光動力殺菌機制及在食品應用中的優勢與不足

孟媛媛，劉海泉,2,3，潘迎捷,2,3，趙 勇,2,3,

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；

2.農業農村部（上海）水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海 201306；3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

光動力殺菌（Photodynamic inactivation technology，PDI）是一種新型的非熱殺菌技術，是利用光激活光敏劑產生的活性氧物質引起微生物死亡的殺菌技術[1]。有研究表明PDI可以有效殺死金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等細菌[2]，對黑曲霉、黃曲霉、灰黃青霉和白色念珠菌等真菌殺菌效果顯著[3]。同時也可以殺滅杜蘭病毒[4]、 H5N8禽流感病毒[5]等。此外，其最大的優點是不易使有害微生物產生耐受性[6-10]。

在食品生產與加工環節中存在廣譜殺菌性抗生素投入過量的情況，微生物抗生素耐藥性已是21世紀全球范圍內令人關注的公共衛生問題之一，不僅在醫療領域受到重視，在食品衛生安全中也是重點關注的問題[11-14]。抗生素不能在原有的殺菌時間或藥物濃度下有效的完全清除病原體，是細菌耐受性的具體表型之一[15]。有害微生物抗生素耐受性的增強迫切需要找到其他新型安全的殺菌技術，而光動力殺菌技術既可以達到殺滅有害微生物的效果，同時不易使其產生耐受性。這一特性也使得PDI在醫療領域的研究和應用非常廣泛，但是在食品的應用仍處于研究階段。本文系統闡述了PDI不易產生耐受性的殺菌機制，PDI的影響因素以及其在食品中的研究進展，就PDI在食品研究中給出新見解，以期為其在食品領域的進一步應用提供依據。

1 PDI的殺菌機制

PDI作為一種不易產生耐受性的殺菌技術，其原理見圖1所示。當特定波長的光照射到微生物上時，光的一部分會被光敏劑吸收，光敏劑會被激發出更高的能量形成激發單重態（1PS*），此狀態不穩定會返回基態或形成穩定的激發三重態（3PS*），激發三重態會與細胞內底物特別是氧發生反應，傳遞能量給氧分子，隨后產生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）。ROS是PDI起到殺菌作用的有效成分，會產生氧化應激，可以同時作用多種靶點，包括破壞微生物的細胞壁、細胞膜等，對細胞的遺傳物質DNA產生負面影響，干擾蛋白質的正常表達等多種方式協同造成致病菌死亡[6,8]。在抗生素作用過程中，細菌可以通過發生靶點突變，使得抗生素不易與細菌結合產生抗生素耐受[16]；但在PDI作用過程中，觸發的難以被細菌抵消的多種殺菌機制大部分是致命的，而不僅僅是抑制生長，細菌在短時間內被完全殺死，無法同時產生多重抵抗機制，此原理使得微生物不易產生耐受性[1,7,17]。研究表明PDI可以治療萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌引起的感染，殺滅銅綠假單胞菌等耐藥細菌[18]。

1.1 對細胞形態及結構影響

細胞壁可以維持微生物外形、減少機械和滲透損傷，并且協助細胞的生長和運動，防止大分子入侵[19]。有研究表明細菌經過光敏劑處理后，在黑暗和有光照射的條件下經掃描電鏡觀察顯示，光照后的細菌形態、大小發生變化，細胞壁出現損傷的跡象，細胞質發生流失，細菌最終死亡。但黑暗條件下的細菌形態規則，無顯著變化[9,20-21]。Alex等[22]研究結果顯示經玫瑰紅和赤蘚紅介導LED光照射金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特菌和海氏腸球菌的表面張力發生變化，細菌的表面疏水性降低，金黃色葡萄球菌表面轉移電子能力減弱，大腸桿菌非極性組分增加。研究者認為，PDI改變細菌表面的理化性質，干擾了脂質雙分子層的兩親特性，是引起細菌死亡的原因之一。

