地貧核酸檢測國家參考品對單分子測序試劑的適用性評價

于婷 胡澤斌 黃杰 孫楠

地中海貧血（以下簡稱地貧）是指因珠蛋白基因缺陷（包括點突變、缺失等）導致的一種常染色體隱性遺傳?。?-3］，重者以進行性溶血性貧血為主要特征。我國以兩廣地區、海南等南部沿海地區發病率最高［4］。重型地貧目前尚無經濟有效的治療方法，因此通過遺傳咨詢與產前篩查技術是避免重型胎兒出生的最佳措施。截止到2022年7月，已有20 多個地中海貧血基因檢測試劑盒獲得醫療器械注冊證，檢測原理包括跨越斷裂點PCR（Gap-PCR）等。由于檢測原理及平臺不同，存在漏檢、假陰性及交叉反應等風險點，中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）在2017年發布了地中海貧血核酸檢測國家參考品（以下簡稱國家參考品），作為統一尺度評價各類試劑盒的性能。隨著測序技術的發展，第三代測序技術（即單分子測序）也開始應用在地中海貧血基因突變檢測上，部分已開發成試劑盒。由于國家參考品研制時，只采用了當時已上市試劑盒進行驗證，并不包含三代測序技術的試劑盒，因此本研究擬開展該套參考品適用范圍的擴展研究。

1 材料與方法

1.1 研究對象

地中海貧血核酸檢測國家參考品，批號：360014-201701，32 支/套，包含α 缺失和突變、β 缺失和點突變以及正常人樣本，由中檢院研制并提供。

1.2 試劑

地中海貧血基因檢測試劑盒（單分子測序法）、核酸提取或純化試劑、測序反應通用試劑盒（杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司）；Qubit dsDNA HS Assay Kit（美國ThermoFisher SCIENTIFIC 公司）；No-Amp Accessory Kit、Sequel II Binding Kit 2.1、SMRT Cell 8M（1-Cell Tray）、Sequel II Sequencing Plate 2.0（1 rxn）（美國Pacific Biosciences 公司）。

1.3 儀器和軟件

Sequel II CNDx 基因測序儀、地中海貧血基因檢測數據分析系統（杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司）；Qubit 熒光定量儀Qubit3.0（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；基因擴增儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 地中海貧血基因檢測試劑盒（單分子測序法）試劑盒檢測原理

基于第三代測序技術平臺的單分子實時DNA測序技術（Single Molecule Real-Time，SMRT）。針對人全血樣本，通過在各突變位點附近設計引物，直接對目標區域進行長片段擴增，在目標DNA 長片段兩端連接接頭，使用消化酶去除非環狀片段，最終獲得啞鈴狀文庫。試劑盒配套使用基因測序儀Sequel II CNDx，構建好的啞鈴狀文庫結合測序引物和酶，在SMRTCell 的納米小孔（ZMW）中進行單分子測序。測序后的基因序列對比到參考基因序列上，通過生物信息軟件分析，識別攜帶基因突變的DNA 序列，獲得相關基因突變信息。具體過程見圖1。

圖1 地中海貧血基因檢測試劑盒（單分子測序法）試劑盒檢測原理Figure 1 The detection principle of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing）kit

1.4.2 適用性研究方案

按照α/β-地中海貧血基因分型檢測試劑盒行業標準（YY/T 1527-2017）［5］及國家參考品說明書要求，確定研究項目為準確性、特異性及檢測限。要求檢測試劑盒范圍內的國家陽性參考品，結果應為相應基因型別；檢測國家陰性參考品和試劑盒范圍外的國家陽性參考品，結果應為未檢出突變；檢測限濃度要求不高于10 ng/μL，本研究中采用試劑盒聲稱的檢測限濃度（3 ng/μL）進行考察。

1.4.3 文庫構建、純化及質檢

取國家參考品恢復至室溫混勻備用，并將試劑盒檢測范圍內的國家參考品稀釋至3 ng/μL 混勻備用，即為檢測限參考品。按照試劑盒說明書的操作方法，對國家參考品擴增、接頭連接、消化反應構建DNA 文庫；完成后，立即使用配套的DNA 純化試劑盒進行兩次純化，并對純化后到的文庫進行質檢。采用Qubit 熒光定量儀檢測，滿足以下條件方可進行上機測序：①單個文庫濃度≥3 ng/μL；NTC 文庫濃度≤1 ng/μL；②等質量混合后文庫濃度≥3 ng/μL。

1.4.4 上機測序

采用測序反應通用試劑盒，按照說明書要求對質檢合格的文庫處理后上機。文庫上機濃度180～220 pM，推薦200 pM，文庫片段默認2 535 bp。按照配套儀器Sequel II CNDx 基因測序儀的標準操作規程上樣，測序模式選擇CCS，測序時長15 h。

