丙酮酸對Bacillomycin D合成的影響及調控

馬文杰，鐘 裔，陸兆新，張 平，陳詩蕾，秦 淼，呂鳳霞，趙海珍，別小妹

（南京農業大學食品科技學院，江蘇南京 210095）

Bacillomycin D是芽孢桿菌中產生的一類環狀抗菌脂肽[1]，屬于Iturin家族[2]，由一條含有14～17個碳原子的β-氨基脂肪酸鏈和一條七肽鏈縮合而成[3]。Bacillomycin D對黃曲霉菌、赭曲霉菌、念珠菌、禾木科鐮刀菌等真菌的生長具有一定抑制作用[4-7]，對肺泡腺癌、腎癌、結腸癌及胃癌等癌細胞有選擇性毒性，能夠誘導細胞凋亡[8-11]。此外，作為一種天然抗菌脂肽，Bacillomycin D具備安全、高效、易降解等多重優勢[12]，有望成為化學抑菌劑的良好替代品，在糧食貯藏、食品安全[13]、臨床治療、生物防治[14]方面具有極高的開發價值和應用前景。但天然抗菌脂肽的生產效率問題一直是制約其大規模生產和應用的關鍵因素，如何提高微生物源抗菌脂肽產率也是研究人員致力克服的一大問題。

在微生物發酵過程中，培養基優化是提高次級代謝產物產量的重要手段。目前對Bacillomycin D的培養基優化主要集中在碳源、氮源以及金屬離子等三個方面。Qian等[15]發現以30 g/L菊糖代替葡萄糖作為碳源可使Bacillomycin D產量達到252.43 mg/L，L-gln能顯著增強B.amyloliquefaciensfmbJ合成Bacillomycin D的能力，可將產量提高至199.72 mg/L[16]，外源添加7 g/L L-乳酸鈣可使Bacillomycin D產量達到322.88 mg/L[17]。何婷婷[18]采用包含蔗糖、谷氨酸鈉、玉米漿、KH2PO4和MgSO4·7H2O等成分的培養基將Bacillomycin D的產量提升到了原始Landy培養基的2倍。李偉等[19]使用麥芽糖漿、尿素、玉米漿、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、K2HPO4和MnSO4·H2O等組成的優化培養基將枯草芽孢桿菌M364的Bacillomycin D產量提高了50%。除此之外，在發酵培養基中添加相應的前體物質或前體合成所需底物是促進次級代謝產物合成最直接的方法，這一理論已經在一些脂肽的研究中得到了證實[20]，但在Bacillomycin D的發酵生產中還沒有相關嘗試。

此外，通過基因工程的方法提高前體利用效率或者減弱前體競爭途徑也是促進抗菌脂肽高效合成的重要方法。在Surfactin的生產中，通過基因編輯將pps和pks等脂肪酸前體的競爭途徑失活，同時將外源硫酯酶（TE）過表達，間接地增加Surfactin合成反應中的脂肪酸前體供應，可以使得Surfactin的產量提升至對照組的6.4倍[21]。通過設計支鏈脂肪酸生物合成途徑，增加前體支鏈脂肪酸的供應，也可以使得Surfactin產量有數倍乃至數十倍的提高[22]。由此可見，通過探究脂肽的合成途徑，從基因水平上增加前體供應，構建基因工程菌將是進一步縮小成本、提高產量的潛在方向。

Bacillomycin D是在聚酮合酶-非核糖體肽合酶（Polyketide synthase-nonribosomal peptide synthase，PKS-NRPS）共同催化下合成的，以酰基輔酶A以及Asn、Tyr、Pro、Glu、Ser和 Thr等六種氨基酸為直接前體[23]。其中酰基輔酶A以乙酰輔酶A作為底物合成，理論上提高乙酰輔酶A的胞內含量可以促進Bacillomycin D合成前體供應，但乙酰輔酶A價格昂貴，直接在培養基中添加乙酰輔酶A即使能夠提高Bacillomycin D的產量，也會導致其生產成本成倍增加，因而促進乙酰輔酶A的上游合成是提高其胞內含量的重要途徑。丙酮酸是糖酵解反應的最終底物，是胞內乙酰輔酶A的主要來源之一，是菌體維持各項生理活動的重要中間物質[24]，本文分別從外源添加和基因工程兩方面增加丙酮酸或乙酰輔酶A的供應，期望能夠促進Bacillomycin D的合成，從而找到提高Bacillomycin D產量的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

