半楓荷根對佐劑誘導型關節(jié)炎的改善作用及其正丁醇提取物UPLC-Q-TOF-MS分析

尹 麗，韋小敏，盧成淑，盧海嘯，王華坤,

（1.玉林師范學院，廣西玉林 537000；2.玉林師范學院地產(chǎn)藥用資源開發(fā)與生物工程技術中心，廣西玉林 537000）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種系統(tǒng)的全身性慢性疾病，可引起骨功能喪失和殘疾，主要病理特征為關節(jié)炎滑膜系統(tǒng)性炎癥引起的關節(jié)軟骨和骨侵蝕[1-3]，嚴重影響患者的生活質量。目前RA發(fā)病機制尚不明確，臨床上還缺乏針對該病的有效治療手段，西醫(yī)常選用激素類、非甾體類抗炎藥及免疫抑制類藥物控制炎癥緩解疾病，缺點是用藥時間長、無法根治且副作用大，如肝腎受損等[4]。因此，選擇一種合適的造模方法篩選生物活性物質應用到保健營養(yǎng)食品、醫(yī)藥及生物化學領域科學研究中，開發(fā)能夠預防和改善RA的藥物及功能性食品對減輕患者痛苦并提高生活質量具有廣闊的應用前景[5]。

半楓荷（Semiliquidambar cathayensis）為金縷梅科半楓荷屬植物，全株及花蜜均可入藥，是海南、兩廣、貴州等當?shù)厣贁?shù)民族群眾常用的治風濕跌打珍貴藥材[6]，因治療風濕有奇效，在中醫(yī)界有“風濕之王”的美譽。半楓荷始載于《嶺南采藥錄》，民間多用其治療風濕性關節(jié)炎和類風濕性關節(jié)炎、跌打損傷和軟組織損傷、慢性腰腿痛等疾病[7]。日常泡茶、泡酒、煲湯食用，目前已被開發(fā)成半楓荷酒、半楓荷蜂蜜等多種保健型食品用于祛風除濕及舒經(jīng)活血[8]。目前對半楓荷的研究剛剛起步，主要集中在同名同效不同種植物的考證[9]、辨別半楓荷特征的生藥學研究[10]、半楓荷不同部位化學成分研究[11-13]、半楓荷祛風除濕和舒筋活血功效研究[14-15]等方面。現(xiàn)有文獻初步探究了半楓荷的活血止痛功能，如半楓荷水提取物對大鼠血瘀模型有活血化瘀作用[7,8,16]；熱板法、毛細血管通透法及大鼠足趾腫脹法等研究發(fā)現(xiàn)半荷根醇提物有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用，半楓荷乙酸乙酯部位為活性提取物[14-15]，但活性成分和治療機制不明。課題組前期通過圖譜指認以及文獻調研，明確半楓荷抗炎鎮(zhèn)痛活性物質含量較高的部位為半楓荷根[14-15,17]。本研究利用與人RA發(fā)生機制相似的佐劑誘導型（adjuvant arthritis，AA）大鼠關節(jié)炎模型[18]，給予半楓荷根乙醇提取物（ethanol extract ofSemiliquidambar cathayensisroot，SCE）干預，與甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）組及模型組比較，探討半楓荷根對RA大鼠關節(jié)軟骨的保護作用、炎癥相關因子及血清細胞因子分泌的影響，并借助超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術分析得到半楓荷根正丁醇提取物的化學成分，以期篩選出更多可以預防和改善RA的有效物質，為開發(fā)相應的藥品、膳食補充劑或功能性食品提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級健康SD雄性大鼠 50只，8～10周齡，體重200～220 g，廣西醫(yī)科大學動物實驗中心（許可證號：SCXK桂2020-0003），動物飼養(yǎng)在層流SPF級無菌環(huán)境下單個分籠飼養(yǎng)，濕度40%±10%，溫度（23±1）℃，采用12 h光照循環(huán)，每日光照時間為早上8:00至晚上20:00，期間大鼠均能自由飲食、飲水，實驗遵循3R原則，所有動物實驗均符合廣西醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會標準（201908006）；半楓荷根藥材 由玉林師范學院盧海嘯教授采集并鑒定為金縷梅科半楓荷屬植物半楓荷的干燥根；甲氨蝶呤對照品 上海源葉生物技術有限公司（CAS號59-05-2）；弗氏完全佐劑（CAS 號 9007-81-2）、蘇木色精（CAS 號 517-28-2、伊紅（CAS 號 15086-94-9） Sigma公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（貨號 ml002859）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（貨號 ml037361）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒（貨號 ml064292）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）試劑盒（貨號 ml00 2813）、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）試劑盒（貨號 ml058808）、5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）試劑盒（貨號ml058145）試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；切片石蠟（39601006） 德國Leica公司。

