腸道病毒EV71型和CA16型IgM抗體檢測試劑盒的分析性能

何水珍 嚴(yán)荔貞 施少鑫 鐘秋蓉

手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD）是一種由病毒引起的傳染性疾病，5 歲以下兒童為常見患者［1］。腸道病毒71 型（Enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A16 型（Coxsackievirus A16，CA16）是手足口病最常見的致病病原體，其中EV71 是重癥和致命病例中最常見的致病病原體［2］。從20世紀(jì)90年代開始，EV71 在亞洲地區(qū)及太平洋沿岸地區(qū)已經(jīng)導(dǎo)致了數(shù)千人死亡［3］，2008-2017年，全國手足口病總報告發(fā)病率為134.59/10 萬［4］。手足口病不僅對嬰幼兒的健康造成了極大的傷害，而且造成的疾病負(fù)擔(dān)尤為嚴(yán)重［5］，已納入我國法定傳染病丙類管理［6］。IgM特異性抗體是感染初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，可作為感染的早期診斷指標(biāo)。根據(jù)中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會《手足口病診療指南（2018年版）》診斷建議：在臨床診斷病例基礎(chǔ)上，急性期血清相關(guān)病毒IgM 抗體陽性可定為確診病例［1］。早期開展CA16 IgM 和EV71 IgM 抗體的聯(lián)合檢測，可以為手足口病的診斷及監(jiān)控治療，提供切實支撐［7］，因此，EV71 IgM和CA16 IgM 的檢測具有重要的臨床應(yīng)用價值。本研究對基于化學(xué)發(fā)光法檢測腸道病毒71 型IgM 抗體的試劑盒和檢測柯薩奇病毒A16 型IgM抗體的試劑盒進(jìn)行分析性能評價，并探討其臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Caris200（廈門優(yōu)邁科醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；DEM-3 型洗板機（北京拓普分析儀器有限公司）；電熱恒溫標(biāo)準(zhǔn)水箱ZD-600（杭州藍(lán)天儀器有限公司）；酶標(biāo)儀Sunrise（Tecan Austria GmBH）；廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司研制的腸道病毒71 型IgM 抗體檢測試劑盒（磁微粒化學(xué)發(fā)光法）（EV71 IgM CMIA）和柯薩奇病毒A16 型IgM 抗體檢測試劑盒（磁微粒化學(xué)發(fā)光法）（CA16 IgM CMIA）；北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的腸道病毒71 型IgM 抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）和柯薩奇病毒A16 型IgM 抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）。

1.2 方法

1.2.1 分析性能評價

1.2.1.1 精密度評價 參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）相關(guān)文件［8］，連續(xù)測定重復(fù)性參考品CV1 和CV2 各10 次，計算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），以此作為批內(nèi)精密度。將兩批試劑每天在不同儀器上重復(fù)檢測一份強陽樣本（P1）、中陽樣本（P2）、弱陽樣本（P3）及一份陰性樣本（N1）兩次，連續(xù)檢測20 d，綜合日間、臺間、批間等影響變量，計算CV，以此作為中間精密度。

1.2.1.2 機載穩(wěn)定性評價 將試劑放置于儀器上，分別在開瓶的第1 天、第7 天、第14 天、第21 天、第28 天檢測3 例陽性樣本，通過比對與第0 天發(fā)光強度比值，評估試劑的機載穩(wěn)定性。

1.2.1.3 交叉反應(yīng)試驗 收集臨床病癥與手足口病相似或者病原結(jié)構(gòu)與腸道病毒相近的其他病原體，如：弓形蟲IgM（Tox IgM）、甲流IgM（FluA IgM）、乙流IgM（FluB IgM）、人類副流感病毒IgM（HPIVs IgM）、風(fēng)疹病毒IgM（RV IgM）、嗜肺軍團菌IgM（LP IgM）、巨細(xì)胞病毒IgM（CMV IgM）、單純皰疹病毒I 型IgM（HSV-I IgM）、單純皰疹病毒Ⅱ型IgM（HSV-ⅡIgM）、合胞病毒IgM（RSV IgM）、肺炎支原體IgM（MP IgM）、肺炎衣原體IgM（CP IgM）、EB 病毒IgM（EBv IgM）的高濃度特異性抗體血清樣本，使用CA16 IgM CMIA 和EV71 IgM CMIA 進(jìn)行檢測。

1.2.1.4 方法學(xué)比對 選擇經(jīng)柯薩奇病毒A16 型IgM 抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）檢測為CA16 IgM 陽性的樣本153 例，以及438 例CA16 IgM 為陰性的健康體檢人群樣本，用CA16 IgM CMIA 進(jìn)行檢測，獲得相應(yīng)樣本檢測的相對發(fā)光值（Relative luminous value，RLU）。對陽性樣本和陰性樣本檢測RLU 值進(jìn)行ROC 曲線分析，并計算與已上市酶免試劑的符合率。

選擇經(jīng)腸道病毒71 型IgM 抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）檢測為EV71 IgM 陽性的樣本154例以及500 例EV71 IgM 為陰性的健康體檢人群樣本，用EV71 IgM CMIA 進(jìn)行檢測，獲得相應(yīng)樣本檢測的RLU。對陽性樣本和陰性樣本檢測RLU值進(jìn)行ROC 曲線分析，并計算與已上市酶免試劑的符合率。