B.amyloliquefaciensfmbJ（菌種保藏號為CGMCC No.0943）、E.coliJM109、Aspergillus flavus南京農業大學酶工程實驗室；E.coliJM110感受態細胞 北京金沙生物科技有限公司；丙酮酸 上海麥克林生化科技有限公司；細菌總RNA提取試劑盒TransZolTMUP Plus RNA Kit 北京全式金生物技術有限公司；反轉錄試劑盒HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、one step cloning kit 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；LB培養基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 調至 7.0～7.2，固體培養基每100 mL另外添加2 g瓊脂；種子培養基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3 g/L，NaCl 5 g/L，pH調至7.0～7.2；基礎 Landy培養基（發酵培養基）：葡萄糖20 g/L，酵母浸膏 1 g/L，L-谷氨酸 5 g/L，KCl 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CuSO4·5H2O 0.15 mg/L，FeSO4·7H2O 1.2 mg/L，MnSO45 mg/L，pH調至7.0。

PowPacTM HC164-5052高電流電泳儀、Micro-Pulser微生物電穿孔儀 美國Bio-Rad生命醫學產品有限公司；ABI quant studio 5熒光定量PCR儀美國ABI公司；PTC-100TM PCR儀 MJ Research公司；Ultimate3000高效液相分析系統 美國Dionex公司；UV-2450紫外分光光度計、C18反相色譜柱日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 丙酮酸外源添加 按照終濃度（體積分數）0.05%、0.075%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%將丙酮酸添加到滅菌的發酵培養基中，用除菌的4 mol/L NaOH調整培養基pH至7.0左右。

1.2.2 菌株發酵 將-20 ℃保存的B.amyloliquefaciensfmbJ在LB固體培養基上劃線，置于37 ℃恒溫培養箱靜置培養12～16 h，挑單菌落于LB培養基中37 ℃，180 r/min過夜活化。將活化后的菌液按照50倍稀釋度接入種子培養基，37 ℃，180 r/min培養至OD600達到0.8～1.0。按照5%的接種量接種到各組發酵培養基中，33 ℃，180 r/min發酵120 h。

誘導型過表達菌株發酵的具體操作與上述基本相同，但菌株活化、發酵所用培養基均添加終濃度5 μg/mL的氯霉素，以保證發酵過程中無雜菌污染。在發酵液OD600達到0.8左右時向發酵液中添加IPTG溶液，設置IPTG終濃度梯度為0、50、100和200 mg/L。

1.2.3 Bacillomycin D提取及檢測 發酵結束后，將發酵液轉移至離心管中，8000 r/min離心20 min，收集上清液，6 mol/L HCl調整pH至2.0，4 ℃靜置過夜。重復上述離心步驟，棄上清，收集沉淀于離心管底，按照100:2的比例加入甲醇使沉淀重懸，2 mol/L NaOH調整重懸液pH至7.0，置于超聲清洗器中超聲處理50 min，再次離心取上清獲得Bacillomycin D粗提液。粗提液過直徑0.22 μm的濾膜，通過HPLC對Bacillomycin D進行定量檢測，檢測波長為207 nm，檢測條件見表1，其中流動相A為含1‰三氟乙酸的乙腈，流動相B為含1‰三氟乙酸的水。參照錢時權[17]報道的標準曲線進行Bacillomycin D產量計算：y=7.6396x-2.3576，R2=0.9999，x表示Bacillomycin D 濃度，mg/L；y 表示峰面積，mAU·h。

表1 HPLC檢測條件Table 1 Detection conditions of HPLC

1.2.4 RT-PCR 分別取丙酮酸調控下fmbJ發酵24、36、48和60 h的菌液樣品，采用TransZolTMUPPlus RNA Kit提取fmbJ的總RNA，具體步驟參照試劑盒說明書。然后按照HiScript III RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）試劑盒說明書獲取 cDNA。反應結束后采用NanoDrop 2000測定所得cDNA濃度，置于-20 ℃冰箱備用。

