趨化因子CXCL7通過血管形成途徑促進結直腸癌增殖、遷移及侵襲的機制研究

程剛 李東鵬 張華鵬 劉華 孫峰 梁海 李龍海

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球消化系統最常見的癌癥之一，發病率和死亡率居前列［1］。2015年中國的一項調查報告顯示，CRC 患者和死亡人數分別為37.63 萬人和19.1 萬人，其次是胃癌、肝癌和食道癌［2］。目前，CRC 的發病機制尚未完全闡明，主流觀點認為與基因或表觀遺傳不穩定、飲食習慣、接觸化學致癌物質、腫瘤血管生成等因素有關［3］。CXCL7 是一種中性粒細胞激活趨化因子，主要來源于外周血小板，其通常被認為與調節糖酵解、有絲分裂和前列腺素合成等有關。近年來國外研究報道了CXCL7 與CRC 患者預后相關，可作為CRC 的診斷生物標志物［4-5］，然而關于CXCL7 在CRC 的發生與發展中的作用機制卻鮮有研究。本研究通過一系列實驗來評估分泌性趨化因子對CRC 腫瘤微環境的影響，探究趨化因子CXCL7 對CRC 細胞增殖、轉移及侵襲的影響與血管生成的關系，旨在闡明CXCL7 促進CRC發展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞與試劑

人CRC 細胞系SW620（美國ATCC 公司）；NCM460 正常細胞株（美國ATCC 公司）；慢病毒載體LV5（EF-1aF/GFP&Puro）（蘇州吉瑪基因科技有限公司）；胎牛血清（批號1658396，Hyclone 公司）；人臍靜脈內皮細胞（批號HUVEC001，澳賽爾斯生物技術有限公司）；Transwell 小室（康寧公司）；Matrigel 膠（美國BD 公司）；PBS（批號20140918，北京索萊寶科技有限公司）；細胞周期測定試劑盒（美國BD 公司）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；凋亡測定試劑盒（Beyotime 公司）；ECL 試劑盒（美國Millipore 公司）；ELISA 試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司）

1.1.2 實驗儀器與設備

酶標儀（VICTOR X5，美國Perkinelmer 公司）；BX53MRF-S 顯微鏡（日本Olympus 公司）；垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；CO2培養箱（型號MIR-162-PC/MIR-262-PC，日本松下公司）；流式細胞儀（美國貝克曼公司）

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

取對數期生長的CRC 細胞在培養基中進行傳代培養，并添加10%胎牛血清、100 μg/mL 的鏈霉素100 μL。所有細胞均置于飽和濕度、37℃的5%CO2培養箱中孵育。

1.2.2 CXCL7 穩轉株的構建

通過qPCR 及ELISA 法檢測CRC 細胞株的表達情況，挑選出高低表達細胞株，對高表達細胞株進行敲降（Knock down），低表達細胞株行過表達（Over expression）處理。克隆位點：NotI BamHI，借助慢病毒載體轉染細胞株構建穩定過表達以及敲降細胞株。

1.2.3 CXCL7 對CRC 細胞增殖能力的影響

使用CCK-8、EdU 染色和平板克隆形成實驗測定CXCL7 對CRC 細胞增殖能力的影響。

1.2.4 CXCL7 對CRC 細胞周期和凋亡作用

收集CXCL7 過表達及敲降的穩轉株，PBS 洗滌，75%乙醇固定后，PBS 繼續漂洗1～2 次，使用細胞周期測定試劑盒，流式細胞儀測定各管細胞周期分布情況。同樣使用不含ETDA 的胰蛋白酶消化處理細胞，經固定與漂洗后，使用凋亡測定試劑盒，流式細胞儀測定細胞凋亡情況。

1.2.5 Transwell 腫瘤細胞侵襲實驗

Transwell 小室上層加入CXCL7+NC 組細胞，下層加入血清培養液，中間加入膠。4%多聚甲醛固定10 min，1%結晶紫染色30 mim，鏡下觀察并拍照，100 倍光鏡下隨機選取5 個視野進行計數，平均值作為計算結果并進行比較。