1.2.2 統(tǒng)計學(xué)方法

采用WPS Office Excel 及Prism8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析；計數(shù)資料以n或%表示；對樣本檢測RLU用Prism8 進(jìn)行ROC 曲線繪制。

2 結(jié)果

2.1 試劑精密度

CA16 IgM CMIA 測定重復(fù)性參考品的批內(nèi)精密度CV 分別為1.10%和1.63%，檢測強、中、弱陽樣本和陰性樣本的中間精密度CV 為5.70%～7.20%；EV71 IgM CMIA 測定重復(fù)性參考品的批內(nèi)精密度CV 分別為2.80%和1.59%，檢測強、中、弱陽樣本和陰性樣本的中間精密度CV 為2.91%～4.49%。見表1、表2。

表1 批內(nèi)精密度實驗結(jié)果（n=10）Table 1 Test results of intra-assay precision（n=10）

表2 中間精密度實驗結(jié)果（n=40）Table 2 Test results of intermediate precision（n=40）

2.2 試劑機載穩(wěn)定性

試劑機載穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示，CA16 IgM CMIA 和EV71 IgM CMIA 的偏差均小于±10%。見表3。

表3 CA16 IgM CMIA 和EV71 IgM CMIA 機載穩(wěn)定性評價（偏差）Table 3 On-board stability evaluation of CA16 IgM CMIA and EV71 IgM CMIA（deviation）

2.3 交叉反應(yīng)試驗

Tox IgM、FluA IgM、FluB IgM、HPIVs IgM、RV IgM、LP IgM、CMV IgM、HSV-I IgM、HSV-II IgM、RSV IgM、MP IgM、CP IgM、EBv IgM 的高濃度特異性抗體血清樣本不會影響CA16 IgM CMIA和EV71 IgM CMIA 的檢測結(jié)果，不存在交叉反應(yīng)。見表4。

表4 高濃度的其它病原體抗體血清交叉反應(yīng)結(jié)果Table 4 Results of cross reaction with high concentration antibody serum of other pathogens

2.4 方法學(xué)比對

以柯薩奇病毒A16 IgM 型檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）判定結(jié)果，用CA16 IgM CMIA 對陽性樣本和陰性樣本檢測RLU 值進(jìn)行ROC 曲線分析，結(jié)果顯示，陽性符合率為96.1%，陰性符合率為96.6%。見表5。ROC 曲線下面積為0.9908，以RLU為243907 作為Cut-off 值，特異性為96.60%，靈敏度為96.08%。見圖1a。

表5 CA16 IgM CMIA 陰陽符合率Table 5 Positive and negative coincidence rate of CA16 IgM CMIA

以腸道病毒71 型IgM 抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）判定結(jié)果，用EV71 IgM CMIA 對陽性樣本和陰性樣本檢測RLU 值進(jìn)行ROC 曲線分析，結(jié)果顯示，陽性符合率為100%，陰性符合率為98.5%。見表6。ROC 曲線下面積為0.9993，以RLU 為79533 作為Cut-off 值，特異性為100.00%，靈敏度為98.53%。見圖1。

表6 EV71 IgM CMIA 陰陽符合率Table 6 Positive and negative coincidence rate of EV71 IgM CMIA

圖1 CA16 IgM CMIA 和EV71 IgM CMIA ROC 曲線Figure 1 Receiver operating characteristic curve of CA16 IgM CMIA and EV71 IgM CMIA

3 討論

腸道病毒的早期診斷對后期疾病的防治工作意義重大。盡早明確患者感染類型對于手足口病的診斷分型進(jìn)而采取最佳預(yù)防措施至關(guān)重要，其可有效地控制手足口病的傳播及暴發(fā)［9］。目前，主要的診斷方式有RNA 檢測［10］及IgM 抗體檢測［9］。相較于價格昂貴，操作復(fù)雜的RNA 檢測，IgM 抗體檢測價格低廉，操作簡單，具有廣泛的應(yīng)用價值。目前，腸道病毒EV71 IgM 抗體和CA16 IgM 抗體的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），膠體金免疫層析法（Gold immunochromatographic assay，GICA）和化學(xué)發(fā)光法（Chemiluminescence immunoassay，CLIA）［7，11-13］。其中，化學(xué)發(fā)光法檢測操作簡單，檢測效率高，特異性強、靈敏度好，有助于提高臨床檢測效率。除此之外，由于手足口病的與大多流感、肺炎以及其他病毒引起的腦膜炎（如單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB 病毒等）病癥接近，從而導(dǎo)致誤診的情況，因此，高特異性無交叉反應(yīng)的檢測試劑尤為重要，它可有效避免誤診導(dǎo)致的治療延后，提高診治效益。

通過EV71 IgM 和CA16 IgM 的聯(lián)合檢測有助于手足口病致病原的明確，對于手足口病患兒的及時、合理治療、預(yù)后改善有重要的指導(dǎo)意義。本研究基于磁微粒化學(xué)發(fā)光法的柯薩奇病毒A16 型IgM 抗體檢測試劑盒和腸道病毒71 型IgM 抗體檢測試劑盒具有良好性能，適應(yīng)于臨床診斷應(yīng)用，將為手足口病的診斷及監(jiān)控治療提供切實支撐。