通過RT-PCR檢測Bacillomycin D合成基因bamA、bamB、bamC、bamD和TE，調控因子編碼基因comA、comP、comQ、degU、degQ、spo0A、codY、rapC、rapI、sigH、sigM、sigV、abrB，以及編碼丙酮酸和乙酰輔酶A合成相關酶的pyk和acs基因的表達量的變化。反應體系為上下游引物以及cDNA各 1 μL，Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，并用 ddH2O 補充至 20 μL，將配制完成的反應液轉移至RT-PCR儀上進行兩步法擴增，反應程序參照文獻[25]。以16S rRNA為內參基因，用2-ΔΔCt法分析目的基因的表達。引物序列如表2。

表2 RT-PCR所需引物Table 2 Oligonucleotide primers for RT-PCR

1.2.5acs、pyk基因過表達菌株構建

1.2.5.1 引物設計 根據B.amyloliquefaciensfmbJ全基因組測序結果，設計過表達載體構建所需引物序列如表3。

表3 過表達載體構建所需引物Table 3 Primers required for the construction of overexpression vectors

1.2.5.2acs、pyk過表達載體構建 采用無縫克隆的方法構建過表達載體。以pHT43質粒為模板，以pHT-F/R為上下游引物，通過PCR反應擴增載體框架pHT01。同時以B.amyloliquefaciensfmbJ基因組為模板，分別以acs-pHT-F/R、pyk-pHT-F/R為上下游引物，擴增得到目的基因acs、pyk，所得PCR反應產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳及GelRed染色檢測，對條帶大小正確的片段進行切膠回收。

在one step cloning kit的作用下，將pHT01線性載體框架分別與acs、pyk片段連接起來，并轉化至E.coliJM109感受態細胞，挑取陽性轉化子轉接至含有氨芐青霉素（100 mg/mL）的LB液體培養基中，37 ℃，180 r/min 培養 12～16 h，按照質粒提取試劑盒說明書所述方法提取質粒pHT01-acs、pHT01-pyk。將驗證正確的pHT01-acs、pHT01-pyk質粒繼續轉化至E.coliJM110感受態，挑取陽性轉化子提取獲得去甲基化的過表達質粒。質粒構建示意圖如圖1。

圖1 pHT01-pyk和pHT01-acs的質粒構建示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasmid construction of pHT01-pyk and pHT01-acs

1.2.5.3acs、pyk過表達菌株構建 首先制備B.amyloliquefaciensfmbJ感受態，并通過電轉化的方法將去甲基化的pHT01-acs、pHT01-pyk轉入B.amyloliquefaciensfmbJ中，具體方法參照文獻[25]所述。轉化菌株涂布于含有氯霉素（5 μg/mL）的LB固體平板上，37 ℃倒置培養24 h。挑取長出的單菌落進行菌落PCR驗證和測序驗證，驗證正確的轉化子即為acs、pyk的誘導型過表達菌株，分別命名為fmbJ-acs、fmbJ-pyk。

1.3 數據處理

本文所涉實驗重復3次，所有圖形采用Graph-Pad Prism 9.0繪制，并采用SPSS 19進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 丙酮酸對Bacillomycin D產量的影響

以B.amyloliquefaciensfmbJ菌株在基礎Landy培養基中的發酵產物作為對照，分別測定了不同濃度丙酮酸對Bacillomycin D產量的影響，結果如圖2。與對照組相比，當丙酮酸添加濃度為0.05%時，Bacillomycin D產量沒有顯著變化（P＞0.05）；在添加濃度為0.075%時，Bacillomycin D產量極顯著提高（P＜0.001），達到 485.85 mg/L，約為對照組（344.45 mg/L）的1.41倍；在添加濃度為0.10%時，處理組產量顯著提高（P＜0.01），達到 429.51 mg/L，為對照組產量的1.25倍，但顯著低于0.075%丙酮酸處理組（P＜0.05）；當添加濃度增加至0.15%～0.50%，處理組產量與對照組差異不顯著（P＞0.05）；當添加濃度達到0.75%時，Bacillomycin D 產量顯著降低（P＜0.001），而當丙酮酸添加濃度繼續升高至1.00%，發酵產物的脂肽粗提液中基本檢測不到Bacillomycin D，且各平行處理組間情況一致。由此可見，較低濃度的丙酮酸能夠促進Bacillomycin D的合成，而高濃度的丙酮酸會抑制Bacillomycin D的合成。

