正交試驗優化超聲波-復合酶水解法提取中華鱉油的工藝

單錢藝，沈岳明，張明興，唐嘉誠，陳彥婕，包建強,4,5,

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；

2.上海市靜安區市場監督管理局，上海 200072；3.寧波市明鳳漁業有限公司，浙江寧波 315464；

4.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；

5.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306）

中華鱉作為我國最為常見的養殖鱉類，截止至2020年我國鱉類養殖產量已高達33.26萬噸，二十年間其養殖產量增長近十倍[1]。中華鱉油脂對動脈硬化有很好的預防作用，能減輕機體中膽固醇的沉積[2]，調節胰島素抵抗（IR）[3]，也逐步得到中老年消費者認可。

國內水產品加工副產物傳統油脂提取方法有壓榨法、稀堿水解法、超聲波有機溶劑提取法等。傳統物理提油法如壓榨法工藝簡單，但浪費嚴重，提油效率較低；稀堿水解法所得產物過氧化值和酸值過高；超聲波有機溶劑提取法易溶劑殘留、污染環境等問題。而目前新興的油脂提取方法有亞臨界流體萃取法、超臨界流體萃取法、復合酶水解法等。超臨界流體萃取法提取效率高，但其設備成本問題應用于工業化生產仍有局限性。目前復合酶水解法以反應溫和、工業化生產難度低等優點在油脂加工中得到普及，Rubio-Rodriguez等[4]發現酶水解后產生的酶解液含有多種氨基酸還可再利用制作成各類風味調味品。由于酶價格昂貴，酶解時間長等問題，采用超聲波-復合酶水解法可進一步降低成本、提高提油率。此法已被應用于核桃油、木棉籽油、柑橘皮油、米胚油、辣木籽油等植物油脂的提取[5-9]，但此法應用于提取動物油脂卻鮮有報道。本實驗以中華鱉加工副產物為原料，以超聲波協同復合酶水解方式，研究料液比、蛋白酶用量、酶比例、酶水解時間、酶水解溫度、超聲功率和超聲時間對中華鱉油提取率的影響，獲得最佳提取工藝條件，同時對其精制對其理化性質、脂肪酸組分進行分析。為今后規模化綜合利用中華鱉加工副產物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

養殖中華鱉加工副產物（包括頭部、頸部、足部）中的淡黃色脂肪塊、鮮活中華鱉（平均每只在1300 g左右） 寧波市明鳳漁業有限公司；超聲波-復合酶水解法所得中華鱉油 實驗室自制；中性蛋白酶（200000 U/g）、堿性蛋白酶（200000 U/g）、酸性蛋白酶（100000 U/g）、木瓜蛋白酶（180000 U/g）、胃蛋白酶（120000 U/g）、胰蛋白酶（130000 U/g） 四川寶順生物科技有限公司；氯化鈉、氫氧化鉀、冰乙酸、氫氧化鈉、磷酸、石油醚、乙酸乙酯、正已烷、無水乙醇、三氟化硼甲醇溶液（14%）均為化學純，甲醇、正已烷均為色譜級 國藥集團化學試劑有限公司；37種脂肪酸甲酯混標 美國默克公司；食品級白土紅宇漂土科技有限公司。

LXJ-IIB型飛鴿牌低速大容量多管離心機 上海安亭科學儀器廠；HB10型德國艾卡數顯型加熱鍋德國IKA公司；DHG-9073BS-III型新苗恒溫鼓風干燥機 上海新苗醫療器械制造有限公司；DKS28型精宏恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機 武漢格萊莫檢測設備有限公司；力辰旋轉蒸發儀 上海力辰儀器科技有限公司；PB-10型酸度計 德國Sartorius公司；電烘箱上海雋思實驗儀器有限公司；ME204E型梅特勒-托利多電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；KQ-300VD型三頻數控超聲波清洗機 昆山舒美超聲儀器有限公司；UV3000PC型美譜達紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；Nexis GC-2030型島津氣相色譜儀（含氫火焰離子檢測器） 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 將活中華鱉洗凈急殺，從中華鱉頭部、頸部、足部取出30 g左右淡黃色塊狀脂肪，用蒸餾水洗凈血水并瀝干，將其勻漿呈糜狀，分6份以每份5 g左右進行分裝，為防止其氧化變質，將脂肪塊抽真空密封，于-18 ℃低溫冰柜存放。實驗前將樣品于0～4 ℃冰箱解凍，備用。