PV-200型足趾容積測量儀 成都泰盟軟件有限公司；1510型全波長酶標儀美國Thermo Fisher公司；EG1150H型石蠟包埋機、HI1210型攤片機、RM2255型輪轉式切片機、HI1220型烘片機 德國Leica公司；BX43型顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Allegra 64R型高速冷凍離心機 美國 Beckman Coulter公司；Laborota4000型旋轉蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；Nexera UHPLC LC-30A型超高效液相色譜儀 日本島津儀器有限公司；TripleTOF 5600+型飛行時間質譜儀 美國AB SCIEX公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及建模 參照本課題組前期實驗方法[17]，制備半楓荷根乙醇提取物：半楓荷根干燥粉碎后，取粗粉7 kg用10倍量75%乙醇回流提3次，每次2 h。合并提取液減壓濃縮至無醇味得干燥總提物，出膏率為8.2%。大鼠飼養(yǎng)一周后，把50只雄性大鼠隨機分為 5 組，每組 10 只：對照組（control）、模型組（model）、陽性藥物組（甲氨蝶呤，MTX，3 mg/kg）、半楓荷根乙醇提取物低劑量組（SCEL，生藥量0.125 g/kg，0.5倍中藥大辭典推薦使用量）、半楓荷根乙醇提取物高劑量組（SCEH，生藥量0.5 g/kg，2倍中藥大辭典推薦使用量）。根據(jù)半楓荷根乙醇提取物得率8.2%配制成0.4和1.6 g/kg兩個濃度的溶液進行初步藥效學試驗。大鼠足趾常規(guī)消毒，對照組大鼠左后足趾內(nèi)注射等量生理鹽水，其余大鼠左后足趾皮下注射弗氏完全佐劑0.1 mL致炎，次日開始按各組劑量灌胃給藥。參照文獻[19]方法，MTX組每周灌胃2次，每次間隔3.5 d，半楓荷根醇提取物高、低劑量組每天固定時段灌胃一次，對照組及模型組灌胃等體積生理鹽水每日一次，持續(xù)給藥28 d。造模結束后，剔除造模不成功大鼠，其他納入實驗大鼠：對照組10只（無死亡）、模型組10只（無死亡）、MTX組9只（造模不成功1只）、SCEL組和SCEH組各9只（造模過程中各死亡1只）。

1.2.2 足腫脹容積的測定 造模前及致炎后，用足趾腫脹測量儀測定大鼠致炎前左后足初始容積，每組動物的足跖體積每3 d測量1次，每鼠測3次取平均值，得出各治療組關節(jié)足跖體積折線圖。

1.2.3 關節(jié)炎指數(shù)測定 大鼠免疫后每3 d進行關節(jié)炎評分，得出各治療組關節(jié)級別分數(shù)的折線圖。通用關節(jié)炎評分標準為根據(jù)免疫后足趾部位紅斑程度、范圍及關節(jié)腫大變形情況，累計得出關節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）[20]。0 分：正常、無腫脹；1 分：關節(jié)輕微紅腫；2分：后足踝關節(jié)及跗骨出現(xiàn)紅斑和腫脹；3分：踝關節(jié)至跖骨處或掌關節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹；4分：踝關節(jié)至跖骨處嚴重腫脹、紅斑或僵硬，不能負重。大鼠所有關節(jié)炎指數(shù)之和即為每只大鼠關節(jié)炎指數(shù)。

1.2.4 免疫器官指數(shù)測定 28 d實驗結束前進行稱重，水合氯醛腹腔麻醉后斷頭處死大鼠，取出脾臟和胸腺并稱重，計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，胸腺指數(shù)/脾臟指數(shù)=胸腺（脾臟）/體重。

1.2.5 炎癥因子和細胞因子測定 實驗28 d腹主動脈取血，用histopaque 1083單核細胞離液獲取外周血單核細胞（peripheral blood monocytes，PBMC），ELISA試劑盒測定COX-2和5-LOX含量。大鼠腹主動脈取血，收集全血，靜置2 h后離心分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩LISA試劑盒說檢測各組血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-10含量。

