基于流式細(xì)胞術(shù)研究葉綠素對(duì)腸道細(xì)菌增殖的影響

鄭紅莉，王 瀟，杜夢(mèng)璇，劉 暢, ，張 燕,

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，北京 100083；2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，微生物資源前期開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

葉綠素是綠色果蔬中主要的呈色物質(zhì)，也是自然界含量最為豐富的植物次生代謝物，具有抗氧化[1]、抗炎[2]、抗腫瘤[3]等多種功能。膳食攝入葉綠素經(jīng)胃腸消化后，約有95%的葉綠素會(huì)進(jìn)入結(jié)腸，與腸道菌群相互作用[4]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素可通過介導(dǎo)腸道菌群有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖，顯著上調(diào)小鼠腸道中擬桿菌屬（Bacteroides）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和阿克曼氏菌屬（Akkermansia）的相對(duì)豐度，同時(shí)顯著下調(diào)乳球菌屬（Lactococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對(duì)豐度[5-6]。闡明葉綠素介導(dǎo)腸道菌群改善高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的機(jī)制，需要深入探討葉綠素對(duì)特定菌株的影響，但國(guó)內(nèi)外對(duì)相關(guān)領(lǐng)域的研究還非常有限。與此同時(shí)，Liu等[7]從小鼠腸道中分離得到244株腸道細(xì)菌，為研究葉綠素對(duì)特定腸道菌的影響規(guī)律提供了可使用的菌株。基于前期研究結(jié)果，本研究從上述菌株庫中篩選獲得與肥胖顯著相關(guān)的菌株進(jìn)行了體外培養(yǎng)研究。

大多數(shù)腸道細(xì)菌嚴(yán)格厭氧，對(duì)培養(yǎng)條件要求高、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)。在采用稀釋涂布平板法進(jìn)行腸道菌活菌計(jì)數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過7～15 d的培養(yǎng)后，許多腸道菌仍只能長(zhǎng)出大小不一且分散不均的微小菌落。在體外培養(yǎng)中如何實(shí)現(xiàn)腸道細(xì)菌數(shù)量的有效檢測(cè)是一大難點(diǎn)。因此，要在菌種水平上探究葉綠素對(duì)特定腸道細(xì)菌的增殖影響，闡明膳食葉綠素影響健康的機(jī)制，需要找到一種便捷、有效、可檢測(cè)體外培養(yǎng)中腸道細(xì)菌數(shù)量的方法。

流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry, FCM）是一種可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞或細(xì)菌快速檢測(cè)的簡(jiǎn)便技術(shù)，耗時(shí)短且重復(fù)性高[8]。目前，已有許多研究將其應(yīng)用于幽門螺旋桿菌等致病菌[9-10]的檢測(cè)。在食品領(lǐng)域，F(xiàn)CM已實(shí)現(xiàn)對(duì)酸奶中乳酸菌[11]、葡萄酒中釀酒酵母[12]和食醋中醋酸菌[13]等工業(yè)菌的快速檢測(cè)。目前，還未有研究利用FCM檢測(cè)難以培養(yǎng)的腸道細(xì)菌。

本研究比較了體外培養(yǎng)中珀氏解黃酮菌（Flavonifractor plautii）的FCM計(jì)數(shù)與稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)，并基于FCM研究了葉綠素對(duì)來源于小鼠腸道的珀氏解黃酮菌、普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus）、假長(zhǎng)雙岐桿菌（Bifidobacterium pseudolongum）和鼠乳桿菌（Lactobacillus murinus）增殖的影響，為闡明膳食-腸道菌群-宿主互作機(jī)制提供了有效的研究方法和理論數(shù)據(jù) 。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株 均分離于ob/ob小鼠盲腸內(nèi)容物[7]，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC），如表1所示。葉綠素（含量為 92.11%，其中葉綠素a為70.99%，葉綠素b為21.12%[14]）自制；95%乙醇 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；改良GAM肉湯 青島海博生物技術(shù)有限公司；澄清瘤胃液 北方遠(yuǎn)洋生物科技有限公司；瓊脂粉北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司； LIVE/DEAD?BacLightTM試劑盒 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株名稱Table 1 Names of the test strains