1.2.2 蛋白酶的篩選 依據實驗選定的六種蛋白酶的不同最適酶解溫度[10-11]，按料液比1:1來添加蒸餾水和解凍后的脂肪塊勻漿，不同種蛋白酶均以2%酶用量（占油重，下同），酶解2 h，另不添加蛋白酶作空白樣進行實驗對照。以中華鱉油提取率為參考指標來判斷提取效果，從中選取提取效果較好的兩種蛋白酶，按蛋白酶用量占油重質量，以對應蛋白酶比例（以下簡稱酶比例，即中性蛋白酶與堿性蛋白酶之比）分別準確稱取中性蛋白酶與堿性蛋白酶并對其混合作為復合蛋白酶，pH控制在7.5～8.5范圍內進行酶解。

1.2.3 中華鱉油的提取 中華鱉加工副產物脂肪勻漿于0～4 ℃解凍，將解凍后5 g左右樣品按料液比1:2添加蒸餾水及2%蛋白酶用量（中性蛋白酶與堿性蛋白酶按1:1混合），進行20 min（功率180 W）超聲處理，并在50 ℃恒溫條件下進行2 h酶解反應，酶解后在在離心機中離心（轉速5000 r/min，時間25 min），離心后提取酶解液上層油脂層，稱重并計算得到中華鱉油提取率，平行試驗三次取平均值。中華鱉油提取率（%）=提取后鱉油的質量（g）/提取前脂肪塊的總質量（g）×100。

1.2.4 單因素實驗設計

1.2.4.1 料液比對中華鱉油提取率的影響 蛋白酶用量為2%，酶比例為1:1，酶水解時間為2 h，酶水解溫度為55 ℃，超聲功率為180 W，超聲時間為20 min，料液比為 1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3進行酶解反應，以中華鱉油提取率高低來確定料液比。

1.2.4.2 蛋白酶用量對中華鱉油提取率的影響 料液比為1:2，酶比例為1:1，酶水解時間為2 h，酶水解溫度為55 ℃，超聲功率為180 W，超聲時間為20 min，蛋白酶用量為0.8%、1.2%、1.6%、2%、2.4%、2.8%進行酶解反應，以中華鱉油提取率高低來確定蛋白酶用量。

1.2.4.3 酶比例對中華鱉油提取率的影響 料液比為1:2，蛋白酶用量為2.4%，酶水解時間為2 h，酶水解溫度為55 ℃，超聲功率為180 W，超聲時間為20 min，酶比例為 2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2進行酶解反應，以中華鱉油提取率高低來確定酶比例。

1.2.4.4 酶水解時間對中華鱉油提取率的影響 料液比為1:2，蛋白酶用量為2.4%，酶比例為1:1.5，酶水解溫度為55 ℃，超聲功率為180 W，超聲時間為20 min，酶水解時間為 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h進行酶解反應，以中華鱉油提取率高低來確定酶水解時間。

1.2.4.5 酶水解溫度對中華鱉油提取率的影響 料液比為1:2，蛋白酶用量為2.4%，酶比例為1:1.5，酶水解時間為2 h，超聲功率為180 W，超聲時間為20 min，酶水解溫度為 45、50、55、60、65、70 ℃ 進行酶解反應，以中華鱉油提取率高低來確定酶水解溫度。

1.2.4.6 超聲功率對中華鱉油提取率的影響 料液比為1:2，蛋白酶用量為2.4%，酶比例為1:1.5，酶水解時間為2 h，酶水解溫度為65 ℃，超聲時間為20 min，超聲功率為 140、180、220、240、260、300 W進行酶解反應，以中華鱉油提取率高低來確定超聲功率。

1.2.4.7 超聲時間對中華鱉油提取率的影響 料液比為1:2，蛋白酶用量為2.4%，酶比例為1:1.5，酶水解時間為2 h，酶水解溫度為65 ℃，超聲功率為220 W，超聲時間為 10、15、20、25、30 min，進行酶解反應，以中華鱉油提取率高低來確定超聲功率。

1.2.5 正交試驗設計 在單因素實驗的結果基礎上，進行正交試驗設計分析。選取料液比（A）、蛋白酶用量（B）、酶比例（C）、酶水解時間（D）、酶水解溫度（E）、超聲功率（F）、超聲時間（G）作為正交試驗因素，以中華鱉油提取率為參考指標，采用正交試驗進行工藝優化，以確定中華鱉油最佳提取工藝條件，正交實驗因素水平編碼見表1。

表1 七因素三水平正交試驗因素水平設計Table 1 Factor level design of seven factors three levels orthogonal experiment