1.2.6 大鼠踝關節(jié)組織病理切片觀察 實驗28 d處死大鼠后，迅速剪去左足踝關節(jié)固定于4%多聚甲醛溶液。10% EDTA溶液脫鈣，石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，顯微鏡觀察各組的關節(jié)處病理變化并拍照分析。

1.2.7 半楓荷根活性提取物篩選 半楓荷根乙醇提取物500 g經(jīng)水研磨混懸后，參照課題組前期實驗結果[16]選用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇按照1:1的體積比依次對濃縮液進行萃取，得到石油醚提取物浸膏20.6 g（得率4.12%）、二氯甲烷提取物浸膏32.6 g（得率6.52%）、乙酸乙酯提取物浸膏35.5 g（得率7.1%）、正丁醇提取物浸膏51.95 g（得率10.39%）。參照文獻[19]方法，考慮各部位在乙醇提取物中含量結合預實驗實際結果設計給藥濃度，按1.2.1造模方法，取110只雄性SD大鼠隨機分為11組：對照組、模型組、甲氨蝶呤組（MTX，3 mg/kg）、石油醚提取物高劑量組（PE-H，25 mg/kg）、石油醚提取物低劑量組（PE-L，12.5 mg/kg）、二氯甲烷提取物高劑量組（CH2Cl2-H，80 mg/kg）、二氯甲烷提取物低劑量組（CH2Cl2-L，40 mg/kg）、乙酸乙酯提取物高劑量組（EtOAc-H，25 mg/kg）、乙酸乙酯提取物低劑量組（EtOAc-L，12.5 mg/kg）、正丁醇提取物高劑量組（BuOH-H，80 mg/kg）、正丁醇提取物低劑量組（BuOH-L，40 mg/kg），對大鼠進行足腫脹容積測量及關節(jié)炎指數(shù)評分評判治療效果。

1.2.8 半楓荷根活性提取物的液質聯(lián)用定性分析對半楓荷根活性提取物進行超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿-飛行時間質譜法（UPLC-Q-TOF-MS）分析，結合 MassBank，Respect，GNPS（共 14951 個 records）等在線網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫及相關文獻對有效洗脫部位進行成分鑒定，并對其中的抗RA活性成分進行二級質譜確認。液質聯(lián)用色譜條件：SHIMADZU InerSustain C18（2.1 mm×100 mm，2 μm），流動相為 A：乙腈，B：0.1%甲酸-水，進樣量10 μL，柱溫35 ℃，波長254 nm。梯度洗脫程序：0～3 min，95% B；3～15 min，95%～80% B；15～40 min，80%～0 B； 40～45 min，0 B； 45～46 min，0～95% B；46～48 min，95% B。

分別采用電噴霧電離（ESI）正離子和負離子模式進行檢測，質譜參數(shù)為霧化氣（GS1）：50 psi，輔助加熱氣（GS2）：50 psi，氣簾氣（CUR）：25 psi，溫度（TEM）：500 ℃（正離子）和 450 ℃（負離子），毛細管電壓（IS）：±5500 V（正離子）和±4400 V（負離子）；TOF MS掃描范圍 m/z：100～1200，產(chǎn)物離子掃描范圍m/z：50～1000，TOF MS 掃描累積時間：0.20 s/spectra，產(chǎn)物離子掃描累積時間：0.01 s/spectra；二級質譜采用信息依賴型獲取模式（IDA）獲得，并且采用超高靈敏度模式，去簇電壓（DP）：±60 V（正負兩種模式），CES碰撞能力疊加為：35±15 eV。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 SCE對大鼠關節(jié)外觀的影響及AI評分