SpectraMax iD5型酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；Q23XD-2型二位三通先導(dǎo)電磁閥 浙江奉化市中源氣動(dòng)成套廠；Coylabotatory型厭氧手套箱 美國(guó)COY公司； FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀美國(guó)Becton-Dickinson醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 GAM培養(yǎng)基參照Liu等[7]的方法進(jìn)行配制。液體培養(yǎng)基配制：改良GAM肉湯60 g、L-半胱氨酸0.5 g、精氨酸0.5 g、色氨酸0.3 g、氯高鐵血紅素5 mL、澄清瘤胃液100 mL、刃天青1 mL，蒸餾水定容至 1000 mL，調(diào) pH 為 7.2±0.1（25 ℃），分裝至10 mL厭氧管，115 ℃滅菌25 min；固體培養(yǎng)基配制：改良GAM肉湯60 g、半胱氨酸0.5 g、精氨酸0.5 g、色氨酸0.3 g、氯高鐵血紅素5 mL、澄清瘤胃液100 mL、菊粉益生元0.5 g、纖維二糖0.5 g、海藻糖0.5 g、甘露糖0.5 g、半乳糖0.5 g、果糖0.5 g、鼠李糖0.5 g、異麥芽酮糖0.5 g、碳酸氫鈉2 g、無水乙酸鈉2.46 g、刃天青1 mL、瓊脂10 g，最后用蒸餾水定容至 1000 mL。調(diào) pH 為 7.2±0.1（25 ℃），115 ℃滅菌25 min。

1.2.2Flavonifractor plautii的培養(yǎng) 將葉綠素加入新鮮的GAM液體培養(yǎng)基中，使其葉綠素濃度分別為 100、300、500 μg/mL； 而 后 將Flavonifractor plautii以2%的接種量接入含有葉綠素的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期（24 h）。以不加葉綠素為對(duì)照組，葉綠素添加量為100、300、500 μg/mL的組依次定義為低濃度組、中濃度組和高濃度組。

1.2.3Flavonifractor plautii的流式細(xì)胞術(shù)（FCM）計(jì)數(shù)

1.2.3.1 樣品制備 取1 mLFlavonifractor plautii菌液，10000 g離心2 min以收集菌體細(xì)胞，將沉淀重懸于1 mL 0.85% NaCl溶液中，室溫孵育30 min，10000 g離心2 min，用0.85% NaCl溶液洗滌沉淀以除去干擾成分[15]，再次10000 g離心2 min，最后將菌體沉淀重懸于1 mL 0.85% NaCl溶液中，制得活菌懸浮液，備用；另取1 mL菌液，10000 g離心2 min以收集菌體細(xì)胞，將沉淀重懸于1 mL 70%異丙醇[16]，余下步驟與活菌懸浮液制備相同，制得死菌懸浮液，備用。樣品染色液：在分析管中依次加入0.85% NaCl溶液977 μL、3.34 mmol/L SYTO 9 1.5 μL、30 mmol/L PI 1.5 μL、細(xì)菌懸浮液 10 μL 和微球懸浮液10 μL，充分混合，室溫下避光孵育15 min[17]。調(diào)試儀器所需單色對(duì)照管：分別準(zhǔn)備2份活菌懸浮液和2份死菌懸浮液，與樣品染色液制備步驟一致，2份活/死菌懸浮液中，一份僅加入SYTO 9，另一份僅加入PI。分析管中樣品的總體積應(yīng)為1000 μL，以便準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

1.2.3.2 儀器調(diào)整與參數(shù)設(shè)置 前向角、側(cè)向角和熒光信號(hào)采集對(duì)數(shù)放大信號(hào)。不斷調(diào)整電壓參數(shù)和熒光補(bǔ)償，使細(xì)菌群體和標(biāo)準(zhǔn)微球均位于橫、縱坐標(biāo)軸的中間區(qū)域，同時(shí)使活菌和死菌所在區(qū)域能夠很好區(qū)分開[18]。參數(shù)設(shè)置：進(jìn)樣量 10 μL；進(jìn)樣速度 1.0 μL/s；events采集總數(shù)量30000個(gè)；電壓值：前向角FSC 170V、側(cè)向角SSC 340 V、綠色熒光280 V、紅色熒光280 V。

