乳源外泌體的研究進展

李 瑩，陳璟瑤，趙軍英,，余曉雯，楊軼涵，胡聚峰，姜鐵民，陳歷俊,,

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.北京三元食品股份有限公司，國家母嬰乳品健康工程技術研究中心，北京 100163；3.桂林理工大學，國家母嬰乳品健康工程技術研究中心南亞分中心，廣西桂林 541006）

外泌體是細胞處于生理（或病理）狀態下主動分泌產生直徑在 30～200 nm，密度為 1.13～1.19 g/mL的具有雙層膜結構的圓形或是橢圓形囊泡[1-4]。1983年，研究發現網織紅細胞在血液中分化為成熟的紅細胞，且網織紅細胞中轉鐵蛋白受體通過直徑約為50 nm的小囊泡釋放到細胞外基質中[5-6]。1987年，加拿大學者Rose Johnstone創造“Exosome”一詞[7]并認為外泌體只是細胞將自身不需要的“廢物”排向外界環境的載體。2007年，Valadi等提出外泌體包含mRNA和mi RNA并可以將其傳遞給另一個細胞[8]，至此外泌體的功能及其機制開始得到廣泛研究。

外泌體存在于各種體液環境中，如血清、尿液、唾液、乳汁、羊水等[9-11]。生物體液中的外泌體表明其起源細胞的功能狀態，在醫學上可作為肝癌[12]、前列腺癌[13]等疾病的生物診斷標記物；由于外泌體的膜結構還可以作為藥物載體表現出高效藥物傳遞的特性，例如外泌體負載不穩定的姜黃素可提高治療效果[14]。

研究證明外泌體可作為一種新型功能性囊泡，可以通過飲食經胃腸道消化吸收將功能成分傳遞給機體[15-16]。動物乳作為新生兒唯一食物，乳中的外泌體對新生兒生長發育具有促進作用。乳源外泌體的組成及生物學功能是目前乳品科學領域的研究熱點。本文對乳源外泌體的生物學功能、分離鑒定方法以及多組學研究進行匯總，旨在為母乳成分研究及模擬母乳功能性產品開發提供理論基礎。

1 外泌體功能性研究進展

1.1 外泌體形成機制

外泌體作為一種囊泡，其源于細胞膜內吞作用形成的內涵體（Endosome），內涵體在分揀蛋白的作用下生成多囊泡體，或者在神經酰胺的協助下生成多囊泡體。生成的多囊泡體一部分被溶酶體降解，一部分通過與細胞膜融合向細胞外釋放納米級的膜小體，即外泌體[17]。外泌體的產生過程可歸結為“內吞-融合-外排”，其形成機制見圖1。

圖1 外泌體形成機制[18]Fig.1 Formation mechanism of exosomes[18]

乳源外泌體是由乳腺上皮細胞分泌的小囊泡，其主要組成成分是蛋白質、脂質以及核酸。乳源外泌體膜表面具有特異性膜蛋白，如最豐富的四跨膜蛋白（CD9、CD82、CD81和 CD63），以及共刺激分子（CD54）和粘附分子（CD11b）[19-22]。脂類（磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂和磷脂酰肌醇）也常見于外泌體中[23]。乳源外泌體中核酸主要包括非編碼單鏈RNA分子（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、環狀RNA（circular RNA，circRNA）、mRNA 和tRNA等[24]。

1.2 乳源外泌體生物學功能

外泌體在生理過程中發揮著重要功能，如介導細胞交流、促進細胞生長以及參與免疫反應等。

1.2.1 介導細胞交流 外泌體在許多生物過程中作為信號分子，起介導細胞交流作用，外泌體是細胞內多泡體與細胞膜融合后釋放到胞外基質中的一種膜性囊泡，因此在乳源外泌體的形成過程中，作為信號分子會攜帶一些生物活性成分，在乳源外泌體與受體細胞膜融合后，這些活性成分會轉移到受體細胞中。其機理是通過粘著受體或配體、細胞因子、遺傳信息等來實現與受體細胞間的物質和功能的交換或改變。