對照組、模型組照片可以直觀地反映各組的關節(jié)狀態(tài)（圖1）。AA免疫大鼠左后足24 h后模型組跖骨和足骨出現(xiàn)多處紅斑，腫脹明顯，關節(jié)發(fā)生僵直，大鼠行走受限，符合RA的體外特征。根據(jù)AI判定標準：大鼠每只爪單獨評分最高4分，總分是四只爪關節(jié)炎癥之和，最高16分。實驗組大鼠關節(jié)炎指數(shù)AI＞4分，認定為關節(jié)炎誘導成功，AI＜4分判定無關節(jié)炎癥。關節(jié)炎指數(shù)結果（圖2）顯示，佐劑免疫15 d左右炎癥癥狀達到一個高峰期，隨著時間的變化，炎癥癥狀稍微有所減輕。前10 d，SCE組（AI為5.23±1.21）及 MTX 組（AI為 5.62±1.09）與模型組（AI為5.89±1.67）相比關節(jié)炎指數(shù)沒有顯著差異，從12 d后SCE組大鼠（AI為4.23±1.82）與模型組大鼠（AI為7.64±1.17）相比顯著降低關節(jié)炎指數(shù)（P＜0.05）。即給藥12 d后，SCE開始發(fā)揮抗炎作用，MTX組和SCE組特別是高劑量組的大鼠足跖腫脹程度明顯降低。高劑量治療組（AI為3.82±1.52）治療效果在即將結束的第21～28 d具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 大鼠AA免疫前后關節(jié)變化Fig.1 Normal and AA-immunized rats joint changes

圖2 關節(jié)計分圖Fig.2 Joint scores

2.2 SCE對AA 大鼠足趾腫脹度的影響

在足跖腫脹程度的折線圖中（圖3），由Graphpad Prism 5.0計算結果可知，5組關節(jié)腫脹體積與X軸的曲線下面積（AUC）分別是對照組為33.75，模型組為 64.20，MTX組為 45.00，SCEL組為 52.83，SCEH組為49.77。經(jīng)過28 d給藥觀察，可以看出SCE能夠顯著（P＜0.05）降低發(fā)炎關節(jié)的腫脹程度，特別是高劑量組擁有與陽性藥相媲美的治療效果，其對關節(jié)腫脹具有明顯的緩解作用。足趾腫脹和關節(jié)炎指數(shù)是直觀評價抗RA作用的兩個指標，Wang等[21]的研究顯示AA引起的關節(jié)炎會導致大鼠爪子腫脹減輕、降低關節(jié)炎評分，本研究結果與文獻結果類似。

圖3 足趾腫脹度折線圖Fig.3 Line graph of paw volume

2.3 SCE對 AA 大鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是兩個重要的機體免疫器官，通過多種機制發(fā)揮免疫功能，其重量與體重的比例能夠反映出機體的整體免疫功能狀態(tài)[22]。實驗結果（表1）顯示，模型組的胸腺（2.73±0.11）和脾臟指數(shù)（2.04±0.17）與對照組（胸腺 2.07±0.06、脾臟 1.19±0.11）相比顯著增高（P＜0.05），可能與AA大鼠免疫功能紊亂和炎癥反應有關[23]。SCE能降低AA大鼠胸腺指數(shù)（2.25±0.06），對脾臟指數(shù)也有降低趨勢（1.55±0.18），但無顯著性差異（P＞0.05），表明了SCE對AA大鼠具有一定的免疫抑制作用。

表1 SCE對AA大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響 ±S，mg/g）Table 1 Effects of SCE on the thymus index and spleen index in AA rats (±S, mg/g)

表1 SCE對AA大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響 ±S，mg/g）Table 1 Effects of SCE on the thymus index and spleen index in AA rats (±S, mg/g)

注：與對照組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只） 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)對照組 10 2.07±0.06 1.19±0.11模型組 10 2.73±0.11# 2.04±0.17#甲氨蝶呤組 10 2.19±0.11* 1.37±0.12*提取物（低） 10 2.48±0.12 1.78±0.11提取物（高） 10 2.25±0.06* 1.55±0.18

2.4 SCE對AA大鼠PMBC中COX-2和 5-LOX表達影響及血清中細胞因子影響

COX-2和5-LOX 是花生四烯酸代謝途徑中的兩個關鍵酶，參與組織炎癥，在關節(jié)組織中COX-2過表達是關節(jié)炎疾病的共同特征[24]，而阻斷5-LOX可減輕小鼠痛風性關節(jié)炎模型中關節(jié)的功能性損傷。COX-2和5-LOX在正常情況下低表達，而當發(fā)生炎癥時高表達[25]。如圖4所示，對照組PBMC中 5-LOX（0.50±0.04）和 COX-2 水平（0.49±0.10）顯著低于 AA 模型組（5-LOX 0.92±0.06，COX-2 0.91±0.07），表明對照組的炎癥水平低于AA模型組（P＜0.05）。給予 SCEH處理后，5-LOX（0.58±0.03）和COX-2（0.61±0.02）水平都顯著低于模型組（P＜0.01）。