圖2 丙酮酸對Bacillomycin D產量的影響Fig.2 Effect of pyruvate on the yield of Bacillomycin D

2.2 丙酮酸對Bacillomycin D合成基因表達的影響

結合上述結果，丙酮酸外源添加濃度為0.075%時，最大程度提高了Bacillomycin D的產量。為了進一步驗證丙酮酸對Bacillomycin D合成的促進作用，本研究通過RT-PCR，分析了此條件下丙酮酸對Bacillomycin D合成基因表達的影響。

Bacillomycin D的合成操縱子包括4個ORF，即bamD、bamA、bamB和bamC[26]，分別編碼BamD、BamA、BamB和BamC四個亞基。其中，TE結構域（由TE基因編碼）位于BamC的C末端，主要負責Bacillomycin D的環化和釋放。本研究主要針對上述5個基因的表達量進行了檢測，結果如圖3。在發酵初期即發酵24～36 h，丙酮酸顯著上調了bamD、bamA、bamB和bamC的表達（P＜0.05），最大上調倍數分別可達對照組菌株的5.80、4.19、7.13和5.72倍。而在發酵 48和 60 h，bamD、bamA、bamB和bamC的表達均較對照組出現不同程度的下調。但TE的表達在發酵24～60 h內均呈現顯著上調（P＜0.05），上調倍數最大可達2.91倍。

圖3 丙酮酸對Bacillomycin D合成基因表達的影響Fig.3 Effects of pyruvate on the expression of Bacillomycin D synthetic gene

由此可見，丙酮酸可以在加速Bacillomycin D的合成裝配，促進其環化及釋放，并最終促進Bacillomycin D產量的提高。但這種促進作用主要體現在B.amyloliquefaciensfmbJ發酵前期，隨著發酵時間的延長，丙酮酸逐漸被消耗殆盡，促進作用逐漸減弱，Bacillomycin D的合成趨于平穩。

2.3 丙酮酸對B.amyloliquefaciens fmbJ調控因子表達的影響

研究表明，部分調控因子對Bacillomycin D的合成具有明顯的調節作用。因此，本研究繼續檢測了丙酮酸調控下，B.amyloliquefaciensfmbJ部分調控因子表達量的變化。所得結果如圖4所示：在發酵24 h時，丙酮酸對調控因子表達的影響較顯著，comA、comP、comQ、degU、degQ和spo0A的表達量顯著（P＜0.01 或P＜0.001）） 上調，上調倍數分別可達對照組的 24.57、25.30、18.33、2.56、8.95和 7.14倍。在發酵36 h時，大多數調控因子的表達均有不同程度的下調，其中包括負調控因子abrB的表達顯著下調（P＜0.001），僅為對照組的0.47倍；當發酵時間達到48 h，degU、spo0A、rapI和sigV基因顯著上調（P＜0.05），上調倍數分別可達到對照組的2.18、1.83、5.83和2.25倍，與此同時，rapC的表達顯著下調（P＜0.05），僅能達到對照組的 0.16倍；在發酵60 h時，degU和sigH的表達顯著上調（P＜0.001），rapC的表達仍顯著下調（P＜0.05），并且自發酵48 h起，各調控因子表達開始與對照組趨近，這也與上述所得隨著發酵時間延長，丙酮酸的調控效果逐漸減弱的結論是相符的。但值得注意的是，在發酵36 h時，多個調控因子均較對照組顯著下調，這可能與丙酮酸的外源添加使得Bacillomycin D合成反應提前有關。有文獻報道，Bacillomycin D產量在發酵36～48 h后才開始快速增加[17,27]，但在本研究中，在fmbJ菌株發酵24 h時，多個調控因子以及Bacillomycin D合成基因的顯著上調表明fmbJ在這一階段的Bacillomycin D合成能力顯著增強，這從基因水平上證明了丙酮酸調控下fmbJ中Bacillomycin D合成反應提前，而這所帶來的營養物質消耗和菌體滲透壓變化會使得一些轉錄調控因子表達量在達到一定水平后出現顯著下降[28]，從而導致圖4中36 h所示結果，但隨著Bacillomycin D的繼續合成，在胞內應激反應調節下，各調控因子的表達會逐漸恢復正常，這也與本研究所得結果是一致的。