1.2.3.3 細(xì)菌總數(shù)計(jì)算 微球標(biāo)準(zhǔn)品稀釋100倍后，密度為1.0×106個(gè)/mL，即1個(gè)計(jì)數(shù)微球表示10-6mL。根據(jù)細(xì)菌區(qū)域的信號(hào)數(shù)（events in bacteria region）和微球區(qū)域的信號(hào)數(shù)（events in bead region），可得出每10-6mL的細(xì)菌總數(shù)[19]。計(jì)算公式如下：

式中：C表示細(xì)菌總數(shù)，個(gè)/mL；B表示細(xì)菌區(qū)域的信號(hào)數(shù)；D表示溶液稀釋倍數(shù)100；M表示微球區(qū)域的信號(hào)數(shù)；V表示計(jì)數(shù)微球體積10-6，mL。

1.2.4Flavonifractor plautii的稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)另取1 mLFlavonifractor plautii菌液（與上述流式細(xì)胞術(shù)所用菌液相同），用無菌的磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行梯度稀釋。選取10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋梯度，分別取100 μL稀釋液涂布于GAM固體培養(yǎng)基上[18]，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)環(huán)境的相對(duì)濕度為50%，氧氣值 ＜300 ppm。選取菌落數(shù)在30～300個(gè)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，單位為CFU/mL[20]。所有操作均在厭氧手套箱中進(jìn)行，氣體環(huán)境為85%N2、5%CO2、10%H2。

1.2.5Flavonifractor plautii的FCM活菌計(jì)數(shù)與稀釋涂布平板法活菌計(jì)數(shù)比較 將FCM測(cè)得的活菌數(shù)與稀釋涂布平板法檢測(cè)出的活菌數(shù)進(jìn)行比較，并利用皮爾遜相關(guān)性分析兩種方法測(cè)得的樣本數(shù)據(jù)之間的相關(guān)程度。

1.2.6 待測(cè)菌株的培養(yǎng)及FCM檢測(cè) 將葉綠素加入新鮮的GAM液體培養(yǎng)基中，使其葉綠素濃度分別為100、300、500 μg/mL，而后分別將Bacteroides vulgatus、Bifidobacterium pseudolongum和Lactobacillus murinus以2%的接種量接入含有葉綠素的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期。三株腸道細(xì)菌的FCM檢測(cè)與上述Flavonifractor plautii相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用T檢驗(yàn)對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，低濃度組、中濃度組和高濃度組與對(duì)照組比較，*表示差異顯著（P＜0.05）；**表示差異高度顯著（P＜0.01）；***表示差異極顯著（P＜0.001）。使用Flow Jo 10處理流式細(xì)胞圖，Origin 9.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 FCM 計(jì)數(shù)與稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)比較

以Flavonifractor plautii為例，應(yīng)用FCM檢測(cè)了體外培養(yǎng)中Flavonifractor plautii的細(xì)菌數(shù)，得到如圖1所示的流式細(xì)胞圖。分別以活菌和死菌單色對(duì)照管為對(duì)照，在FSC/SSC散點(diǎn)圖中確定細(xì)菌及計(jì)數(shù)微球分別所在區(qū)域并圈出。如圖1a中P1（左下）為細(xì)菌所在區(qū)域，P2（右上）為計(jì)數(shù)微球所在區(qū)域；接下來選中細(xì)菌所在區(qū)域，進(jìn)一步在FITC/PerCP-Cy5-5熒光圖中確定活菌和死菌分別所在區(qū)域并圈出，如圖1b中P3（下側(cè)）為活菌所在區(qū)域，P4（上側(cè)）為死菌所在區(qū)域。統(tǒng)計(jì)細(xì)菌和計(jì)數(shù)微球各自所在門中的events數(shù)分別進(jìn)行計(jì)算，得出相應(yīng)的細(xì)菌數(shù)。對(duì)照組（葉綠素濃度為 0 μg/mL）中，F(xiàn)lavonifractor plautii總菌數(shù)為 2.85×108個(gè)/mL，其中活菌數(shù)為 2.78×108個(gè)/mL，死菌數(shù)為7.39×106個(gè)/mL；低濃度組（葉綠素濃度為 100 μg/mL），F(xiàn)lavonifractor plautii總菌數(shù)為 4.01×108個(gè)/mL，其中活菌數(shù)為 3.93×108個(gè)/mL，死菌數(shù)為 8.75×106個(gè)/mL。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Flavonifractor plautii的細(xì)菌數(shù)Fig.1 Flow cytometry to detect the bacterial count of Flavonifractor plautii