圖4 SCE對AA大鼠 PMBC中COX-2和5-LOX含量的影響Fig.4 Effects of SCE on COX-2 and 5-LOX level in rats PBMC

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)RA是由自身免疫細胞和免疫因子造成的免疫損害，主要特征是自身免疫功能紊亂。在RA患者及動物模型血清中，TNF-α、IL-1β和IL-6水平高于正常組，在病灶部位呈現(xiàn)高表達[26]，TNF-α等是RA病理過程中的重要檢測指標[27]。IL-10又稱細胞因子合成抑制因子[28]，與TNF-α等作用相反，RA患者血清和滑液中IL-10水平高于正常人，IL-10外源性補充能降低炎癥反應強度，在關節(jié)修復和軟骨保護中起著至關重要的角色[29]。給藥28 d后，用ELISA試劑盒測定各組大鼠血清中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的含量，各組細胞因子OD值如圖5所示，可知對照組中促炎細胞因子TNF-α（42.14±0.03）、IL-6（38.29±0.11）和IL-1β（68.16±0.02）的含量低于 AA模型組（P＜0.01），對照組中 IL-10（99.32±0.07）的含量高于模型組（P＜0.01），說明模型組動物處于很嚴重的炎癥狀態(tài)。給予SCE和MTX處理后，SCEH組和MTX組可顯著降低AA大鼠中TNF-α（SCEH 組 56.23±0.02，MTX 組 50.55±0.08）、IL-6（SCEH 組 51.22±0.08，MTX 組 49.24±0.02）和IL-1β（SCEH 組 96.49±0.06，MTX 組 90.21±0.09）的含量（P＜0.05），同時顯著升高AA大鼠血清中IL-10（SCEH 組 123.51±0.04，MTX 組 130.11±0.12）含量（P＜0.001）。

上述結果顯示SCE特別是高劑量組能夠顯著降低 RA大鼠體內(nèi) COX-2和 5-LOX水平及 TNF-α、IL-6和IL-1β含量，SCE表現(xiàn)出較好的體內(nèi)抗炎活性，存在抑制RA疾病進展的內(nèi)在潛力。半楓荷根對AA大鼠免疫抑制作用具體表現(xiàn)在對細胞因子表達的影響，其作用機制不明確。推測其被大鼠體內(nèi)吸收后藥效成分與相關靶點結合，調控相應免疫通路從而使機體異常的免疫應答趨于平衡，出現(xiàn)下調或上調相關細胞因子的現(xiàn)象[30]。

2.5 建模關節(jié)照片及HE染色結果

滑膜增生，血管翳形成，關節(jié)軟骨和骨質破壞是RA的主要病理特征，本實驗著重考察半楓荷根是否能夠抑制RA的關節(jié)侵蝕與破壞。踝關節(jié)的染色切片結果如圖6所示，模型組有大量炎癥細胞浸潤到關節(jié)腔且關節(jié)處，滑膜及軟骨都有很大程度的破壞，而SCE組特別是高劑量組滑膜較正常，僅有少量炎性細胞浸潤，關節(jié)腔間隙較小，展現(xiàn)出幾乎完整的關節(jié)滑膜。可見，SCE（尤其在1.6 g /kg的劑量下）具有一定的抑制關節(jié)處炎性細胞侵蝕及破壞作用，其原理可能是通過降低細胞因子TNF-α和IL-6的含量來減輕關節(jié)處炎癥繼而降低炎癥對關節(jié)的侵蝕和損壞。

圖6 AA大鼠踝關節(jié)HE染色觀察（100×）Fig.6 The HE staining in ankle of AA rats （100×）

2.6 半楓荷根活性提取物的篩選

給藥10 d后，乙酸乙酯、二氯甲烷和正丁醇提取物抑制AA大鼠關節(jié)炎指數(shù)（圖7），石油醚提取物對AA大鼠關節(jié)炎指數(shù)無顯著性影響。在足跖腫脹程度的折線圖中（圖8），關節(jié)腫脹體積與X軸的曲線下面積（AUC）分別是對照組為 34.62，模型組為64.56，MTX 組為45.92，EtOAc-H 組為59.39，EtOAc-L組為 60.08，CH2Cl2-H組為 58.40，CH2Cl2-L組為60.11，BuOH-H 組為 52.74，BuOH-L 組為 54.29，其中半楓荷根正丁醇提取物高劑量組對RA大鼠關節(jié)炎腫脹和關節(jié)炎指數(shù)抑制作用效果最為顯著（P＜0.05），為半楓荷根活性提取物。

