯（translation）（3.51%、2.89%）；此外，工廠發酵樣品還包括轉錄（transcription）（2.86%）和折疊分選與降解（folding，sorting and degradation）（2.33%）兩條通路。細胞過程功能工廠發酵樣品只涉及到細胞生長和死亡（Cell growth and death）（1.42%）一條功能通路，農戶樣品包括細胞運動（cell motility）（1.43%）、細胞生長和死亡（Cell growth and death）（1.13%）兩條通路。工廠發酵樣品中細菌群落的基因功能主要是碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、其他氨基酸代謝四條KEGG途徑；農戶發酵樣品中細菌群落的基因功能主要是碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、萜類化合物和聚酮化合物代謝、其他氨基酸代謝五條KEGG途徑。

圖7 紅腌菜發酵過程中細菌群落所預測到KEGG二級通路相對豐度圖Fig.7 Relative abundance of KEGG secondary pathway predicted by bacterial community during fermentation of red pickles

3 結 論

利用Illumina Miseq高通量測序技術對紅腌菜發酵過程中的細菌多樣性進行了解析，并結合PICRUSt軟件預測細菌功能的變化。研究發現工廠發酵紅腌菜和農戶發酵紅腌菜不同發酵時間的樣品測序共獲得有效序列分別為332195和1391172條，經抽平處理后可聚類得到OTU分別為494和388個。在整個發酵過程中，門水平上，工廠發酵和農戶發酵的樣品中變形菌門和厚壁菌門占據了絕對的優勢，兩者相對豐度之和分別達到65.88%～99.43%、99.17%～99.89%；目水平上，發酵前期工廠發酵樣品以芽孢桿菌目（33.25%）為優勢菌目，農戶發酵樣品以腸桿菌目（46.23%）為優勢菌目，后續發酵過程中均以乳酸桿菌目為優勢菌目，相對豐度分別為 75.40%～97.69%、54.04%～61.21%；屬水平上，工廠發酵樣品發酵前期以芽孢桿菌屬為優勢菌屬，相對豐度為22.94%，乳酸桿菌屬為發酵后期的優勢菌屬相對豐度為86.41%～96.96%；農戶發酵樣品發酵前期以乳球菌屬為優勢菌屬，相對豐度為20.62%，發酵中后期以乳球菌屬、不動桿菌屬、乳酸桿菌屬、明串珠菌屬為優勢菌屬，發酵過程中此消彼長。工廠發酵樣品中細菌群落的基因功能主要是碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、其他氨基酸代謝四條 KEGG 途徑；農戶發酵樣品中細菌群落的基因功能主要是碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、萜類化合物和聚酮化合物代謝、其他氨基酸代謝五條 KEGG 途徑。本研究提高了對傳統發酵和工廠改進紅腌菜發酵過程中細菌群落結構、動態變化的了解，可為乳酸菌發酵劑的篩選、傳統紅腌菜的工業化生產提供理論依據；但本研究未對發酵過程中風味物質的組成及不同階段風味物質的變化趨勢進行監測，傳統發酵紅腌菜中風味物質與菌群的關系還需進一步探索。