SYTO 9可進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)菌內(nèi)與DNA結(jié)合，而PI只能進(jìn)入細(xì)胞膜受損或不完整的死細(xì)菌內(nèi)[11]。因此，F(xiàn)CM與SYTO 9/PI雙染色液配合使用可以區(qū)分出死菌和活菌各自所占比例，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道菌培養(yǎng)中活細(xì)菌和死細(xì)菌的同時(shí)檢測(cè)。

為更好地評(píng)估FCM對(duì)Flavonifractor plautii細(xì)菌數(shù)檢測(cè)的效果，實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用經(jīng)典的活菌計(jì)數(shù)方法—稀釋涂布平板法檢測(cè)該菌的活菌數(shù)。由圖2a可知，對(duì)照組（葉綠素濃度為0 μg/mL）活菌數(shù)為1.0×108CFU/mL，低濃度組（葉綠素濃度為 100 μg/mL）活菌數(shù)為1.4×108CFU/mL，與對(duì)照組相比顯著增加（P＜0.05）。對(duì)兩種方法測(cè)得的活菌數(shù)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，兩者相關(guān)性系數(shù)r＞0.8，具有顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.001）（圖2b）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)與稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)比較Fig.2 Counting comparison between flow cytometry and agar plate method

進(jìn)一步將FCM與稀釋涂布平板法活菌計(jì)數(shù)數(shù)值進(jìn)行比較，流式細(xì)胞術(shù)所得數(shù)值均大于稀釋涂布平板法所得數(shù)值（圖2a），這與李可欣等[21]的研究結(jié)果相似。這是因?yàn)閷?duì)于一些處于特殊生理狀態(tài)的活菌體細(xì)胞，如有活力但不可培養(yǎng)（viable but not culturable, VBNC）、生長(zhǎng)緩慢和休眠狀態(tài)的菌體細(xì)胞，利用稀釋涂布平板法無法對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)[22-24]，而FCM是基于特異性染料分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞DNA進(jìn)行染色，因此可有效檢測(cè)出該部分特殊的活菌細(xì)胞；此外，由于細(xì)菌具有聚集的特性，菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上分布不均勻，一個(gè)菌落很有可能是由一個(gè)以上的菌細(xì)胞生長(zhǎng)而來，因此稀釋涂布平板法所得活菌數(shù)通常會(huì)小于真實(shí)值[25]，而FCM可通過降低流速或菌細(xì)胞濃度來最大程度避免細(xì)菌聚集對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響[26]，因此其檢測(cè)結(jié)果更接近真實(shí)值。稀釋涂布平板法一般需要培養(yǎng)24～48 h才能進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，對(duì)于大部分難以在體外生長(zhǎng)的腸道細(xì)菌而言，甚至需要48 h以上的時(shí)間才能長(zhǎng)出菌落，而FCM在30 min內(nèi)即可完成1株菌的計(jì)數(shù)檢測(cè)，明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間與實(shí)驗(yàn)周期。綜上可知，使用FCM檢測(cè)體外培養(yǎng)中腸道菌的細(xì)菌數(shù)，可明顯縮短實(shí)驗(yàn)周期，提高檢測(cè)效率，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果更接近于真實(shí)值。因此，接下來的研究中將利用FCM探究葉綠素對(duì)不同腸道菌增殖的影響。