由于外泌體具有膜結構，可以保護其中的蛋白質、脂質以及miRNA不被酶類水解，并通過內吞作用使其穩定地進行運輸[25]，從而實現外泌體介導細胞交流。母乳外泌體中含有多種miRNA，且可以被巨噬細胞吸收，繼而穩定進入嬰兒腸道，作為信號分子傳遞給其他細胞，參與調節嬰兒體內多個生理過程[26]。牦牛乳外泌體中的bta-miR-31和bta-miR-34a作為信號分子，通過缺氧信號通路及細胞凋亡信號通路，調節由缺氧引起的小腸上皮細胞損傷[27]。

1.2.2 促進細胞生長 乳中激素和促生長肽（如胰島素、表皮生長因子、胰島素樣生長因子Ⅰ等）可促進新生兒胃腸道細胞的生長發育[28]。Chen等[29]發現豬乳外泌體不僅可被小腸上皮細胞吸收，同時促進小腸上皮細胞中腸特異轉錄因子、胰島素樣生長因子Ⅰ和增殖細胞核抗原的表達，進而促進腸道細胞增殖和發育。另外，豬乳外泌體可以抑制脫氧雪腐鐮刀菌素（Deoxynivalenol，DON）[30]，保護腸道免受 DON損傷，預防由DON引起的壞死性小腸結腸炎。同樣，Hock等[31]發現大鼠乳外泌體可促進大鼠小腸上皮細胞的活力，提高小腸絨毛高度、降低腸隱窩深度；發現初乳更有效促進小腸上皮細胞的發育以及更好地保護小腸上皮細胞免受炎癥的影響[32]。因此，可以考慮將乳外泌體作為具有促進及保護新生兒胃腸道發育的營養成分添加入嬰兒配方乳粉中。

1.2.3 參與免疫反應 人乳外泌體中含有豐富的與免疫相關的蛋白質和mi RNA。例如人乳外泌體中的蛋白，CD86、CD63、CD81以及主要組織相容性復合體（MHC classⅡ）可增加調節性T細胞的數量，使其參與體內循環發揮細胞免疫及免疫調節等功能[33]。人乳外泌體中miRNA同樣可促進調節性T細胞的成熟，使其發揮細胞免疫調節功能[34]。Zhou等[35]對人乳外泌體miRNA進行檢測，發現有59個與免疫相關的前體mi RNA；Kosaka等[36]進一步在人乳外泌體中發現與人體免疫相關的是miR-181a和miR-17。在豬乳外泌體中發現13種miRNA與免疫相關[37]，并且這13種免疫相關miRNA在不同泌乳階段表達量不同，有12種mi RNA在初乳中的表達量都高于常乳，該研究從外泌體生物學功能的角度解釋了初乳的寶貴性。

2 乳源外泌體分離純化與鑒定

2.1 外泌體分離純化

根據外泌體的生物學性質，可以采用不同技術分離純化外泌體。目前常用的外泌體分離技術是：離心法、化學沉淀技術、免疫親和法、尺寸排阻法和微流控技術。

2.1.1 離心法 目前，超速離心法與密度梯度離心法是分離乳源外泌體最常用的方法。經兩種方法分離后，得到的外泌體比較純凈，對乳中酪蛋白等物質去除較徹底，適用質譜分析。

超速離心法是基于乳液中各物質離心力的差異，通過10000×g的離心力多次離心去除細胞及細胞碎片、脂肪、酪蛋白等，再用100000g～150000×g的離心力對乳清進行兩次及以上的離心分離，分離出淡黃色的外泌體顆粒[38]。高海娜[27]對超速離心法分離牦牛乳外泌體進行改良，在去除乳中的脂肪及細胞碎片后，在脫脂乳上清液中添加0.025 g/L的凝乳酶以便除去乳液中的酪蛋白，最后在12000×g條件下離心90 min，離心管底部淡黃色沉淀即為外泌體。這種使用凝乳酶改良的超速離心法，降低了離心力并且減少了離心的次數。