此外，由圖4可見，在發酵24和36 h內，丙酮酸可以上調乙酰輔酶A合成酶的表達，這為胞內乙酰輔酶A含量的增加提供了積極條件。

圖4 丙酮酸對調控因子表達的影響Fig.4 Effects of pyruvate on the expression of regulatory factors

2.4 acs、pyk基因過表達載體構建

由以上結果可見，在發酵培養基中添加丙酮酸可以顯著提高Bacillomycin D的產量，且丙酮酸的添加也在基因水平上促進了乙酰輔酶A合成酶的表達。然而利用基因工程的方法，直接促進丙酮酸和乙酰輔酶A的合成能否實現相同的效果仍有待進一步研究。因此，本研究分別構建了pyk和acs基因的誘導型過表達菌株。

首先以B.amyloliquefaciensfmbJ基因組為模板，擴增得到acs、pyk的基因片段，產物長度應分別為1719和1737 bp；同時以pHT43質粒為模板，擴增得到pHT線性載體，產物長度應為7858 bp。擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖5A，acs、pyk以及pHT線性載體產物條帶大小與預期相符。經無縫克隆連接后，將連接產物轉入E.coliJM109感受態細胞中，挑取PCR驗證陽性的轉化子提取質粒后繼續轉入E.coliJM110感受態細胞中，此時提取得到的質粒已完成去甲基化，將其通過電轉化的方法轉入B.amyloliquefaciensfmbJ中，平板上長出的單菌落首先通過 PCR驗證，結果如圖5B，pHT01-acs、pHT01-pyk陽性轉化子PCR產物的理論值應分別為1891和1909 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測所得結果與之基本相符。同時，陽性轉化子中過表達質粒上插入片段的測序序列也與預期完全一致，此時獲得的陽性轉化子即為誘導型過表達菌株B.amyloliquefaciensfmbJ-acs和 fmbJ-pyk。

圖5 B.amyloliquefaciens fmbJ-acs和fmbJ-pyk的構建及驗證Fig.5 Construction and verification of B.amyloliquefaciens fmbJ-acs and fmbJ-pyk

2.5 pyk和acs過表達對Bacillomycin D產量的影響

理論上，IPTG添加量越高，基因過表達程度越高。如圖6可見，在fmbJ-pyk的發酵實驗中，添加了50 mg/L IPTG的處理組Bacillomycin D產量為207.88 mg/L，較同批次對照組產量（155.02 mg/L）極顯著提高（P＜0.001），為對照組的1.34倍。但隨著IPTG添加量的繼續增加這種提高作用反而逐漸減弱，在fmbJ-acs的發酵實驗中也出現了類似的情況：添加了50 mg/L IPTG的處理組Bacillomycin D產量為 200.42 mg/L，為對照組（172.84 mg/L）的 1.16倍（P＜0.01），之后隨著IPTG添加量的逐漸提高，產量開始降低，當IPTG添加量為200 mg/L時，fmbJ-acs的Bacillomycin D產量甚至顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖6 pyk和acs基因過表達對Bacillomycin D產量的影響Fig.6 Effects of pyk and acs overexpression on Bacillomycin D yield

結合上述結果，當丙酮酸激酶過表達達到一定水平后，Bacillomycin D的產量不會隨其表達量的提高而提高，反而會逐漸恢復到與對照組相似的產量。為了進一步探究其對Bacillomycin D合成的影響，本研究檢測了丙酮酸對fmbJ-pyk的Bacillomycin D產量的影響，結果如圖7所示：在0.075%的丙酮酸調控下，50 mg/L IPTG誘導的fmbJ-pyk處理組Bacillomycin D產量較對照組提高了1.1倍，低于50 mg/L IPTG誘導的fmbJ-pyk的產量。由此可見，在基礎Landy培養基條件下，外源添加丙酮酸、過表達丙酮酸激酶或者乙酰輔酶A合成酶均可以促進Bacillomycin D的合成，但這種促進作用具有一定的濃度依賴性。

圖7 丙酮酸對fmbJ-pyk的Bacillomycin D產量的影響Fig.7 Effect of pyruvate regulation on Bacillomycin D yield of fmbJ-pyk