2.2 葉綠素對(duì)不同腸道菌增殖的影響

2.2.1 葉綠素對(duì)珀氏解黃酮菌（Flavonifractor plautii）增殖的影響 由圖3可知，隨著葉綠素濃度的升高，F(xiàn)lavonifractor plautii總菌數(shù)和活菌數(shù)均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，而死菌數(shù)極顯著增加（P＜0.001）。當(dāng)葉綠素濃度為100 μg/mL時(shí)，活菌數(shù)最多，達(dá)3.93×108個(gè)/mL；當(dāng)葉綠素濃度為300 μg/mL及以上時(shí)，活菌數(shù)逐漸減少。對(duì)照組中活菌數(shù)為2.78×108個(gè)/mL；與對(duì)照組相比，葉綠素濃度為100 μg/mL時(shí)，活菌數(shù)增加 1.15×108個(gè)/mL，葉綠素濃度為 100 和 500 μg/mL時(shí)，活菌數(shù)分別減少 1.33×108和 2.10×108個(gè)/mL，表明葉綠素對(duì)Flavonifractor plautii的增殖表現(xiàn)出 “低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”的作用規(guī)律。Flavonifractor plautii是一種革蘭氏陽性菌，可參與腸道中兒茶素的代謝[27]，具有降低機(jī)體炎癥、改善肥胖的功效[28]。Mikami等[29]研究證明，飲用綠茶可以增加腸道中Flavonifractor plautii的豐度并有助于改善結(jié)腸炎；此外，Liu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，芝麻素可促進(jìn)Flavonifractor的生長(zhǎng)，有益于腸道健康。因此，100 μg/mL的葉綠素濃度促進(jìn)Flavonifractor plautii增殖或許有助于改善肥胖和腸道疾病。目前，還未有研究報(bào)道外源性物質(zhì)對(duì)Flavonifractor plautii生長(zhǎng)的影響機(jī)制。

圖3 葉綠素對(duì)Flavonifractor plautii增殖的影響Fig.3 Effect of chlorophyll on proliferation of Flavonifractor plautii

2.2.2 葉綠素對(duì)普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus）增殖的影響 由圖4可知，隨著葉綠素濃度的升高，Bacteroides vulgatus總菌數(shù)和活菌數(shù)均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，而死菌數(shù)高度顯著減少（P＜0.01）。當(dāng)葉綠素濃度為100 μg/mL時(shí)，活菌數(shù)最多，達(dá)3.09×108個(gè)/mL；當(dāng)葉綠素濃度為300 μg/mL及以上時(shí)，活菌數(shù)逐漸減少。對(duì)照組中活菌數(shù)為1.61×108個(gè)/mL；與對(duì)照組相比，葉綠素濃度為100 μg/mL時(shí)，活菌數(shù)增加1.47×108個(gè)/mL，葉綠素濃度為100和 500 μg/mL時(shí)，活菌數(shù)分別減少 1.40×108和 1.35×108個(gè)/mL，表明葉綠素對(duì)Bacteroides vulgatus的增殖也表現(xiàn)出“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”的作用規(guī)律。相似地，Kamijo等[31]研究發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基中添加0.01%薔薇花瓣粉可促進(jìn)Bacteroides vulgatusJCM5826T的增殖，而0.05%薔薇花瓣粉則會(huì)抑制該菌的增殖（抑制率82%），當(dāng)濃度提高到0.1%時(shí)，該菌的增殖被完全抑制。由此可知，濃度是葉綠素等植物化合物對(duì)Bacteroides vulgatus作用的重要影響因素。有研究報(bào)道腸道細(xì)菌如布勞特氏菌屬（Blautia）可利用卟啉作為能源物質(zhì)或生物合成的前體物質(zhì)，從而促進(jìn)自身生長(zhǎng)[32]，而葉綠素促進(jìn)Bacteroides vulgatus增殖的機(jī)制還有待探究。目前，大多數(shù)植物化合物對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)的研究，主要針對(duì)復(fù)雜微生物群落展開。其中，植物性化合物對(duì)腸道細(xì)菌的抑制作用更為常見[33]，而關(guān)于促生長(zhǎng)機(jī)制，目前還未有確切的研究報(bào)道。

圖4 葉綠素對(duì)Bacteroides vulgatus增殖的影響Fig.4 Effect of chlorophyll on proliferation of Bacteroides vulgatus