1.2.6 中華鱉油的精制 參考[12-15]對魚油的精制方法，對中華鱉油進行脫膠、脫酸、脫色、脫腥的精制處理。中華鱉油中加入0.75%（占油重，下同）磷酸溶液（濃度為75%），水浴鍋加熱至80 ℃，加熱攪拌5 min，轉速5000 r/min離心后取上層油樣。脫膠后中華鱉油加入8%氫氧化鈉溶液（濃度為7.5%），水浴鍋加熱至75 ℃，加熱攪拌15 min，轉速5000 r/min離心后取上層油樣。脫酸后中華鱉油加入25%食品級活性白土加熱至55 ℃，加熱攪拌20 min，轉速5000 r/min離心后取上層油樣。在真空條件下，加熱至65 ℃，利用旋轉蒸發儀對脫色后中華鱉油進行45 min脫腥處理。

1.2.7 中華鱉油理化指標及脂肪酸組成測定 參照GB 5009.236-2016《動植物油脂水分及揮發物的測定》（第二法）對油脂進行測定；參照GB/T 5532-2008《動植物油脂 碘值的測定》 對碘值進行測定；參照GB/T 15688-2008《動植物油脂 不溶性雜質含量的測定》對不溶性雜質含量進行測定；參照GB/T 5009.229-2016《食品中酸價的測定》（第一法）對酸值進行測定；參照GB/T 5009.227-2016《食品中過氧化值的測定》（第一法）對過氧化值進行測定；參照GB 5009.168-2016《食品中脂肪酸的測定》（第一法）對脂肪酸進行測定。

1.3 數據處理

本研究實驗數據用軟件SPSS 22.0、Excel 2010進行實驗設計、統計分析及作圖。每組實驗均進行3次重復實驗，所有結果均以“平均值±標準差”的形式表示。用SPSS 22.0進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的選取

對于添加不同品種的蛋白酶之后，提油實驗呈現效果有不同程度的提升[16-17]。利用蛋白酶分解蛋白質與脂肪結合狀態，使油脂易游離出來。

如圖1結果所示，提油效果按顯著程度排序：中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞酸性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胃蛋白酶＞胰蛋白酶，未加蛋白酶的空白樣呈現中華鱉油提取率最低，僅為22.54%。蛋白酶品種不一，酶切位點也各不相同，針對不同樣品中油脂提取效果也有所差異[18]。較其他蛋白酶相比，中性蛋白酶與堿性蛋白酶在中華鱉油提取率為65%以上，且兩種蛋白酶提取率存在顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 不同蛋白酶對中華鱉油提取效果Fig.1 Extraction effect of different proteases on Chinese softshell turtle crude oil

參照1.2.2方法，將2%蛋白酶用量（其中中性蛋白酶與堿性蛋白酶按1:1混合），比較單一酶與復合酶對中華鱉油提取率影響，如圖2可以看出，使用復合蛋白酶的油脂提取率高于兩種單一蛋白酶，中性蛋白酶與堿性蛋白酶之間可能存在協同作用，聯合使用能提升提油效果，因此選擇中性蛋白酶和堿性蛋白酶作復合酶為后續試驗研究。

圖2 單一酶與復合酶對中華鱉油提取效果Fig.2 Extraction effect of single enzyme and compound enzyme on Chinese softshelled turtle oil

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 料液比的選擇 由圖3結果可知，料液比從1:0.5至1:2，中華鱉油提取率呈上升趨勢。當料液比為1:2時，中華鱉油提取率為71.22%。料液比從1:2至1:3，中華鱉油提取效果反而有所下降。這表明當添加蒸餾水過少時，酶分子不能與底物充分接觸，導致蛋白酶活性無法發揮，造成油脂提取不完全。而過多添加蒸餾水使酶分子擴散范圍變大，降低蛋白酶與底物接觸效率[19]，會影響中華鱉油提取率。因此綜合從效益與成本方面看，料液比定為1:2最為適宜。

圖3 料液比與中華鱉油提取率關系Fig.3 Relationship between the ratio of solid to liquid and the extraction rate of Chinese softshell turtle crude oil

2.2.2 蛋白酶用量的選擇 由圖4結果可知，隨著蛋白酶用量的增加，中華鱉油提取率呈先上升后下降的趨勢。當蛋白酶用量為0.8%時，酶分子控制底物反應，而隨著酶用量增大，酶分子之間接觸面變大互相影響，降低酶分子對底物反應效率，導致中華鱉油提取率降低。王文婷等[20]研究酶水解提取鯽魚下腳料魚油時，酶用量的增加導致提取率呈先升后降的結果，圖形基本與其實驗結果相近。因此，蛋白酶用量2.4%最為適宜。