2.7 半楓荷根正丁醇提取物總離子流圖及化合物鑒定

采用UHPLC-Q-TOF-MS檢測半楓荷根正丁醇提取物，化合物在正、負離子模式下得到較好分離（圖9），整個實驗過程中儀器誤差引起的變異較小。基于文獻檢索以及相關數(shù)據(jù)庫，參照色譜保留時間、精確分子量、準分子離子和相關文獻，對半楓荷根正丁醇提取物的主要色譜峰化學結構進行了推斷和鑒定，最終確定104個化合物（表2），還需進一步確證。半楓荷根正丁醇提取物化學組成包括有機酸類26種，糖和糖苷類化合物12種，醛酮類化合物7種，醇和酚類化合物7種，氨基酸類化合物2種，醌類及香豆素化合物5種，其他類成分26種。盧海嘯等[17]用硅膠和Sephadex LH-20柱色譜分離鑒定半楓荷根化學成分，得到11個化合物多為有機酸類。本研究結果與其基本一致，但由于半楓荷采集時間、提取部位、提取溶劑有所差異，具體化學成分之間存在一定差異。本課題組初步實驗證明半楓荷根正丁醇提取物的黃酮類化合物如蘆薈大黃素、表沒食子兒茶素、紫杉醇及環(huán)烯醚萜類化合物梔子苷能夠不同程度地抑制 LPS誘導的 RAW264.7細胞釋放 NO、TNF-α、IL-1β，表現(xiàn)出抗炎作用。半楓荷根正丁醇提取物中含量較高且抗炎作用顯著的物質為白藜蘆醇（圖10），田曉明等[13]通過UPLC/Q-TOF-MS技術分析出白藜蘆醇、瓜氨酸、膽酸、7-羰基豆甾醇四種化學成分在半楓荷根皮中含量較高，本研究結果與其一致。文獻報道白藜蘆醇在RA治療中發(fā)揮重要作用，通過誘導促凋亡基因caspase-3表達，顯著抑制RA滑膜細胞增殖、促使其凋亡[21]。本實驗采用液質聯(lián)用技術對半楓荷根正丁醇提取物的化學成分進行分析，比對質譜數(shù)據(jù)并結合相關文獻，鑒定出單體化合物結構，為半楓荷根抗RA的藥效物質基礎研究提供依據(jù)。

圖10 白藜蘆醇的二級質譜圖Fig.10 MS/MS spectrum of resveratrol

表2 半楓荷根正丁醇提取物化合物鑒定結果（部分）Table 2 Identified information of the compounds in n-butanol part of SCE (partial results)

圖9 正、負離子模式血漿樣本總離子流圖Fig.9 LC-MS total ion chromatography (TIC) of plasma metabolites in ES+ mode (A) and ES- mode (B)

續(xù)表 2

3 結論

本實驗選用廣西地產(chǎn)半楓荷根炮制得到醇提物作用于AA模型大鼠，發(fā)現(xiàn)其能顯著降低大鼠關節(jié)炎指數(shù)、足跖腫脹度和胸腺指數(shù)，降低大鼠體內(nèi)COX-2、5-LOX 及 TNF-α、IL-6、IL-1β水平，抑制大鼠踝關節(jié)處炎性細胞侵蝕及破壞，表現(xiàn)出較好的抗炎活性。半楓荷根正丁醇部位為抗炎活性提取物，高分辨質譜法和高效液相色譜法結合對正丁醇提取物的潛在活性成分進行定性分析，得到有機酸類、糖和糖苷類、醛酮類等多種活性化合物，具備較高的營養(yǎng)價值和潛在的藥用特性，其中白藜蘆醇等化合物含量較高，與已有研究結果一致，為有效成分及藥效機制研究提供基礎。本研究首次對半楓荷抗RA的主要活性成分和藥理活性進行闡述，不足之處是對藥效物質基礎和機制研究缺乏深入探討。下一步擬通過HPLC法深入定量分析各化學成分含量，采用細胞炎癥模型明確各化合物抗炎活性，結合主成分分析法篩選主要成分，從細胞水平探究半楓荷根主成分抗RA的具體作用機制，為開發(fā)半楓荷成抗RA新藥和功能性食品提供數(shù)據(jù)支撐和研究策略。