2.2.3 葉綠素對(duì)假長(zhǎng)雙岐桿菌（Bifidobacterium pseudolongum）增殖的影響 如圖5所示，隨著葉綠素濃度的升高，Bifidobacterium pseudolongum總菌數(shù)和活菌數(shù)極顯著減少（P＜0.001），而死菌數(shù)無顯著變化。當(dāng)葉綠素濃度為0 μg/mL時(shí)，Bifidobacterium pseudolongum活菌數(shù)為2.63×108個(gè)/mL，隨著葉綠素濃度的增加，Bifidobacterium pseudolongum活菌數(shù)依次減少 7.78×107、1.63×108和 1.82×108個(gè)/mL，表明葉綠素可極顯著抑制Bifidobacterium pseudolongum的增殖（P＜0.001），且葉綠素濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴性。與其相似的是，Gwiazdowska等[34]研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷和槲皮素對(duì)Bifidobacterium adolescentisNCFB 2004和Bifidobacterium bifidumNCFB 2235的增殖也具有抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性。Li等[5]基于16S rRNA 基因擴(kuò)增子測(cè)序報(bào)道了葉綠素可下調(diào)腸道中雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的豐度，而本研究將其延伸到菌種水平，首次發(fā)現(xiàn)葉綠素對(duì)Bifidobacterium pseudolongum的增殖有抑制作用。

圖5 葉綠素對(duì)Bifidobacterium pseudolongum增殖的影響Fig.5 Effect of chlorophyll on proliferation of Bifidobacterium pseudolongum

2.2.4 葉綠素對(duì)鼠乳桿菌（Lactobacillus murinus）增殖的影響 如圖6所示，隨著葉綠素濃度的升高，Lactobacillus murinus的總菌數(shù)、活菌數(shù)和死菌數(shù)均顯著增加（P＜0.05）。當(dāng)葉綠素濃度為 0 μg/mL時(shí)，Lactobacillus murinus的總菌數(shù)和活菌數(shù)分別為2.01×107和 2.11×106個(gè)/mL；隨著葉綠素濃度的增加，Lactobacillus murinus的總菌數(shù)依次增加3.55×107、7.00×107、1.01×108個(gè)/mL，活菌數(shù)依次增加 1.75×106、6.36×105、6.98×105個(gè)/mL。說明葉綠素可以極顯著促進(jìn)Lactobacillus murinus的增殖（P＜0.001），且濃度越高，促進(jìn)作用越強(qiáng)。與此相似的是，Huang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元也可顯著促進(jìn)Lactobacillus murinus的增殖，且濃度越高促進(jìn)效果越好。據(jù)報(bào)道，Lactobacillus murinus是一種潛在的益生菌，具有抗過敏[36]、抗炎[37]、改善糖尿病[38]等功效。因此，葉綠素以濃度依賴性的方式促進(jìn)Lactobacillus murinus增殖，說明葉綠素具有益生元的潛在特性。

圖6 葉綠素對(duì)Lactobacillus murinus增殖的影響Fig.6 Effect of chlorophyll on proliferation of Lactobacillus murinus

3 結(jié)論

為了探究葉綠素對(duì)特定腸道細(xì)菌增殖的影響，以期能更好地闡明膳食葉綠素介導(dǎo)腸道菌群調(diào)控人體健康的內(nèi)在規(guī)律。本文比較了FCM和平板計(jì)數(shù)法用于體外培養(yǎng)中特定腸道細(xì)菌的計(jì)數(shù)，證明FCM可實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道細(xì)菌的高效、準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究了體外培養(yǎng)中葉綠素對(duì)小鼠腸道來源的珀氏解黃酮菌（Flavonifractor plautii）、普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus）、假長(zhǎng)雙岐桿菌（Bifidobacterium pseudolongum）和鼠乳桿菌（Lactobacillus murinus）增殖的影響。結(jié)果表明，葉綠素對(duì)Flavonifractor plautii和Bacteroides vulgatus的增殖表現(xiàn)出 “低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”的作用規(guī)律；葉綠素可極顯著抑制Bifidobacterium pseudolongum的增殖（P＜0.001），且呈現(xiàn)劑量依賴性；葉綠素可極顯著促進(jìn)Lactobacillus murinus的增殖（P＜0.001）。本研究為闡明膳食葉綠素對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)的影響規(guī)律提供了有效的研究方法和重要的理論數(shù)據(jù)。