3 討論與結論

本研究首先通過外源添加丙酮酸，研究了增加胞內丙酮酸供應對Bacillomycin D合成的影響。結果發現在終濃度0.075%的丙酮酸調控下，B.amyloliquefaciensfmbJ的Bacillomycin D產量可達到485.85 mg/L，較對照組顯著提高41%，是目前在基礎Landy培養基中通過單體調控得到的較高產量，Bacillomycin D合成基因的上調也從基因水平上證實了這一提高作用。通過對丙酮酸代謝通路的分析，可以發現丙酮酸是乙酰輔酶A的重要來源之一，提高胞內丙酮酸含量可以促進其轉化為乙酰輔酶A，進而為Bacillomycin D的脂肪酸鏈合成提供前體物質；同時也可以加速三羧酸循環，促進氨基酸合成和胞內能源物質的產生，從而促進Bacillomycin D的合成[29]。此外，正如本研究所報道的，在發酵24 h時，comA、comP、degQ、degU、spo0A、sigH、sigM的表達顯著上調，這些調控因子涉及生物被膜形成、芽孢形成、DNA轉錄、胞內蛋白分泌等多種生理過程[30]，其上調均可對Bacillomycin D的合成發揮正調控作用[31-32]；CodY是一個全局調控因子，其對Bacillomycin D合成的促進作用具有一定的濃度依賴性，在一定程度的積累也有利于Bacillomycin D的合成[32]；而rapC的表達呈現下調趨勢，已知敲除rapC會促進Bacillomycin D的合成，可見其下調有利于Bacillomycin D的合成[33]；Spo0A對全局調控因子AbrB也有一定抑制作用[34]，AbrB能夠抑制細菌中100多種基因的表達，且在一些Bacillomycin D產量降低的處理組也檢測到了abrB表達量的上調[35]，因而其下調極有可能對Bacillomycin D產量提高起到積極作用。綜上所述，在發酵前期丙酮酸上調了正調控因子的表達，使得Bacillomycin D的合成反應提前，而在發酵的后期，丙酮酸可以上調關鍵正調控因子的表達，同時下調負調控因子的表達，維持Bacillomycin D的持續合成，從而使得Bacillomycin D合成周期變長，并最終提高Bacillomycin D的產量。綜合上述結果，可得到如圖8所示調控圖。

圖8 丙酮酸對Bacillomycin D合成調控機制的探索Fig.8 Exploration of the regulatory mechanism of pyruvate on Bacillomycin D synthesis

丙酮酸激酶催化糖酵解過程中丙酮酸和ATP的生成，在調節碳通量分布中起關鍵的作用。通過過表達丙酮酸激酶能夠促進葡萄糖的利用和胞內ATP、NADH的產生[36-37]，從而起到與外源添加丙酮酸相似的作用。本研究也證實了這一點：在一定程度上過表達丙酮酸激酶可以促進Bacillomycin D的產量提高為對照組的1.34倍。此外，除了葡萄糖等糖類物質，乙酸、乙醇等其他碳源在乙酰輔酶A合成酶的催化下也可轉化為乙酰輔酶A。已有研究報道，過表達乙酰輔酶A合成酶能夠提高胞內乙酰輔酶A的含量[38]。這與本文的結果是一致的，本文構建的乙酰輔酶A合成酶過表達菌株fmbJ-acs的Bacillomycin D產量較野生菌也提高了16%。

這種直接從基因水平上促進Bacillomycin D合成的方法在降低生產成本方面具有重要意義。但也可以看到，丙酮酸激酶和乙酰輔酶A合成酶過表達對Bacillomycin D的產量提高具有一定的濃度依賴性。然而對于丙酮酸激酶而言，如果能夠在其過表達的同時，實現丙酮酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等其他丙酮酸代謝酶的過表達，可以促進丙酮酸的進一步轉化[39-40]，從而有可能促進Bacillomycin D產量的進一步提高。而對于乙酰輔酶A合成酶，這與本文選擇的基礎培養基類型是有關系的。因為基礎培養基中營養物質有限，不能夠持續為乙酰輔酶A的合成提供足夠的底物，但如果在fmbJ-acs的發酵培養基中分批補料乙醇、乙酸等可以直接用于合成乙酰輔酶A的物質[41]，并將發酵體系擴大，隨著底物量的充足及各方面設施的完備，Bacillomycin D產量也有可能獲得大幅提高，這為尋找更有效的提高Bacillomycin D產量的方法開辟了新的思路。