湖南不同地區農家剁辣椒風味成分比較分析

肖 何，王蓉蓉，陳夢娟，王馨瑤，尹含靚，劉 洋，蔣立文,

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128）

剁辣椒又名剁辣子、壇子辣椒，是湖南的特色嗜好性調味品。家庭發酵剁椒基本上就是將新鮮辣椒采摘后清洗、晾干表面水分、去把去蒂后，斬拌成為一定大小片型，加入一定比例的食鹽、白酒拌勻后入陶瓷壇，厭氧發酵1年以上。可出壇即食，湖南很多家庭一般都會加工供自作自食用，也可以作佐料食用[1-2]，如剁椒魚頭、炊煙時代小炒黃牛肉等湘菜餐桌爆品，形成了較好的市場效應。剁辣椒盡管已經實現了工業化，但經過高鹽腌漬，脫鹽、調味、殺菌處理后剁辣椒風味的保真性差，所以很多餐飲企業自己采用陶瓷壇控制一定鹽度發酵成為特殊“壇香”的剁辣椒，用于配料使用。

以風味物質來評價剁辣椒品質備受學者的關注，現已有不少關于辣椒風味的報道，陸寬等[3]發現不同辣椒品種發酵后的風味能夠明顯被GC-MS技術區分，張毅等[4]對市售剁辣椒進行研究發現風味物質中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量較高，吳凱等[5]對不同鹽度腌漬辣椒的風味物質的分析發現低鹽腌漬的辣椒中，揮發性成分少，高鹽腌漬的辣椒揮發性成分較多，香氣成分高。風味是影響消費者購買行為的重要評判指標[6]，風味的影響因素很多，如辣椒原料、發酵菌種、發酵工藝等。風味物質的測定有很多種方法，如氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、紅外光譜法等[7]，頂空固相微萃取-氣質聯用技術（Headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）[8-10]是目前產品風味成分分析最常用的方法，因其具有操作方便快捷、方法靈敏度高、選擇性與重復性好等特點，能實現多組分混合物的定性、定量分析，較好的反映食品中揮發性物質的基本組成[11]，在發酵食品揮發性香氣成分測定中具有顯著的優勢。

自然發酵的剁辣椒具有濃郁的香氣且美味可口、健胃消食，因而倍受人們青睞。湖南是辣椒種植、加工的重點產區之一，其中邵陽（原為寶慶）自古以來就是辣椒種植加工基地，安化樂安和東坪也有辣椒加工的傳統，洪江、瀏陽都有辣椒基地和種植辣椒的歷史，寧鄉的特色辣椒本地有名。因此，本研究以采自湖南本地這6個不同地區的特色農家剁辣椒為研究對象，比較分析其理化指標、有機酸、揮發性成分的差異，為建立剁辣椒香氣成分數據庫提供理論基礎，為保障特色發酵辣椒風味提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

剁辣椒 湖南6個不同地區的農家古法發酵，樣品來自安化、懷化、邵陽、寧鄉、瀏陽地區，除懷化的剁辣椒加入少量的面油外，其余均不加油發酵，分別命名為：安化樂安（LA）、安化東坪（DP）、懷化洪江（HJ）、邵陽（SY）、寧鄉（NX）、瀏陽（LY）。氯化鈉、鉻酸鉀、氫氧化鈉、無水乙醇、硝酸銀、鄰苯二甲酸氫鉀、硝酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；酚酞 分析純，天津市化學試劑研究所有限公司；甲醇、磷酸 色譜純，天津市光復科技發展有限公司；二辛醇、草酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸 色譜純，上海源葉生物科技有限公司；C7～C30正構烷烴 美國Supelco公司。

7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；Waters e2695Alliance超高效液相色譜儀 美國沃特世公司；HMS-901C磁力加熱攪拌器深圳博大精科生物科技有限公司；CP114電子天平 奧豪斯儀器有限公司；KQ3200E超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；FE20K pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集和預處理 所有剁辣椒樣品均為當地農戶采用新鮮成熟辣椒制作，發酵周期均在5～6個月，每個樣品取樣5瓶，郵寄回實驗室放4 ℃冰箱密封保存。