1.2.6 趨化因子CXCL7 對臍靜脈內皮細胞血管形成實驗

96 孔板放置于-20℃預冷，每孔以50 μL Matrigel 膠包被，置于37℃中孵育30 min，使膠凝固；胰酶消化對數生長期的臍靜脈內皮細胞，用人LoVo 細胞培養上清液重懸后計數，細胞接種于Matrigel 膠包被的96 孔板，每孔接種100 μL 中細胞數4 000 個。培養板置于細胞培養箱中培養，6 h 后加入Calcein-AM/PBS 溶液，37℃避光孵育30 min，PBS 洗滌2 次，熒光顯微鏡下觀察并拍照計數管腔形成數目。

1.2.7 血管內皮生長因子（VEGF）、血管內皮生長因子受體（VEGF-R）表達水平測定

ELISA 試劑盒測量培養上清VEGF 水平，Western blot 檢測血管內皮生長因子受體（VEGF-R）表達水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計學軟件進行統計學處理，計量資料采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時間點吸光度值比較

48、72 h 各組吸光度比較：CXCL7 干擾組＞NC 組＞空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組不同時間點吸光度值比較（±s）Table 1 Comparison of cell proliferation rates in each group at each time point（±s）

表1 各組不同時間點吸光度值比較（±s）Table 1 Comparison of cell proliferation rates in each group at each time point（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與NC 組比較，bP＜0.05。

72 h 1.41±0.12ab 1.13±0.11a 1.01±0.13 17.475＜0.001組別CXCL7 干擾組NC 組空白對照組F 值P 值n6 6 6 0 h 0.25±0.02 0.24±0.01 0.25±0.01 1.000 0.391 24 h 0.34±0.02 0.32±0.02 0.31±0.03 2.471 0.118 48 h 0.82±0.10ab 0.69±0.08a 0.62±0.09 7.567 0.005

2.2 Transwell 細胞遷移實驗

遷移細胞數比較：CXCL7 干擾組（1021.14±106.55）個＞空白對照組（348.36±48.64）個＞NC 組（331.98±46.81）個，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組Transwell 細胞遷移實驗結果（1%結晶紫染色，×100）Figure 1 Transwell cell migration test results in each group（1% crystal violet stain，×100）

2.3 細胞侵襲實驗

侵襲進入下室的細胞數比較：CXCL7 干擾組（103.21±15.33）個＞空白對照組（28.54±8.17 個＞NC組（24.65±8.36）個，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 臍靜脈內皮細胞血管形成實驗

處理CRC 細胞6 h 后，結果顯示空白對照組和NC 組僅有少量小管形成，而CXCL7 干擾組卻形成了大量網狀結構的小管。管腔形成數目：CXCL7 干擾組＞NC 組＞空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖2。

表2 各組管腔形成數目比較（±s）Table 2 Comparison of the number of formed lumen in each group（±s）

表2 各組管腔形成數目比較（±s）Table 2 Comparison of the number of formed lumen in each group（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與NC 組比較，bP＜0.05。

組別CXCL7 干擾組NC 組空白對照組F 值P 值n6 6 6管腔數（個）28.14±3.22ab 15.89±2.16a 4.47±1.10 155.272＜0.001

圖2 各組臍靜脈內皮細胞血管形成實驗結果Figure 2 Experimental results of umbilical vein endothelial cells angiogenesis in each group

2.5 各組VEGF 水平及VEGF-R 陽性表達率比較

VEGF 水平及VEGF-R 陽性表達率：CXCL7 干擾組＞NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組VEGF 水平及VEGF-R 陽性表達率比較（±s）Table 3 Comparison of VEGF levels and VEGF-R positive expression rates in each group（±s）

表3 各組VEGF 水平及VEGF-R 陽性表達率比較（±s）Table 3 Comparison of VEGF levels and VEGF-R positive expression rates in each group（±s）