1.2 對細胞膜的影響

細胞膜的滲透性屏障對細胞進行能量轉換、物質運輸、信息識別與傳遞、細胞免疫和代謝調控等功能是必不可少的[19]。Gong等[23]研究表明姜黃素介導的PDI破壞了假單胞菌的細胞膜完整性，增加了細胞膜的通透性。膜的通透性增加可能會導致細胞內物質泄漏，破壞細菌的正常生理功能。因此PDI對細菌外膜蛋白的光損傷或降解作用可能是抑制細菌生長的原因之一。Gao等[24]使用GLSM聯合PI染色證實經PDI后，牡蠣中的大腸桿菌DH5α的膜通透性增強，這可能是細胞內產生的ROS損害膜的通透性，最終導致細菌死亡。Alex等[22]實驗結果顯示，PDI處理后細菌的細胞質膜受損，引起了胞內鉀的泄漏。經PDI后的細胞內ROS過度積累是細胞死亡的直接或間接原因，過量的ROS會破壞細胞膜、細胞質膜和核膜，是引起致病菌死亡的原因之一[23]。

1.3 對DNA的影響

DNA是細菌在細胞物質合成和遺傳過程中具有重要作用的遺傳信息載體，是細菌正常生理活動和繁殖的基礎。一旦DNA被破壞，細菌就不能正常生長[19]。有研究顯示，經PDI處理單增李斯特菌的DNA發生巨大損失[22]。光敏劑經過光激發產生的活性氧與核酸發生靜電相互作用在鳥嘌呤殘基上引起DNA裂解。同時，有研究報道經PDI處理后，細菌eDNA中的鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）殘基明顯減少，說明PDI可能是通過破壞DNA的組成成分，從而降解DNA鏈[6]。

1.4 對蛋白質的影響

PDI產生的ROS可以作用微生物的蛋白質，影響其各項功能表達。如Chen等[9]研究姜黃素介導藍色LED光照射副溶血性弧菌，研究結果顯示細菌的部分蛋白質出現高降解，蛋白質是姜黃素介導PDI的脆弱靶點之一。ROS可以與蛋白質中的各種氨基酸殘基反應，導致組氨酸殘基的丟失。特別是硫氨基酸、半胱氨酸和蛋氨酸容易受到影響[9]。

2 影響PDI效果的因素

PDI的三個基本要素是光源、光敏劑與氧氣[22]，它們可能會影響PDI的殺菌效果。

2.1 光源

光源的波長與PDI殺菌成功與否有著直接的關系。在PDI研究中主要考慮的是光源的發射波長以及光敏劑的吸收波長[6]。在光源選擇上，一般有寬帶光（發光二極管）、激光等。發光二極管（LED）是利用波長在200～780 nm之間的光能。波長范圍為200～280 nm（UV-C），280～320 nm（UV-B），320～400 nm（UV-A）和 400～470 nm（藍光）均具有抗菌功效[24]。在水消毒領域，200～280 nm（UV-C）波長范圍內的光源抗菌效果較佳；在食品加工領域中波長為365、395和455 nm發射光的應用廣泛；在光療、染色和涂層固化以及油墨固化等領域常使用紅光和紅外（630～1000 nm）[25]。

激光也可以用來激活光敏劑，包括CO2激光、Nd:YAG激光、Er:YAG 激光、半導體激光、強脈沖光等，具有操作簡便、治療快速、創傷小、恢復期短等優點，常在腫瘤、真菌類疾病治療和美容醫療領域中應用[26-28]。與激光相比，發光二極管（LED）的優勢在于操作簡單，經濟實用，并且單色激光技術還未被證明比寬帶光更適合PDI應用[29]。

2.2 光敏劑

光敏劑是一種存在于細胞內的物質，隨著高效光敏劑研究的不斷進步和發展，至今已知的具有光敏特性的化合物有400多種，包括染料、化學物質和許多天然物質。在PDI中，最常用的染料包括如亞甲基藍和甲苯胺藍聚賴氨酸、血卟啉和玫瑰紅等[30]。光敏劑可以顯著提高PDI的殺菌效率，因此現階段大多數研究主要集中于發現或合成更好的光敏劑[6]。