1.2.2 總酸的測定 參照GB 12456-2021《食品中總酸的測定》[11]。

1.2.3 鹽分的測定 參照GB 5009.44-2016《食品中氯化物的測定》[12]。

1.2.4 有機酸含量的測定 參考GB 5009.157-2016《食品中有機酸的測定》[13]并稍作修改。

試樣制備：稱取1.50 g剁辣椒樣品（精確0.01 g）均勻試樣，放入50 mL塑料離心管中，向其中加入20 mL水后，在10000 r/min的轉速下均質提取2 min，隨后經4000 r/min離心5 min，取上層提取液至50 mL容量瓶中，殘留物再用20 mL水重復提取一次，合并提取液于同一容量瓶中，并用水定容至刻度，樣品經0.45 μm水相濾膜過濾，后用于注入高效液相色譜儀分析。

標準曲線制備：分別配制酒石酸質量濃度為12500 μg/mL、蘋果酸 25000 μg/mL、乳酸25000 μg/mL、檸檬酸 25000 μg/mL、丁二酸 62500 μg/mL 和草酸500 μg/mL的標品溶液，用0.1%磷酸溶液分別將其稀釋 25、50、125、250、500倍，得到不同濃度的有機酸標準溶液，經0.45 μm水系濾膜過濾注入高效液相色譜儀分析。以有機酸濃度為橫坐標，色譜峰的面積為縱坐標繪制標準曲線。

色譜條件：色譜柱：Agilent TC-C18（2）250×4.6 mm 5 μm；流動相：0.1% 磷酸溶液:甲醇=97.5:2.5（v/v）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：210 nm。

1.2.5 揮發性成分的測定 參照Xu等[14]方法并稍作修改。

萃取方法：準確稱取2.5 g剁辣椒樣品置于15 mL頂空進樣瓶中，加入3 mL飽和NaCl溶液，再加入2-辛醇（8 μL，0.16 mg/mL），用密封墊封口，渦旋振蕩30 s。隨后將其放入70 ℃加熱塊中平衡15 min，使剁辣椒揮發性組分充分揮發。然后將SPME針插入萃取瓶中推出纖維頭，保持70 ℃頂空吸附40 min，隨后迅速將萃取頭插入GC進樣口，并推出纖維頭，250 ℃解吸5 min后進行數據采集。

GC-MS 條件：色譜柱為DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm），載氣為 He（99.999%）,流速 1 mL/min；進樣模式：不分流；進樣口溫度250 ℃；升溫條件：40 ℃保持 3 min，以 5 ℃/min升至 150 ℃，以 10 ℃/min升至250 ℃保持5 min。離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍m/z33～500。

定性與定量分析：定性：用AMDIS對色譜圖進行自動解卷積，得到的峰質譜圖與NIST文庫（NIST 2011）進行比較，在相同試驗條件下測得正構烷烴標準品的保留時間，以此計算各色譜峰的保留指數，個別與文獻值比較，確定各個色譜峰對應的化合物。保留指數計算公式如下：

式中：I為保留指數；n為碳數；ti為待測揮發性成分的保留時間，min；tn為具有n個碳原子的正構烷烴的保留時間，min；tn+1為具有n+1個碳原子的正構烷烴的保留時間，min。

定量：采用內標法。以剁辣椒樣品中不含有的揮發性物質2-辛醇作為內標，按下式計算含量：

1.2.6 OAV計算方法 對每種揮發性化合物進行定量后，查詢各揮發性物質在水中的氣味閾值[15]，計算氣味活性值（odor activity value，OAV）。

式中：OAV為物質該的香氣活性值；Ci為該化合物在剁辣椒樣中的含量，μg/kg；OTi為該組分在水中的氣味閾值，μg/kg。當OAV≥1時，則認定該組分對剁辣椒香氣具有重要貢獻[16]。

1.3 數據處理

每組實驗重復3次，結果采用平均值±標準差表示，采用SPSS Statistic 26進行單因素方差分析。運用Origin 2020繪制柱狀圖。主成分分析圖采用SMICA 13.0軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 不同地區農家剁辣椒鹽分和總酸的差異性分析

食鹽是剁辣椒制作過程控制發酵程度、抑制腐敗、形成風味的重要物質。由圖1可知，不同地區剁辣椒鹽度差異顯著（P＜0.05），其中SY剁辣椒鹽度最低，僅為4.51%，NX剁辣椒鹽分最高，為12.75%。酸度直接反映了剁辣椒坯中發酵程度，是影響其滋味口感的重要指標之一。不同地區剁辣椒總酸差異顯著（P＜0.05），其中 NX 剁辣椒總酸最低，為 3.70±0.10 g/kg，SY剁辣椒總酸最高，高達12.33±0.35 g/kg。從圖1中可以看出6個不同地區剁辣椒中鹽分與總酸呈負相關關系，可能是高鹽抑制了剁辣椒發酵過程中乳酸菌生長代謝，鹽度高總酸含量低[17]。