1.4.5 數據分析和結果判定

采用地中海貧血基因檢測數據分析系統對下機數據進行分析，結果判定原則為：對于α 缺失型陽性判斷值以5%為閾值，根據--SEA、-α3.7、-α4.2和--THAI及WT（野生型或非缺失）的比值結果，判定為缺失型雜合突變、雙雜合突變、純和突變或者野生型；對于α 和β 點突變陽性判斷值，以突變比值≥20%且≤80%，判定為對應雜合點突變；突變比值＞80%，判定為對應純合點突變；突變比值＜20%時，判定為N，表示未檢出檢測范圍內的突變。

2 結果

2.1 準確性結果

檢測范圍內的國家陽性參考品的檢測結果均為相應突變型別，準確性滿足要求。見表1。

表1 地中海貧血基因檢測試劑盒（單分子測序法）的準確性結果Table 1 Accuracy results of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing method）

2.2 特異性結果

野生型國家參考品及檢測范圍外的國家陽性參考品的缺失檢測結果均顯示為αα/αα，點突變檢測結果均顯示為“N”，特異性滿足要求。見表2。

表2 地中海貧血基因檢測試劑盒（單分子測序法）的特異性結果Table 2 Specific results of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing method）

2.3 檢測限結果

稀釋至3 ng/μL 的試劑盒檢測范圍內的國家陽性參考品檢測結果均符合預期，檢測限滿足要求。見表3。

表3 地中海貧血基因檢測試劑盒（單分子測序法）的檢測限結果Table 3 Detection limit results of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing method）

3 討論

地貧以α 和β 型最為常見［6-7］。缺失型α 地貧95%以上是由于α 珠蛋白基因大片段缺失所致。我國最常見的是--SEA、-α3.7 和-α4.2 缺失型突變。最常見的非缺失型α 地貧包括αWS（CD122）、αQS（CD125）等［8-9］。我國β 地貧以突變型為主，主要有IVS-Ⅱ-654、CD41/42 等［10-11］?；驒z測在地貧的防控中不可或缺。目前檢測方法主要有Gap-PCR 法、PCR-反向斑點雜交法、二代測序法等［12］。Gap-PCR 法主要用于缺失型α 地貧診斷［13］，該方法設備要求低、步驟簡單，但不能診斷點突變或未知的缺失突變。PCR-反向斑點雜交法主要用于點突變檢測，可對未知樣本中多個突變進行篩查，但檢測時間長、操作復雜、影響因素較多。二代測序技術具有高通量等優點，對于單核苷酸多態性和小于50 bp 的插入或缺失變異檢測比較準確，但是大的結構變異檢測卻不是很理想。近幾年推出的單分子測序技術［14-15］，優勢在于DNA 無需PCR 擴增，可避免在擴增過程中引入DNA 突變以及對富含AT 和富含GC 序列的偏好性，實現對每一條DNA 的單獨測序。它可產生超長的讀長結果，具有高度均一性，可獲得許多當前測序平臺無法得到的基因組信息。因此采用單分子測序技術有利于提高地中海貧血產前篩查的準確性。

為評價基于不同檢測原理的地中海貧血核酸檢測試劑盒的性能，中檢院建立了國家參考品，包含7 種α-突變以及18 種β-突變。本研究中，采用國家參考品對基于PacBio 單分子測序的地中海貧血基因檢測試劑盒進行評價。結果顯示：無α 缺失的樣本，--SEA、-α3.7、-α4.2和--THAI比值在0～0.88%范圍內，遠低于閾值（5%），而野生型樣本的WT 比值均在99%以上。α 缺失的樣本，--SEA、-α3.7、-α4.2、--THAI中一種或者兩種的比值在42.19%～99.83%范圍內，遠高于閾值（5%）；α 或β 點雜合突變樣本，突變比值均在20%～80%范圍內，α 或β 點純合突變樣本，突變比值均＞80%，無α 或β 點雜合突變樣本，突變比值均顯示為＜20%。準確性和特異性均符合預期結果，閾值設置合理。當把試劑盒檢測范圍內的陽性參考品稀釋至檢測限濃度（3 ng/μL）后進行檢測，結果亦滿足要求。要指出的是，5 例檢測范圍外的國家陽性參考品，2 例為未設計相應位點探針，故無檢測數據輸出，另外3 例雖設計了位點亦可檢出，但考慮到后期臨床樣本較難獲得，申報醫療器械注冊證難以獲批，因此在結果設置上顯示為野生型，這也是在現有法規體系下的一種折衷做法。以上結果表明，基于單分子測序平臺的待評價試劑盒，國家參考品檢測結果未出現假陽性或假陰性情況。綜上所述，地中海貧血核酸檢測國家參考品，適用于三代測序的地中海貧血檢測試劑盒質量評價要求，有利于促進同類試劑盒的標準化工作。