密度梯度離心法原理是，在超速離心基礎上向裝有乳清的離心管中加入不同梯度的介質，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度，隨后進行超速離心[39]。乳清中的成分會根據自身沉降系數在不同的密度梯度區域上形成沉淀。密度梯度離心法分離乳源外泌體所使用的介質一般為蔗糖。Timothy等[40]用此法分離牛乳外泌體，經過兩次離心去除乳脂肪、細胞碎片及酪蛋白，然后配制43%、35%、5%的蔗糖溶液依次加入裝有樣品的離心管中，在25000 r/min條件下離心16 h，從43%與35%的蔗糖梯度間收集外泌體。密度梯度離心法需要制備不同梯度的介質溶液，實驗操作嚴格不易掌握。因此，有研究者對此法優化，即一步法蔗糖墊緩沖超速離心[41]。該方法以人的間充質干細胞為研究對象，去除細胞碎片后在離心管中加入30%的蔗糖溶液，然后在4 ℃和100000×g進行90 min的超速離心，收集沉淀并用緩沖液重懸，再次進行超速離心，所得沉淀即為外泌體。因此可將此法用于分離乳源外泌體，此法在操作上進行了簡化，不需要添加多種濃度的蔗糖溶液，降低離心力減少離心時間，從而降低對外泌體形態造成的損傷。

2.1.2 化學沉淀法 化學沉淀法又稱聚合物沉淀法，通常采用親水聚合物劫持水分子，導致外泌體溶解度降低，隨后在低速離心條件下沉降[42]，通過2～3次低速離心去除乳液中的細胞碎片、乳脂肪及酪蛋白，再將乳清與親水聚合物共孵育達到沉降外泌體的效果，最后進行10000×g的離心得到外泌體。該方法操作簡單而且不需要超速離心機長時間運行，實驗室普通離心機即可達到離心要求。目前已有多種基于親水聚合物的外泌體分離試劑盒，例如Thermo公司含有聚乙二醇（PEG）總外泌體分離試劑盒（4484453）和Invent公司非PEG的高效外泌體沉淀試劑（EI-027）等?；瘜W沉淀法操作簡單耗時短，不需要超高速離心，得到的外泌體形態完整。該方法分離的外泌體可用于外泌體表征實驗及miRNA組學分析，但是得到的外泌體樣品純度不高[43]，不適合外泌體蛋白組學分析。另外，這種商業化的外泌體分離試劑價格昂貴。

2.1.3 免疫親和法 免疫親和法是將抗體固定在磁珠或其他基質上，通過抗體與外泌體表面特異性受體的結合，以達到外泌體的分離和富集[44]。目前已有基于外泌體表面特異性膜蛋白CD9、CD63、CD81等開發出的商業化外泌體分離試劑盒，如外泌體-人CD9分離試劑（10614D）等。這種方法適用于分離具有相同膜蛋白表達的外泌體，但已有研究證明四跨膜蛋白并不是存在于所有外泌體中[22]，并且有些蛋白并不是外泌體所特有的，它們只是會在外泌體中富集，例如CD63在一些細胞碎片、溶酶體、胞內體中也存在。這就造成某些外泌體的丟失以及獲得的外泌體中會存在雜質和某些干擾蛋白。

2.1.4 尺寸排阻法 尺寸排阻法是一種根據外泌體直徑利用色譜柱進行分離提取的方法，通過使用基于外泌體大小的多孔固定相來分離外泌體、大分子和顆粒物質[45]。樣品中相對較小的成分可以率先通過孔隙，洗脫時間較晚；而具有較大半徑的成分可以避免進入孔隙，較早完成洗脫。研究證實，相比離心法尺寸排阻色譜法分離外泌體的完整性更好[46]。但尺寸排阻色譜法分離外泌體的過程較長，不適合處理大量樣品。

2.1.5 微流控技術 近年來，微流控技術是具有前景的外泌體分離方法，此法是基于外泌體生物化學和物理特性差異的微尺度分離技術[47]。研究人員根據外泌體與其他微粒的不同尺寸，在電場中受到不同大小的電場力和粘滯力，將微流體力學與電學技術相結合，實現外泌體的分離[48]。He等[49]將微流控技術與免疫磁珠法相結合分離外泌體。Yasui等[50]將帶電納米線與微流控芯片連用分離尿液中的外泌體。微流控技術分離外泌體具有分離速率快、對樣本需求量少的優點，但目前在醫學領域較多使用，尚未發現該方法用于分離乳源外泌體。

表1對外泌體的分離方法的優缺點進行了總結。

表1 外泌體分離方法總結Table 1 Summary of the exosome isolation methods

2.2 外泌體鑒定

目前外泌體的分離手段很難獲得純凈且單一的外泌體樣品，因此要通過多種實驗來評估外泌體樣品的純度和完整性。但是單一實驗不能準確鑒定外泌體的存在，通常需要多個表征實驗來相互驗證，即鑒定外泌體的形態、顆粒大小及表面標記物。外泌體鑒定方法的基本原理及檢測內容如表2所示。