組別CXCL7 干擾組NC 組t/χ2值P 值VEGF（pg/mL）576.25±84.63 357.47±28.34 15.504＜0.001 VEGF-R 陽性表達率（%）90.0（36/40）67.5（27/40）6.050 0.014

3 討論

近年來國內外大量研究發現，一些趨化因子在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲以及血管形成過程中發揮重要作用［6-7］。趨化因子是一種8～12 kDa的分泌蛋白，可以調節白細胞的遷移，并參與炎癥或傷口組織的修復等生理和病理過程。根據N 末端附近保守半胱氨酸的位置，這些小蛋白可分為CXC-、CX3C-、CC- 和XCL 亞組趨化因子［8-9］。CXCL7 屬于ELR+CXC 趨化因子，其功能與其受體CXCR2 結合，并通過將中性粒細胞聚集到血管損傷部位，影響機體免疫反應［10］。目前，CXCL7 已被證明是乳腺癌、肺癌等多種癌癥中重要的腫瘤微環境調節劑，也是癌癥診斷中的潛在生物標志物［11］。但關于CXCL7 在CRC 發生與發展中的作用機制研究較為少見。本研究擬在前期工作基礎上，運用分子生物學手段及動物實驗技術系統研究CXCL7 對結直腸癌腫瘤微環境的影響，以及對結直腸癌細胞增殖、轉移及侵襲的影響，闡明CXCL7 促進結直腸癌發展的分子機制。本研究有望在趨化因子調節水平為CRC 的診斷及防治提供新的視角和理論依據，并為CRC 的靶向治療和預后提供重要指導。

本研究發現，在細胞增殖實驗中，細胞培養48 h后，CXCL7 干擾組吸光度明顯高于NC 組與空白對照組，細胞增殖作用明顯增強，Transwell 實驗中CXCL7 干擾組遷移與侵襲細胞數均多于NC 組與空白對照組，說明CXCL7 具有協助細胞增殖、遷移與侵襲的作用。血管生成是一個重要的生理過程，在腫瘤的增殖、侵襲和轉移中也起著關鍵作用。血管生成為腫瘤的發展提供了營養支持，并促進腫瘤的持續生長。近年來相關文獻報道［12］，血管生成在CRC 復發和轉移中起重要作用，許多蛋白質和信號分子與CRC 細胞中的血管生成有關，包括VEGF 和趨化因子。VEGF 在CRC 腫瘤中高表達并與不良預后相關。既往研究專注于CRC 患者血清中的CXCL7，及其在CRC 預后中的潛在應用，然而，CXCL7 和血管生成之間的關系鮮為研究。近年來，一些研究揭示了趨化因子在調節血管生成中的作用，如CCL19 通過下調CRC 細胞中VEGF-A的表達來抑制血管生成的能力［13］。因此，可將此類研究作為研究CXCL7 在CRC 患者血管生成中作用的基礎進行參考。本研究結果說明趨化因子CXCL7 可增強小管形成能力，促進腫瘤血管形成。此外，通過選擇VEGF 作為血管生成的標志物，發現CXCL7可增強CRC 細胞中VEGF 的表達。Du 等［14］報道，CXCL7通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路與腫瘤生長、侵襲、遷移和血管生成有關。AKT 信號通路存在于人的所有細胞中，參與細胞生長、凋亡、遷移等多種代謝過程［15］。CXCL7 還可以通過與腫瘤血管生成相關的Ras/Raf/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路發揮其作用。CXCL7 可加速腫瘤轉移通過調節VEGF-R 在CRC 中的表達。因此，CXCL7 可能是通過激活AKT 等信號通路參與CRC 的發生與發展。綜上所述，趨化因子CXCL7 可調控腫瘤微環境，促進腫瘤血管形成，進而協助結直腸癌細胞的增殖、轉移和侵襲。本研究下一階段的研究任務主要是通過動物實驗探究CXCL7 對裸鼠CRC 細胞成瘤能力的影響。