2.2.1 內源性光敏劑 內源性光敏劑廣泛存在于一些病原微生物中，LED光殺菌的原理就是通過激活細菌細胞壁中存在的內源性光敏劑卟啉，產生活性氧最終導致細胞死亡[26]。同時，在部分食品中也含有光敏劑，如牛奶中含有核黃素、原卟啉、四吡咯和葉綠素等光敏劑[31]。綠色蔬菜和水果中也含有豐富的核黃素[32]。內源性光敏劑的優點是安全無毒，當需要緩慢、漸進的效果時，利用內源性光敏劑是一種理想的選擇。例如家用冰箱、超市貨架和食品儲藏室基本具備持續的光源，光源激活內源性光敏劑起到緩慢且穩定的殺菌效果[6]。

2.2.2 外源性光敏劑 當未添加外源性光敏劑時，往往要照射7 h以上才能達到完全滅菌的效果，而添加適量光敏劑后通常只需10～20 min[33]。因此，在需要迅速殺菌或內源性光敏劑殺菌效果低于預期時，可以添加外源性光敏劑縮短殺菌時間，增強殺菌效果。現階段，廣泛使用的光敏劑有人工合成和天然光敏劑，人工合成光敏劑中常見的有卟啉衍生物、氯丁和酞菁衍生物等[6]。卟啉衍生物是指通過化學修飾使卟啉能夠合理的轉化為具有優越光活性的各種衍生物，如二氫卟吩[34-35]。酞菁衍生物是將四個苯環或萘環連接到卟啉環的四個吡咯β位上，再把meso-H對應的C轉換為N形成酞菁，在波長750～900 nm范圍內光吸收較強[36]。這些光敏劑均具有較好的殺菌效果[37-38]。

天然光敏劑大多數是從天然植物中提取出。金絲桃素是一種天然活性成分，可以從貫葉連翹中分離出來，具有抗抑郁、抗腫瘤和抗病毒活性。因其無毒、無遺傳毒性作用，是應用中的最佳候選光敏劑[9,37]。姜黃素是一種從姜黃中分離出來的天然多酚類化合物，具有抗病毒、抗氧化、抗微生物和抗炎作用，在PDI中作為光敏劑應用廣泛[35]。此外，其他常用于PDI中的天然光敏劑有玫瑰紅[39]、赤蘚紅[40]、竹紅菌素[41]、葉綠素鈉鎂[42]等。

2.3 氧氣

PDI中最終導致細胞死亡的有效物質是活性氧物質[9]。活性氧是在有氧存在的條件下，光敏劑與其相鄰分子發生碰撞通過如下兩種方式產生的。第一種方式是I型光化學反應，受激發的光敏劑從系統組件中提取出一個電子或氫原子，形成了兩個自由基，即光敏劑自由基和底物自由基。如果系統中存在氧，則光敏劑自由基可將新獲得的電子轉移到氧上，形成超氧自由基，如過氧化氫、超氧陰離子、羥基自由基，光敏劑返回到其基態。在這一過程中，有可能光敏劑被消耗而不被再生。另一種方式是II型光化學反應，光敏劑與氧分子發生碰撞，生成單線態氧，在這種途徑中光敏劑不會消失[25]。單線態氧在水溶液中存在時間不超過4 μs，擴散范圍約為125 nm。單線態氧在其回到基態前，有機會與擴散范圍內的任何生物分子發生反應[43]。Quiroga等[44]添加氧化清除劑（氬、疊氮化鈉）到卟啉光敏劑介導PDI處理白色念珠菌，實驗結果顯示在低氧含氬條件下，卟啉光敏劑的殺菌活性顯著降低，說明氧在PDI中起到重要作用；疊氮化鈉作為單線態氧的猝滅劑，當疊氮化鈉存在時，白色念珠菌受到高度保護未受到光動力的影響；實驗結果表明殺滅白色念珠菌的主要物質是單線態氧，說明單線態氧是參與細胞損傷的主要活性物質。