圖4 蛋白酶用量與中華鱉油提取率關系Fig.4 Relationship between the amount of protease and the extraction rate of Chinese softshell turtle crude oil

2.2.3 酶比例的選擇 中性蛋白酶用量與堿性蛋白酶用量按不同比例混合，對中華鱉油提取率影響由圖5結果可知，當中性蛋白酶用量與堿性蛋白酶用量比例為1:1.5時，中華鱉油提取率可達75.15%。而當酶比例為1:2時，中華鱉油提取率開始下降。不同蛋白酶催化分解的基團不同，中性蛋白酶與堿性蛋白酶相比更能催化分解出中華鱉的油脂[21-22]，堿性蛋白酶的占比可能增加至一定量時，中性蛋白酶與堿性蛋白酶之間出現了競爭現象，抑制了酶的催化作用，導致中華鱉油提取率下降。

圖5 酶比例與中華鱉油提取率關系Fig.5 Relationship between enzyme ratio and the extraction rate of Chinese softshell turtle crude oil

2.2.4 酶水解時間的選擇 由圖6結果可知,隨著酶解反應時間的加長，中華鱉油提取率呈急升緩降的趨勢。這是由于酶解時間過短，僅僅部分酶分子與底物反應，提取效果不佳。在酶水解時間為2 h時，蛋白酶與底物酶解反應充分，中華鱉油提取率達峰值。隨著酶水解時間繼續延長，因為中華鱉油中富含不飽和脂肪酸被氧化，中華鱉油品質會隨之降低。因此，將酶水解時間定為2 h。

圖6 酶水解時間與中華鱉油提取率關系Fig.6 Relationship between the enzymatic hydrolysis time and the extraction rate of Chinese softshell turtle crude oil

2.2.5 酶水解溫度的選擇 由圖7結果可知，隨著酶水解溫度的穩步升高至65 ℃，中華鱉油提取率高達78.6%。這是由于溫度的升高會促使酶分子加速運動，從而激發蛋白酶活性，與底物接觸頻率增多，提高酶促反應速度。而溫度繼續升高，導致酶分子活性鈍化，待溫度達到一定限制時，可直接導致蛋白酶直接失活，酶分子將停止與底物發生反應。因此選擇酶水解溫度為65 ℃最理想。

圖7 酶水解溫度與中華鱉油提取率關系Fig.7 Relationship between the enzymatic hydrolysis temperature and the extraction rate of Chinese softshell turtle crude oil

2.2.6 超聲功率的選擇 由圖8結果可知，當超聲功率增強至220 W，中華鱉油提取率最大值達到81.18%。超聲波具有空化效應，利用超聲波輔助蛋白酶，可改變酶的構象，從而改變酶分子與底物的結合程度，催化酶分子活性[23]。超聲波對底物均質作用越明顯，伴隨振動產生的能量加快了酶分子運動，增加了酶與底物的接觸概率。在超聲功率140～220 W范圍內，鱉油提取率呈上升趨勢，超聲功率220～300 W，鱉油提取率反而下降。由于超聲功率過大，超聲波空化效應產生的微泡生成自由基，使部分酶分子被降解，說明超聲功率針對不同蛋白酶只有在一定范圍內有促進作用[24]。因此，超聲功率選擇為220 W最適宜。

圖8 超聲功率與中華鱉油提取率關系Fig.8 Relationship between ultrasonic power and the extraction rate of Chinese softshell turtle crude oil

2.2.7 超聲時間的選擇 由圖9結果可知，隨著超聲時間的延長，超聲時間25 min，中華鱉油提取率達最大值81.08%。說明隨著超聲時間延長，酶分子運動加快，酶與底物充分接觸，促進了酶解反應的進行。超聲空化作用還可以改變蛋白質的次生結構和亞基組成，從而提高蛋白質的酶解敏感性[25]。而當超聲時間延長至30 min時，中華鱉油提取率明顯降低。有研究表明超聲處理40 min內不僅不會導致酶失活，反而有一定的激活作用，即使超聲時間達100 min，酶活僅損失5%[26-27]。長時間的超聲處理使體系內熱能增加，空化效應增強，液體介質中微泡的形成，氣泡中生成的自由基可能會破壞酶分子構象，導致后續酶解過程中與底物結合的酶變少，鱉油得率降低。因此，超聲時間選擇為25 min最理想。

圖9 超聲時間與中華鱉油提取率關系Fig.9 Relationship between ultrasonic time and the extraction rate of Chinese softshell turtle crude oil