圖1 不同地區農家剁辣椒鹽分和總酸變化Fig.1 Changes of salt and total acid in farm chopped peppers in different regions

2.2 不同地區農家剁辣椒有機酸分析

有機酸是衡量剁辣椒風味品質的重要指標，不同的有機酸有不同的酸味特征，如草酸有刺激性酸味、蘋果酸有特殊愉快的酸味、檸檬酸具有溫和的酸味、乳酸的酸味柔和且有后酸味，丁二酸有豆醬類的風味等。由表1可知，不同地區剁辣椒有機酸含量呈顯著差異（P＜0.05），其中DP剁辣椒有機酸含量最高為62.04±1.49 g/kg，LA剁辣椒有機酸含量最低，僅為34.51±1.00 g/kg。乳酸含量占比最大（34.76%），檸檬酸次之（25.60%）。原因是乳酸不僅能由糖酵解途徑產生，還可以直接由蘋果酸脫羧生成[18-19]，同時乳酸菌可通過三羧酸循環產生乳酸。SY剁辣椒乳酸含量最高為19.91±0.76 g/kg，且SY剁辣椒鹽分最低為4.51%；說明低鹽可能更有利于發酵產生乳酸；而NX剁辣椒乳酸含量也達到18.45±1.16 g/kg，但其鹽度最高12.75%，這可能與NX剁辣椒所用辣椒品種及發酵時間有關[20]。

表1 不同地區剁辣椒中有機酸的含量（g/kg）Table 1 Content of organic acids in chopped peppers in different regions (g/kg)

2.3 不同地區農家剁辣椒中揮發性香氣成分的測定

通過GC-MS法對6個不同地區農家剁辣椒樣品揮發性香氣成分進行檢測，其總離子流色譜圖見圖2，各樣品檢出風味成分見表2。

圖2 不同地區農家剁辣椒揮發性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in chopped peppers in different regions analyzed by GC-MS

由表2可知6個不同地區農家剁辣椒揮發性物質含量有明顯差異。采用GC-MS共檢測出97種揮發性物質，可分為 6大類：醇（9種）、醛（5種）、烯類（14種）、酯（46種）、烷烴（15種）、其他（8種）。6個不同地區農家剁辣椒分別檢測到數量及種類差別較大，最多 57 種（LA），最少 23 種（HJ）。其中 HJ剁辣椒總揮發性成分最高為（17.73 μg/g），其次是LA剁辣椒（16.83 μg/g）、LY 剁辣椒（16.79 μg/g）、NX 剁辣椒（12.73 μg/g）、SY 剁辣椒（10.87 μg/g）、DP 剁辣椒（3.32 μg/g）；其中酯類物質含量占比分別為56.06%、40.52%、56.52%、45.80%、61.18%、42.47%，可以看出酯類是剁辣椒中含量最高且種類最為豐富的揮發性物質[21-22]，這與歐陽晶等[23]的研究結果一致。

表2 不同地區農家剁辣椒樣品揮發性成分化學組成與含量Table 2 Chemical composition and content of volatile components in samples of chopped peppers from farmhouses in different regions

續表 2

續表 2

HJ剁辣椒揮發性成分種類最少，但酯類物質占比高達56.06%，乙酸占比高達19.40%。原因可能是HJ剁辣椒中加入少量植物油影響了揮發性物質的揮出，使得檢測到揮發性物質種類少，而油脂在酸性環境下又能水解成甘油和脂肪酸，使得酯類物質和乙酸含量高[24]。

6個不同地區農家剁辣椒共有的揮發性物質共有5種，分別為芳樟醇、苯乙醇、乙酸乙酯、水楊酸甲酯、辛酸乙酯，可以賦予剁辣椒花香及果香[25-26]。6個不同地區農家剁辣椒揮發性成分差異較大可能是因為所用辣椒品種及地理位置和當地自然發酵微生物差別等因素造成的[27]。