表2 外泌體鑒定方法Table 2 Identification methods of exosomes

2.2.1 外泌體形態鑒定 電鏡成像可直觀地觀察到粒子的形態，因此被用于鑒定外泌體的存在和完整性。電鏡成像的常用方法有透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）、掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）和冷凍電子顯微鏡（Cryo-Electron Microscope，Cryo-EM），來表征外泌體的微觀結構。

透射電子顯微鏡是一種表征外泌體的常用技術，它可以分辨直徑小于1 nm的圖像[51]，利用透射電鏡對外泌體進行鑒定的思路主要是將外泌體固定在銅網上并進行染色。1981年，Trams等[52]通過透射電子顯微鏡發現一組直徑在40～1000 nm范圍的囊泡樣結構。掃描電子顯微鏡利用聚焦高能電子束來掃描樣品，通過光束與物之間的相互作用，激發外泌體的物理信息[53]。它是一種介于透射電子顯微鏡與光學顯微鏡之間的一種觀察手段，新式掃描電子顯微鏡的分辨率可以達到1 nm，放大倍數可以達到30萬倍及以上。冷凍電子顯微鏡是一種可以在極低溫度下觀察外泌體形態結構的技術，可以觀察冷凍狀態的外泌體[54]。它不同于透射電鏡和掃描電鏡需要固定和染色，避免其所產生的影響，所以該電鏡觀察到的外泌體是圓形結構而非“杯盤”形態。

2.2.2 外泌體尺寸大小鑒定 納米粒子跟蹤分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）和動態光散射（Dynamic Light Scattering，DLS）是測量懸浮粒子分布的技術。納米粒子跟蹤分析是一種用于實時監測粒子尺寸大小和濃度的流行光學粒子跟蹤技術[55]。通常用一束光照射外泌體粒子，當粒子散射光并經歷布朗運動時，可以記錄每個粒子的運動路徑，并可以確定擴散系數和平均速度。據報道，在納米粒子測量過程中，粒子由聚焦的激光束照射，視場中每個粒子散射的光通過顯微鏡聚焦到攝像機的圖像傳感器上[56]。納米粒子跟蹤分析可以識別并跟蹤每一個粒子，通過Stokes-Einstein方程計算粒子的大小。

動態光散射測量來自單色光源的外泌體發出的散射光。根據粒子在溶液或懸浮液中經歷布朗運動，所有粒子的散射光受到干涉，強度隨時間波動。據報道，可以將粒子的波動系數直接轉換為擴散系數[57]，系統檢測出顆粒做布朗運動所產生的擴散系數，代入Stoked-Einstein方程，計算得到顆粒的粒徑大小。

2.2.3 外泌體標志物鑒定 免疫印跡法（Western blotting，WB）可對外泌體膜上的特異性蛋白質進行定性[58]。根據變性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAEG）分離蛋白，然后進行轉膜。該膜在含有一抗的溶液中孵育，并通過使用適當標記的配體檢測所產生的抗原-抗體復合物。最常見的方法是基于使用與辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）或堿性磷酸酶共軛的抗IgG二次抗體對抗原特異性抗體的酶聯免疫檢測。通過使用一種增強的化學發光劑方法來實現抗體-抗原復合物的可視化。目前，外泌體常用的標記蛋白為TSG101、CD9、CD63、CD81、ALIX 等。另外，Kugeratski等[59]認為syntenin-1也可以作為外泌體的標志物，他們通過對14種來源的外泌體進行蛋白組分析，發現syntenin-1不僅是含量最高，而且相較于四跨膜蛋白其普遍性更好。

流式細胞術（Flow cytometry）是對外泌體膜表面及內部的特異性標志物進行定性和定量的有效方法[60]。其原理是流式細胞儀引導細胞通過流體動力學聚焦在流體流的激光束中，一個探測器與激光束對齊，測量前向散射光。其他探測器測量側散射光和垂直于光束的熒光強度。它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數，具有速度快、精度高、準確性好的優點，是當代最先進的細胞定量分析技術之一。目前，用于外泌體定量檢測的準確性不斷提高，通過單克隆抗體對外泌體進行定性及定量分析。