這兩條途徑中哪一條是主導的，取決于細胞內分子氧和光敏劑含量的水平。同時，氧和光敏劑這兩種因素會直接影響到單線態氧和氧自由基的產率。當氧濃度過低或缺氧時，活性氧物質產率過低甚至不發生光化學反應，PDI效果較差或者無效果。產單線態氧高的光敏劑PDI效果更佳[45-46]。在大部分食品貯藏中，由于氧氣是較難控制的，至今氧對PDI影響的相關研究報道較少。因此，PDI的三個基本要素中，每一個要素都可以不同程度地控制，但光通常是最易調節的，氧氣是最難控制的，光敏劑則是最大限度地提高PDI處理成功的關鍵[9]。

3 PDI在食品中的應用及其優勢與不足

在體外PDI對致病菌的作用效果顯著的基礎上，研究者開始探究該技術在食品中的應用潛力。對不同食品的研究見表1所示。在應用研究中，有利用部分食品含有的內源性光敏劑直接光照后達到殺菌效果，或添加外源性光敏劑介導PDI。近年來，也有研究者通過復合PDI和氣調包裝技術達到更佳的防腐保鮮效果。

表1 光動力殺菌技術在食品中的應用研究Table 1 Research of photodynamic inactivation technology in foods

部分食品中含有豐富的光敏劑，如牛奶中含有核黃素、原卟啉、四吡咯和葉綠素等，可以通過直接光照達到殺菌效果。Srimagal等[47]研究藍色LED光處理對牛奶中大腸桿菌殺菌的影響，實驗結果顯示，不同條件下大腸桿菌數均減少，其中波長405 nm，光照60 min可以減少大腸桿菌5.27 lg CFU/mL。在室溫和冷藏條件下，波長405 nm、光照37.83 min的LED光處理的牛奶，牛奶的貨架期分別為19 h和9 d。與普通巴氏殺菌牛奶相比，LED光處理的牛奶具有更長的保質期。然而光只能照射到物體的表面，不能穿透食品內部。大量的研究者通過在食品表面涂抹或噴淋光敏劑增強PDI殺菌效果。因此，開發新型光敏劑增強殺菌效果的研究一直是熱點內容。

隨著人們對健康食品、綠色食品的追求以及食用安全性的考慮，引領了研究者對天然光敏劑的開發趨勢，出現了姜黃素、核黃素、葉綠素等安全無毒的天然光敏劑。姜黃素作為一種天然性、安全性高的食品級光敏劑，在PDI中更易得到消費者的接受，因此以姜黃素介導PDI在食品中的研究非常廣泛。Corrêa 等[48]使用濃度 40 μmol/L 的姜黃素，波長450 nm，光劑量15 J/cm2的LED光照射牛肉、雞肉和豬肉，金黃色葡萄球菌數量分別減少1.5、1.4和0.6 lg CFU/mL；使用濃度80 μmol/L姜黃素和光劑量10 J/cm2照射蘋果，發現金黃色葡萄球菌數量減少2 lg CFU/mL。但在實際應用中，天然光敏劑由于疏水性較強導致其有效性受到限制，研究者們通過將光敏劑納米級化有效地解決了這一難題，改善了光敏劑的化學效率，增強PDI殺菌效率和應用潛力。Duse等[49]將姜黃素與殼聚糖納米粒子結合改善姜黃素的溶解度，使光敏劑可以更好地在PDI中發揮作用。然而，大多數天然光敏劑是由植物中提取出常常帶有顏色，這可能會影響到產品的感官品質，因此在應用研究中建議首選與食品相同顏色的光敏劑。此外，可以開發無色無味的天然光敏劑，這將是一項新的挑戰。

近年來，也有研究者復合PDI與其它保鮮技術，如光敏劑與氣調保鮮聯合達到更好的殺菌、保鮮效果。周阿容等[50]通過復合PDI與真空包裝有效地解決了鮮蓮在流通過程中因產酸產氣微生物的生長繁殖導致的酸敗、脹袋現象；研究者發現濃度為1.5 mmol/L姜黃素，光照45 min有良好的滅菌效果，抑菌率達99%，并且不影響鮮蓮的水分含量，可以最大程度地保持鮮蓮的風味，有助于蓮子的流通銷售，并有效地延長貨架期。