2.4 不同地區剁辣椒香氣活度值分析

采用OAV表征剁辣椒中各香氣化合物對主體香氣成分的貢獻，通過文獻查詢各揮發性物質的閾值，通過各個揮發性物質的濃度與感官閾值的比值計算OAV值。當OAV值≥1時，可以認為該揮發性物質對樣品的整體風味具有貢獻作用[28]。從表3可以看出6個不同地區農家剁辣椒OAV值≥1的共有28種，分別為芳樟醇、苯乙醇、異戊醇、苯乙醛、苯甲醛、月桂烯、反式-β-羅勒烯、苯乙烯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、正己酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、異己酸乙酯、水楊酸甲酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、癸酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、十一酸乙酯、十四烷、乙酸、2-正戊基呋喃、愈創木酚、4-乙基苯酚。LA、DP、HJ、SY、NX、LY剁辣椒特征風味物質（OAV≥1）數量分別為 15、7、11、7、13、13種。異己酸乙酯具有曲香、菠蘿香型的香氣[29]，在LA、HJ、NX剁辣椒中OAV＞1000，且均為最高，是LA、HJ、NX剁辣椒主要香氣成分。異戊酸乙酯具有蘋果、桑子香氣[30]，在DP剁辣椒中OAV值為最高，是構成DP剁辣椒的主要香氣成分。周曉媛等[26]在自然發酵剁辣椒中也檢測出了類似物質。2-甲基丁酸乙酯具有水果香味，在LY剁辣椒中OAV值為最高，是構成LY剁辣椒的主要香氣成分。乙酸乙酯具有清靈、微帶甜果香的酒香[31]，在SY剁辣椒中OAV值為最高，是構成SY剁辣椒的主要香氣成分。6個剁辣椒樣品共有的5種揮發性物質中有乙酸乙酯、水楊酸甲酯、辛酸乙酯3種物質在樣品中OAV值均大于1，說明乙酸乙酯、水楊酸甲酯、辛酸乙酯可能是構成發酵剁辣椒香氣的主要揮發性物質。

表3 不同地區農家剁辣椒樣品主要揮發性成分的OAV值Table 3 OAVs of main volatile components in the samples of farm chopped peppers in different regions

2.5 不同地區剁辣椒香氣成分的主成分分析

應用主成分分析對不同地區的農家剁辣椒OAV值≥1的關鍵香氣成分進行分析，主成分得分圖以散點圖為基礎，每個點代表一個樣品，點之間的距離代表樣品之間特征差異的大小，得到圖3不同農家剁辣椒的主要揮發性主成分得分圖。由圖3可以看出主成分PC1和主成分PC2的方差貢獻率分別為48.5%和28.8%，累計方差貢獻為77.3%，能夠反映剁辣椒樣本的主要特征[32]。可以看出與HJ、LA、NX剁辣椒香氣成分比較相似，原因可能是3個樣品中都含有異己酸乙酯，而異己酸乙酯的閾值比很低，僅為0.01 g/kg，使得香氣活度值（OAV）極高。DP、LY剁辣椒香氣成分較相似；SY剁辣椒香氣成分則與其它樣品差異較大，可能與在其它樣品中OAV值較高的2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、異己酸乙酯等物質都未在SY樣品中檢測中有關。

圖3 不同地區農家剁辣椒揮發性組分主成分分析得分圖Fig.3 Principal component analysis scores of volatile components of farm chopped peppers in different regions

3 結論

對湖南6個不同地區農家剁辣椒進行了基本理化指標和揮發性成分比較分析，發現不同地區農家剁辣椒鹽度、總酸和有機含量差異顯著（P＜0.05），且鹽分和總酸呈負相關。采用HS-SPME-GC-MS對6個不同地區農家剁辣椒揮發性成分進行了檢測分析，測出97種揮發性物質，可分為6大類：醇（9種）、醛（5種）、烯類（14種）、酯（46種）、烷烴（15種）、其他（8種），共有成分為5種，分別為芳樟醇、苯乙醇、乙酸乙酯、水楊酸甲酯、辛酸乙酯。結合OAV分析和主成分分析發現不同地區農家剁辣椒關鍵香氣成分存在差異，異己酸乙酯是LA、HJ、NX剁辣椒主要香氣成分，異戊酸乙酯是DP剁辣椒中主要香氣成分，2-甲基丁酸是LY剁辣椒的主要香氣成分，乙酸乙酯是SY剁辣椒主要香氣成分。HJ、LA、NX剁辣椒風味相近，DP、LY剁辣椒風味相近，SY剁辣椒則與其它樣品風味差別較大，邵陽寶慶辣椒全國有名，其余地方均有一定的地方特色，加上辣椒品種多種多樣，環境不同微生物來源也有差異，所以盡管都是傳統工藝制作，但剁辣椒香氣成分差異較大，下一步將研究這幾種發酵辣椒微生物的差異，借此分析微生物與風味的關聯性，為傳統發酵辣椒風味保真性研究奠定基礎。