2.3 正交試驗結果

基于單因素實驗結果，選擇以料液比（A）、蛋白酶用量（B）、酶比例（C）、酶水解時間（D）、酶水解溫度（E）、超聲功率（F）、超聲時間（G）作為正交試驗因素，以中華鱉油提取率為參考指標，再利用七因素三水平正交試驗設計進行分析，正交試驗結果見表2。

由表2～表3結果所示，在使用超聲波-復合酶水解法提取中華鱉加工副產物中鱉油的過程，七個變量因素對中華鱉油提取率影響程度大小依次為：酶水解溫度＞酶比例＞蛋白酶用量＞超聲時間＞料液比＞酶水解時間＞超聲功率，其中酶比例和酶水解溫度對中華鱉油提取率影響顯著（0.01＜P＜0.05）。得到超聲波-復合酶水解法提取中華鱉油的最佳工藝條件為A1B2C2D2E2F1G3，即料液比為1:1.5、蛋白酶用量為2.4%、酶比例為1:1.5（中性蛋白酶與堿性蛋白酶用量之比）、酶水解時間2 h、酶水解溫度65 ℃、超聲功率180 W、超聲時間30 min。在最優水平條件下進行驗證試驗[28-29]，對此進行三次平行試驗，得到中華鱉油提取率為81.65%±0.62%，與正交試驗結果基本相近，進一步證明最佳工藝的可行性。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal experiment

表3 正交試驗方差分析Table 3 Orthogonal test analysis of variance

2.4 精制前后中華鱉油理化指標對比

通過超聲波-復合酶水解法所得中華鱉油部分理化指標不能滿足國家水產行業（SC/T 3502-2016）中粗魚油的一級標準，因此需對中華鱉油進行進一步處理。由于中華鱉油中含有黏液質、部分蛋白質、色素、水分等雜質，通過參照1.2.7方法進行精制處理。由表4結果可知，經過精制中華鱉油外觀澄清，微黃色，腥臭味不明顯，無酸敗味。從各項理化指標對比來看，均優于中華鱉油品質，且均符合國家水產行業標準（SC/T 3502-2016）精制魚油一級標準。

表4 中華鱉油與精制中華鱉油理化指標對比Table 4 Comparison of physical and chemical indexes between Chinese softshell turtle crude oil and refined Chinese softshell turtle oil

2.5 精制中華鱉油脂肪酸組成分析

運用氣相色譜分析精制中華鱉油的脂肪酸組成及含量，結果見表5。由表5結果可知，通過氣相色譜儀測定所得精制中華鱉油含有脂肪酸共計28種。這與其它魚油研究相比，脂肪酸組成略有差異，可能是由于實驗對象品種、季節氣候條件等差異引起的[30-31]。其中油酸、棕櫚酸、亞油酸所占比例較高，飽和脂肪酸占總量23.81 %，單不飽和脂肪酸占總量46.94 %，多不飽和脂肪酸占總量26.38 %。精制中華鱉油中含有ω-3脂肪酸占總量11.83 %，ω-6脂肪酸占總量15.51 %。ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸作為人體體內無法自身合成的“好脂肪”[32]，能有效降血壓、降血液黏稠度、軟化血管作用。有研究表明，體內ω-3脂肪酸含量高的人群，心源性猝死的發病率比ω-3低的人群低81 %[33]。此外，中華鱉油中含有DHA與EPA含量占總量10.05 %。DHA和EPA具有促進腦部發育、促進視網膜光感細胞的成熟、治療自身免疫缺陷等作用。作為功能性食品、母嬰食品的寵兒，深受嬰幼兒和中老年人青睞。

表5 精制中華鱉油脂肪酸組成Table 5 Refined oil composition of fatty acids

3 結論

基于單因素結合正交試驗進行工藝優化，得到影響超聲波-復合酶水解法中華鱉油提取率最佳工藝條件：料液比為1:1.5、蛋白酶用量為2.4 %、酶比例為1:1.5（中性蛋白酶：堿性蛋白酶用量）、酶水解時間2 h、酶水解溫度65 ℃、超聲功率180 W、超聲時間30 min，中華鱉油提取率為81.65%±0.62%。此法所得中華鱉油精制后，各項理化指標均符合國家水產行業標準（SC/T 3502-2016）精制魚油一級標準。通過氣相色譜儀測定所得精制中華鱉油含有脂肪酸共計28種。由此可見，通過超聲波-復合酶水解法可以提高中華鱉油提取效果且品質較優，后續需要進一步探究此法對不同品種鱉油提取的影響，為規?；C合利用鱉種加工副產物提供理論參考。