3 乳源外泌體的組學研究

3.1 外泌體蛋白質組學

蛋白質組學是以蛋白質組為研究對象，研究細胞、組織或生物體蛋白質組成及其變化規律的科學，是指一種基因組所表達的全套蛋白質，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。蛋白質組學本質上指的是在大規模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等[61]。

Yang等[62]利用質譜及iTRAQ技術對人乳與牛乳外泌體蛋白進行定性和定量，在人乳與牛乳外泌體中鑒定出575種差異表達蛋白。這些差異表達蛋白參與的生物學途徑不同，表明母乳與牛乳在外泌體蛋白組成方面存在差異。范世杰[63]對荷斯坦牛、牦牛和駱駝三種動物乳外泌體進行了蛋白組學分析，在這三種動物乳源外泌體中發現有373個差異表達蛋白，這些差異蛋白主要參與癌癥、細菌和病毒感染及血管生成等信號通路。

目前具有商業用途的動物乳有荷斯坦牛乳、牦牛乳、水牛乳、山羊乳、駱駝乳，從外泌體蛋白的角度來說，可以將這幾種動物乳的與母乳進行蛋白組學分析，挑選出最接近母乳外泌體蛋白的動物乳，對嬰兒配方乳粉外泌體蛋白進行母乳化模擬，可以縮短母乳與嬰兒配方乳粉喂養嬰兒之間的差距。

3.2 外泌體脂質組學

脂質組學是對整體脂質進行系統分析的一門新興學科，通過比較不同生理狀態下脂代謝網絡的變化，進而識別代謝調控中關鍵的脂生物標志物，最終揭示脂質在各種生命活動中的作用機制[64]。

乳中的脂類大多數以脂肪球的形式穩定地存在于乳中，極少的部分以磷脂雙分子層構成的生物膜存在于外泌體及其他囊泡中。由于外泌體中脂類含量相對較少以及脂類極易變性不易保存的原因，目前關于乳源外泌體脂質組學或完整的脂質譜報道尚不多見，有待進一步研究探索。但是研究發現外泌體形成及其與受體細胞融合的過程中，即膜分裂、膜融合的過程與脂質、脂質轉運體以及脂質代謝酶類密切相關，在這一過程中，需要大量的膽固醇、磷脂以及鞘磷脂等[65]。另外，外泌體中的脂質可以作為載體，并且可以通過體外操作對脂質組成進行修改，將外泌體脂質應用于相關的藥物傳遞系統[66]。

3.3 外泌體RNA組學

RNA組學就是從基因組水平研究細胞中非編碼RNA結構與功能的一門新的科學[67]，它揭示一個全新的由RNA介導的遺傳信息表達調控網絡，從而以不同于蛋白質編碼基因的角度來注釋和闡明人類基因組的結構與功能。

外泌體中的miRNA由堅固的磷脂雙分子層包裹，在通過血液循環時不被血液中的RNA酶降解，是mi RNA介導人體細胞間通訊的基礎。Chen等[68]通過Solexa測序系統鑒定出牛乳中存在245種miRNA，并分析出有7個miRNA在整個泌乳期表達是相對一致的?？梢詫⑦@個發現運用到乳品質量檢測中，將穩定表達的miRNA作為反映乳品質優劣的指示劑，可以更加精確地檢測乳品的質量。另外，有研究同樣利用RNA組學進一步發現miR-378和miR-185可以成為檢測牛乳腺炎的分子診斷標志[69]。

4 結論與展望

研究表明乳源外泌體在介導細胞交流、促進細胞發育以及參與免疫反應中發揮著重要作用。并且通過飲食調控來傳遞乳源外泌體中的生物活性成分，經過胃腸道消化系統作用于相關靶器官這一過程已經得到研究證實。目前，乳源外泌體的研究還存在一些不足。其一是乳源外泌體的分離鑒定方面，離心、化學沉淀等方法都存在各自缺點，且需要對外泌體進行多個鑒定實驗；其二是對不同乳源外泌體的差異分析不夠全面?，F對不同乳源外泌體的差異分析主要集中在蛋白方面，對不同乳源外泌體多組學分析還未見報道。牛乳制品越來越多地存在于人們的生活中，尤其是牛乳基嬰兒配方乳粉更是嬰兒乳粉的主流，所以全面分析牛乳與人乳外泌體差異是有意義的。本文研究期望為以牛乳為原料模擬人乳的嬰兒配方乳粉提供科學依據。