在PDI殺菌過程中的有效物質是單線態氧或自由基物質等活性氧物質，而活性氧在破壞微生物的細胞壁、遺傳物質和干擾蛋白質的正常表達的同時，是否會對食品中包含的蛋白質、維生素等成分產生影響的研究暫未見報道，因此研究者們應關注PDI殺菌過程中食品自身營養成分的變化。有研究表明活性氧物質可以通過誘導腺苷一磷酸活化蛋白激酶途徑增加肉的嫩度，加速糖酵解使得肉的保水性下降，清除活性氧后，牦牛肉的保水性顯著提高[51]。也有研究顯示PDI處理可以有效地延緩哈密瓜褐變速率，并保持新切哈密瓜的光度、牢固度、含水量和可溶性固體含量[52]。至今活性氧物質對不同食品品質的影響研究結果不同, 探究活性氧殺菌對不同種類食品品質的影響，將有助于將PDI應用到更適宜的食品種類中。因此，研究者應更加關注PDI對食品品質的影響和變化。其次，單線態氧的壽命短，食品所處的環境復雜，精準測定PDI過程中起到作用的活性氧含量也是一項巨大的挑戰。

綜上所述，研究者們應選擇殺菌效果佳，對食品營養成分及品質無影響的活性氧濃度，確定最佳的光敏劑種類及劑量。從光源的選擇和光敏劑的種類及劑量控制，以及活性氧含量等多個角度考慮，開發出殺菌效果佳，對食品無影響，并且在實際應用中成本低效率高的PDI光源和光敏劑，以及探究光敏劑種類和劑量的最佳使用范圍。這對PDI技術在食品工業領域的實際應用具有重要意義。

4 總結與展望

在食品質量控制中，抗生素是現階段控制有害微生物的重要手段之一。但由于有害微生物的耐藥性，全球范圍內的科研人員投入大量的精力和物力開發新型抗生素，但細菌和病毒等有害微生物仍然在不斷的突變中，給食品等各領域造成的經濟損失非常巨大。因此，開發對耐藥機制不敏感的殺菌技術是維護食品質量安全的必然趨勢。PDI作為一項成熟的技術，在醫療和臨床中的應用非常廣泛，但在食品質量安全領域的應用仍然處于研究階段。PDI殺菌效果佳、操作簡單、安全環保，在食品領域中具有巨大的應用潛力[62-63]。

已有研究者對該技術作用食品防腐的研究進行報道，但PDI在奶制品、肉制品和果蔬品等不同類型的食品中殺菌效果不同，因此加深PDI在不同食品殺菌效果差異比較，這有助于PDI在適宜的食品領域中發揮優勢。此外，PDI對食品品質影響的研究仍處于探究階段，對食品營養成分影響的研究處于空白階段。因此，PDI在食品基質的適應性和影響研究，對PDI技術商用化具有重要意義。PDI也可與其它防腐技術相結合，如核黃素與天然抗菌物質殼聚糖復合制備抗菌包裝材料，初期研究結果顯示二者結合抗菌效果佳[64]。PDI不僅可以直接作用到食品殺菌中，也可以用于配送設備、廚房設備或包裝材料的去污殺菌。并且，PDI還可以應用到水產養殖中，將光敏劑加入水產品養殖池塘后經過照射達到殺菌效果，替代生產養殖中的抗生素，具有長期應用潛力。這不僅對有助于水產養殖的綠色生態防控，還能從源頭保證食品的質量和安全。

綜上所述，有害微生物作為食品質量安全問題的威脅之一，尤其對有低溫殺菌需求的食品而言，PDI是一項優良選擇。PDI作為一種有新型非熱殺菌技術，開拓了控制食品有害微生物的途徑，對維護食品質量安全問題具有重大意義。